具体实施方式

本发明人已经开发了一种用于检测和/或计数鼠李糖发酵李斯特菌属的新方法，所述新方法具有高灵敏度并且至少与现有方法一样准确，所述方法更快地执行并且具有的检测限低于现行的ISO方法。所述方法可以在大样本或汇集样本中(例如食物样本，例如鲑鱼或鸡肉，)以及在表面拭子样本中检测和计数极少量的鼠李糖发酵李斯特菌属，例如单核细胞增生李斯特菌和英诺克李斯特菌。

本文件的方法的原理是将可能包含李斯特菌的样本接种在培养(生长)用培养基中，所述培养基对鼠李糖发酵李斯特菌属，例如单核细胞增生李斯特菌和英诺克李斯特菌有选择性。这两种细菌都能够将鼠李糖发酵成有机酸，这降低了培养基的pH。由于培养基中存在pH值指示剂(例如酚红)导致培养物颜色变化，而检测到反应。培养物颜色变化足以检测李斯特菌属，仅限于单核细胞增生李斯特菌和英诺克李斯特菌。然后可以进行确认研究以区分单核细胞增生李斯特菌和英诺克李斯特菌，例如通过在对单核细胞增生李斯特菌具有选择性的ALOA培养基上生长细菌。培养基还包含LiCl，所述LiCl允许针对取决于样本类型选择的李斯特菌和抗生素的选择压力，并且已知此类样本中存在不是李斯特菌的细菌。

因此，本文件公开了一种用于检测样本中的鼠李糖发酵李斯特菌属，例如单核细胞增生李斯特菌的方法，所述方法包括或由以下步骤组成：

i)在第一培养基中制备可能含有李斯特菌的样本的悬浮液，所述第一培养基包含鼠李糖、一种或多种抗生素、pH颜色指示剂和LiCl；

ii)在允许李斯特菌生长的条件下孵育所述悬浮液；以及

iii)鉴定阳性样本(即含有李斯特菌属的样本)。

如果需要对样本中的鼠李糖发酵李斯特菌属的数量进行定量分析，则上述方法包括附加步骤ia)将步骤i)中获得的悬浮液转移到多孔托盘中，以及步骤iv)例如通过使用最可能数方法计算所述样本中所述李斯特菌属的浓度。因此，一种用于检测和计数样本中的李斯特菌的方法包括或由以下步骤组成：

i)在第一培养基中制备可能含有李斯特菌的样本的悬浮液，所述第一培养基包含鼠李糖、一种或多种抗生素、pH颜色指示剂和LiCl；

ia)将步骤i)中获得的悬浮液转移到多孔盘中；

ii)在允许李斯特菌生长的条件下孵育所述悬浮液；

iii)鉴定阳性样本(即含有李斯特菌属的样本)；以及

iv)例如通过使用最可能数方法计算所述样本中的所述李斯特菌的浓度。

为了证实在上述方法中鉴定的阳性样本中(即在含有鼠李糖发酵李斯特菌属的样本中)存在单核细胞增生李斯特菌，所述方法包括该确认作为在定性方法中的步骤ii)之后和在定性方法中的步骤iv)之后执行的进一步步骤。确认步骤可以例如通过将阳性样本铺板在ALOA培养基上，通过使用分子方法，例如PCR或原位杂交、ELISA、VITEC和/或API来进行。

ISO 11290-1和ISO 11290-2方法中基本上使用了相同的方法步骤，但啊顺序不同，并且不同步骤中使用的培养基的组成也不同，这允许在本方法的同一步骤中集成ISO方法的多于一个步骤，这导致本文件的方法的选择性与ISO方法的选择性非常相似。然而，与ISO参考方法相比，本文件的方法在分析的第一步骤中构建了更高的选择性，这继而导致更少的推定阳性样本和更快速地鉴定对李斯特菌，例如单核细胞增生李斯特菌为阳性的样本。

使用本文件的方法，可以1cfu/样本的检测限，即1cfu/125g的检测限定量分析多达125克的样本，并在1cfu/25克直至约2000cfu/g的浓度范围内准确计数。在ISO 11290-1和11290-2方法中，样本量在定性方法中限制为最大25g，并且在定量方法中限制为最大10g。此外，ISO方法中的检测限为10cfu/g，除非方法经修改以获得更浓缩的样本。本文件的方法的选择性和特异性与当今使用的参考ISO方法(ISO 11290-1和11290-2)相同，这意味着本文件的方法中假阴性和假阳性的数量与参考方法中一样。

本文件的方法适用于分析食物(例如鲑鱼和鸡肉)和用于从生产设施的表面收集材料的拭子。此外，该方法的益处是可以在生产设施中进行取样和计数，而确认和进一步表征，例如全基因组测序，可以在外部实验室进行。

本文件的方法的另一个优点是取样和样本制备可由非专业人士进行，从而确保食品生产商或审核员可以自己负责这部分。阴性样本可以在当地进行评定，而推定的阳性样本可送到实验室进行确认。

本文公开的方法可定性和定量地使用(通过添加如本文其他地方所述的两个方法步骤)，并且可用于汇集的样本，使得一次单一分析可用于测试是否符合EU法规2073/2005中的标准。由于假阳性的过度增长，汇集样本通常更可能给出假阴性，但是如果定量地使用本文件的方法，则情况并非如此。在这种情况下，溶液分布在许多孔中，这导致单核细胞增生李斯特菌和假阳性不太可能在同一个腔室中，就像一次分析整个溶液一样。因此，例如本文所述的步骤ia)和iv)的步骤的存在是显著的益处，因为它允许减少假阳性的数量。

即使样本在运送到实验室期间已经暴露于滥用温度条件，本文件的方法也确保了正确的计数。这是可能的，因为样本制备和计数的开始可以与取样一起进行。这很重要，因为在设施中取样和在外部实验室进行样本制备之间的滥用温度条件通常会导致高估食物中李斯特菌的浓度，并因此导致不必要的浪费、召回和错误决策。

与其他快速李斯特菌检测方法，如InSite李斯特菌测试(Hyginia)Watford UK)和Path-Chek Hygiene李斯特菌测试(Microgen Bioproducts Ltd.，Camberley，UK)相比，使用根据本文件的方法时假阴性频率较低(C.T.Schirmer，Solveig Langsrud，TrondTherese Hagtvedt，Even Heir，2012.Performance of two commercial rapidmethods for sampling and detection of Listeria in small-scale cheeseproducing and salmon processing environments.Journal of MicrobiologicalMethods，第91卷，第2期，第295-300页，ISSN 0167-7012，https：//doi.org/10.1016/j.mimet.2012.08.013.)

ISO方法在立法中作为标准给出，并且新方法需要在特异性和与方法验证相关的其他特性方面与这些方法相媲美。对于分析方法的用户来说，所述方法需要是成本有效的并快速递送结果。如果结果将影响对装运、召回、额外清洁等的决策，则这一点尤为重要。因此，需要一种满足这些标准并具有相关选择性和灵敏度的替代方法。

ISO方法由几个步骤组成。第一步骤是在培养液中将样本匀浆化，然后在培养液中培养(定性)或在具有专门生长培养基的琼脂平板上培养(定量方法)。多年来，这些生长培养基已经经过几个步骤的开发和优化，以获得

·恢复经胁迫的细胞以避免假阴性。

·通过去除也可在培养基上生长的细菌并覆盖琼脂平板上的李斯特菌来提高选择性。

ISO方法中的生长培养基适用于低至10cfu/g的计数，并且非常适用于可以使用开放式系统(如琼脂平板)的实验室设施。在需要较低浓度且必须使用封闭式分析系统的工业中，情况并非如此。使用MPN(最可能数)方法在培养液中进行计数是可能的，但需要一种读取阳性孔与阴性孔之间差异的方式。ISO方法中用于选择性富集的培养液不允许这样做。出于此原因，如果应使用采用MPN方法的低水平计数，则需要其他生长培养基。

尽管ISO方法中的第一步骤中的生长培养基适用于检测和计数低至10cfu/g的单核细胞增生李斯特菌，但仍需要确认推定阳性菌落。在确认步骤之一中，使用鼠李糖培养液，因为单核细胞增生李斯特菌能够发酵鼠李糖并产生酸，所述酸可以作为pH指示剂的颜色变化来检测。在ISO方法中，鼠李糖培养液中没有选择压力(其首先在ISO方法的后期使用)，因为只有与食物中的细菌不同，已经经调整以在孵育温度下生长的分离物的单菌落才能用这种方法测试。因此培养液不需要刺激胁迫恢复。

在本文件的方法(“SensiList”方法)中，使用改良版本的鼠李糖培养液作为主要生长培养基，并与MPN方法组合，以允许计数低至0.2cfu/g的浓度。为了获得这一点，鼠李糖培养液以反复步骤经设计和调整以获得：

·单核细胞增生李斯特菌的选择性(避免假阳性和假阴性细菌)

·检测限适用于0.2-100cfu/g食物材料范围内的定量

·细菌的胁迫恢复

·阳性和阴性结果之间的明显差异

·该系统需要闭合以确保生物安全性。

·培养基的价格使该方法成本有效。

可以利用鼠李糖的细菌比李斯特菌多。这些细菌不应该能够生长，至少不会生长到将在方法中给出假阳性信号的浓度。因此，已经向在本文件的方法的初始富集步骤中使用的鼠李糖培养液中添加了在ISO方法中的初始生长培养基中使用的抗生素和其他选择压力组分如LiCl。

选择第一培养基中使用的抗生素(antibioticum/antibiotics)以减少或避免来自其他鼠李糖发酵细菌的假阳性结果。因此，不同样本类型之间使用的特定抗生素可能不同。可以在数据库和商业食物样本中搜索可给出假阳性结果的微生物。因此，技术人员可以容易地使所用抗生素适用于理论上存在于该特定样本类型中的鼠李糖发酵细菌。因此，第一培养基中使用的抗生素专门适用于样本类型和可能存在于此类样本类型中的任何发酵鼠李糖的非李斯特菌。

本文件中的“SensiList”培养液的配方中给出的抗生素列表专门适用于鱼类样本。

受胁迫细胞的恢复涉及细胞需要有足够的营养和良好的条件，以使其新陈代谢适应生长模式。李斯特菌属能够在非生长模式下在亚致死条件下存活，但是这种模式不能用于检测细菌。因此，在培养基中引起选择压力的组分已被调谐到用于回收和选择性的条件之间的最佳状态。此外，已经向培养液中添加了低浓度的丰富培养基组分，如肉提取物，以便为胁迫恢复供应营养。这对于几乎不含有机物质的样本(如生产设备和水的拭子样本)尤其重要。

本文件的方法的检测原理是将鼠李糖发酵成酸，这改变了pH指示剂的颜色。为了获得足够高的酸产量，细菌需要使用鼠李糖作为营养和能量来源，这继而涉及培养液中的其他有机物质(包括样本)的量必须低，否则细菌会以此作为营养和能量来源。此外，鼠李糖的量必须足够高以允许产生足够的细菌和酸。培养液已经过优化和测试以平衡这些方面。已经发现，鼠李糖的量和鼠李糖的浓度以及最终产生的酸的浓度对于单核细胞增生李斯特菌的检测都是至关重要的。该方法已经经过优化，以确保正确检测所有样本，甚至是来自富水地区的拭子样本。

本文件的方法大体上基于与ISO方法(ISO 11290-1和11290-2)相同的原理，但是方法步骤的次序不同并且对培养基进行了修改。通过执行这些修改，令人惊讶地发现可以增加样本量，与此同时仍然保持甚至增加方法的灵敏度，从而允许与ISO方法相比在样本中检测到数量较少的细菌。此外，从取样到获得结果的时间大大减少。

本文件的方法在使用的步骤、不同步骤中使用的培养基以及步骤的次序方面与ISO方法不同。下面的表1和表2列出了ISO方法与本文件的方法之间的一些异同(单核细胞增生李斯特菌缩写为L.mono)。

表1

表2

为了区分单核细胞增生李斯特菌和英诺克李斯特菌以及可能由其他鼠李糖发酵细菌引起的其他假阳性，阳性样本(即如果酚红用作pH指示剂，则为黄色和橙色孔)可以铺板在ALOA培养基上，并且具有特征区域的菌落指示单核细胞增生李斯特菌的阳性结果。

本文件的方法比ISO方法更快；如果使用经典确认测试，则去后后需要至多两天来获得阴性样本，并且需要三天才能获得确认结果。使用PCR确认只需要几个小时。为了进行比较，ISO计数方法(即ISO 11290-2)中的第一步骤是将样本的连续稀释铺板到选择性生长培养基中，并且第二步骤是对鼠李糖进行确认。该方法需要至多5次ISO检测方法(ISO11290-1，检测水平1cfu/25g)，具有以下步骤：将样本在选择性培养液中培养两天，然后在选择性琼脂上铺板，此后在实验室收到样本后需要一周时间才能确认。此外，由于可以使用更大的样本量，例如可以在一个试剂盒中使用10个样本的集合，每个样本各10克。这也导致了食物供应商的较低分析成本。

培养基

使用三种方法使本文件的方法的步骤i)-iii)中使用的第一培养基(其示例是本文中所谓的“SensiList培养液”)对单核细胞增生李斯特菌和英诺克李斯特菌具有选择性。

鼠李糖在第一培养基中用作碳源和能源。只有少数细菌可以利用鼠李糖，例如单核细胞增生李斯特菌和英诺克李斯特菌。威尔斯李斯特菌也可发酵鼠李糖，但是与英诺克李斯特菌和单核细胞增生李斯特菌相比它是一种非常罕见的李斯特菌属，即使这种细菌会在含有鼠李糖的培养基中生长，本文件的方法的特异性也被认为足够高，至少与目前可用的方法一样高。

在本文件的方法中，鼠李糖的选择性已经在本文件的方法中富集细菌的第一步骤(步骤ii)中使用。

鼠李糖以至少5g/l、例如约5-17g/l、例如约7-13g/l、例如约5g/l、约6g/l、约7g/l、约8g/l、约9g/l、约10g/l、约11g/l、约12g/l、约13g/l、约14g/l、约15g/l、约16g/l或约17g/l，通常约10g/l的浓度存在于第一培养基中。分析级鼠李糖是一种昂贵的组分，并且由于与ISO方法相比，本文件的方法中所需的鼠李糖培养液的体积较高，因此鼠李糖的价格不仅对检测至关重要，而且对试剂盒的价格也很重要。因此，已经测试了显著更便宜的食品级鼠李糖在本方法中的使用，并且发现这种质量的鼠李糖给出了与分析级相同的结果，从而降低了执行该方法的价格。

氯化锂(LiCl)也加入到第一培养基中。该组分已被证明增加李斯特菌选择性富集培养基中的选择压力(包括在弗雷泽培养液和ALOA平板中，所述弗雷泽培养液和ALOA平板分别用作选择性富集培养液和诊断琼脂平板培养基，在例如ISO方法中)。氯化锂以至少约5g/l、例如约5-17g/l、例如约7-13g/l、例如约5g/l、约6g/l、约7g/l、约8g/l、约9g/l、约10g/l、约11g/l、约12g/l、约13g/l、约14g/l、约15g/l、约16g/l或约17g/l，通常约10g/l的量存在。

如本文别处所解释的，添加抗生素以最小化其他革兰氏阳性菌的生长。适用于本文件的方法中的抗生素包括萘啶酸、头孢他啶、硫酸多粘菌素B、放线菌酮、两性霉素B中的一种或多种。优选地，使用任何所述抗生素中的所述抗生素中的两种或更多种抗生素的组合，例如三种、四种、甚至更优选地，所有五种组合使用。抗生素通常以其正常浓度使用，例如如下面的SensiList培养液配方中所指定的。抗生素的需求取决于待分析样本所需的选择压力。此外，如果将在所述第一培养基中使用的抗生素与具有类似作用模式的其他抗生素交换，则预期具有相同的特异性。

通过使用上述三种方法，实现了使除单核细胞增生李斯特菌和英诺克李斯特菌(以及样本中可能存在的其他鼠李糖发酵细菌)以外的细菌生长最小化的选择压力。为了能够区分单核细胞增生李斯特菌和英诺克李斯特菌和其他鼠李糖发酵细菌，需要进一步确认，例如在诊断琼脂(例如ALOA琼脂)上铺板，对特定的单核细胞增生李斯特菌基因执行聚合酶链式反应或原位杂交分析，或通过使用例如ELISA、VITEC、API的方法和/或执行MaldiToff测试。

此外，第一培养基可包含有机碳源和能源以启动阶段的快速生长和胁迫恢复。可以添加氯化钠以获得优选的细菌渗透条件。

第一培养基还含有pH指示剂。发酵是降低pH值的过程。因此，当样本中存在能够发酵鼠李糖的细菌时，这些细菌将发酵第一培养基中存在的鼠李糖，这将降低培养基的pH。通过在第一培养基中包含pH指示剂来检测pH的这种变化。因此，在第一培养基中孵育样本期间的培养物颜色变化表明样本中存在鼠李糖发酵李斯特菌属，例如单核细胞增生李斯特菌和英诺克李斯特菌。用于本文件的方法的合适pH指示剂是酚红，当样本中存在李斯特菌时，所述酚红将颜色从红色变为黄色，但是也可以使用在与酚红相似的pH下变色的任何其他pH指示剂。

第一培养基可用作现成产品，或由单一组分制备。酚红培养液和鼠李糖可以通过在121℃下高压灭菌来进行灭菌。对抗生素进行无菌过滤并在高压灭菌后加入。

可以以不同方式制备第一培养基，例如：

-将所有组分混合到即用型培养基中(如果使用高压灭菌对培养基进行灭菌，则这在添加抗生素之前进行(所述抗生素通常经过过滤灭菌)

-制备鼠李糖和酚红培养液基础作为一种溶液，以及在使用前不久但在高压灭菌后加入抗生素。抗生素通常不如生长培养基中的其他组分稳定，因此延迟添加是一种延长培养基的保质期和最小化假阳性概率的方式。

-可以配制具有鼠李糖和酚红培养液的浓缩培养基(例如5-15x浓度，如10x浓缩的)，并在使用前用水稀释。由于培养基的焦糖化反应，这需要对培养基进行无菌过滤而不是高压灭菌。

第一培养基优选为液体。

在所有情况下，培养液都可以直接放入试剂盒中，或者单独放入大体积的烧瓶或袋子中。

第一培养基包含或由以下物质组成：

a)浓度为约5-15g/l，例如约7-13g/l，例如约10g/l的鼠李糖；

b)一种或多种抗生素，例如萘啶酸、头孢他啶、硫酸多粘菌素B、放线菌酮、两性霉素B，优选地这些抗生素中的至少两种抗生素；

c)pH颜色指示剂，例如酚红；以及

d)浓度为约5g/l至约15g/l，例如约7g/l至约13g/1，例如约10g/l的LiCl。

下面给出了提供良好选择压力的第一培养基的一个示例。这种培养基在本文中表示为“SensiList培养液”：

SensiList培养液配方：

1％鼠李糖培养基的制备：

15g酚红培养液基础

10g鼠李糖

10g LiCl

1000ml蒸馏水

将组分溶解在蒸馏水中。在118℃下灭菌15分钟。加入抗生素前先冷却。

制备抗生素：

10mg/ml萘啶酸

200 000IE/ml多粘菌素B

2mg/ml两性霉素B

2mg/ml头孢他啶

将抗生素溶解在蒸馏水中至指定浓度。通过无菌过滤灭菌。

完成SensiList培养液：

1L1％鼠李糖培养基

2ml萘啶酸(10mg/ml)

0.3835ml多粘菌素B(200.000IE/ml)

5ml两性霉素B(2mg/ml)

4ml头孢他啶(2mg/ml)

将抗生素添加到1％鼠李糖稀释液中。搅拌均匀。

pH：7.4±0.2

SensiList培养液对于鱼类样本中李斯特菌的检测和计数特别有用。

由于鼠李糖和LiCl两者(与抗生素组合)的存在，在本文件的方法中的第一培养步骤ii)中获得的对李斯特菌的选择压力高于定量和定性ISO方法中对李斯特菌的选择压力，所述定量和定性ISO方法使用两个培养步骤来达到相同的结果。

为了确认在本文件的方法中的步骤iii)中被鉴定为对鼠李糖发酵李斯特菌属呈阳性的样本中单核细胞增生李斯特菌的存在/不存在，阳性样本可以铺板在第二生长培养基，例如ALOA培养基上，这使得单核细胞增生李斯特菌与英诺克李斯特菌的区别在于前者形成清晰的沉淀区而后者没有。ALOA培养基含有针对磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C特异性纯化的底物，这允许区分单核细胞增生李斯特氏菌和英诺克李斯特菌，因为前者在代谢底物时在菌落周围形成不透明的晕圈。ALOA培养基优选为固体培养基，例如琼脂培养基。

样本和样本制备

样本可以是用于检查李斯特菌(例如单核细胞增生李斯特菌)的存在或不存在的任何样本。样本可以是例如食物样本、环境样本、或粪便样本。

食物样本可以是例如生食物样本或加工的肉、家禽或鱼产品的样本，例如鲑鱼、蔬菜或即食食物产品的样本。环境样本可以是水样本(例如来自放液罐、解冻罐、洗涤水、海水)、污垢样本或食物工业环境样本，例如表面拭子样本或设备表面样本。

食物产品样本，通常大小为10-125克，可以以1∶1的比率添加到例如缓冲蛋白胨水(BPW)或生理盐水中，并在转移到第一培养基之前在匀质器袋中用手或在匀质器中均质化，例如均质化样本与培养基的比率为1∶10。或者，样本可以直接在第一培养基中均质化。

环境拭子样本，例如可能含有李斯特菌的布(干燥的或添加了缓冲液)可以直接添加到第一培养基中，并在孵育期间留在那里。程序在其他方面与针对食物样本不同。

水样本，例如工艺用水，包括洗涤水、冷却水、渗出水等，可以添加到第一培养基中。如对于食物产品样本，可以使用浓缩的第一培养基以降低检测水平，与此同时限制培养箱中的体积以及由此空间。例如，可以将11ml的10x浓缩的第一培养基添加到100ml水样本中，以获得1cfu/100ml的检测限。推定阳性样本的孵育和检测工序与针对食物样本的相同。

用于检测和/或计数的方法

如上所述，对于所有不同种类的样本，本文公开的方法可以根据其中包括的步骤而定性或定量地执行。

检测样本中的鼠李糖发酵李斯特菌属，例如单核细胞增生李斯特菌的方法(即定性方法)，包括或由以下步骤组成：

iv)在第一培养基中制备可能含有李斯特菌的样本的悬浮液，所述第一培养基包含鼠李糖、一种或多种抗生素、pH颜色指示剂和LiCl；

v)在允许李斯特菌生长的条件下孵育所述悬浮液；以及

vi)鉴定阳性样本。

如上所述，该方法还可包括对鼠李糖发酵李斯特菌属进行计数，其中所述方法包括步骤ia)将步骤i)中制备的悬浮液转移到多孔托盘中，以及在步骤iii)之后执行的步骤iv)例如通过使用最可能数方法计算所述样本中所述李斯特菌的浓度。

对鼠李糖发酵李斯特菌属，例如单核细胞增生李斯特菌的数量进行计数的方法(即定量方法)包括或由以下步骤组成：

i)在第一培养基中制备可能含有李斯特菌的样本的悬浮液，所述第一培养基包含鼠李糖、一种或多种抗生素、pH颜色指示剂和LiCl；

ia)将步骤i)中获得的悬浮液转移到多孔盘中；

ii)在允许李斯特菌生长的条件下孵育所述悬浮液；

iii)鉴定阳性样本；以及

iv)例如通过使用最可能数方法计算所述样本中的所述李斯特菌的浓度。

本文件的方法还可包括通过将单核细胞增生李斯特菌与其他李斯特菌物种区分开来确认单核细胞增生李斯特菌存在的步骤，例如通过将步骤iii)中鉴定出的阳性样本铺板在第二生长培养基例如ALOA培养基上，通过利用分子方法，例如通过聚合酶链式反应或原位杂交、ELISA、VITEC或API。该步骤在定性方法的步骤iii)和定量方法的步骤iv)之后执行。

对于样本中李斯特菌的存在的定性分析和定量分析两者，该方法中的第一步骤是在第一培养基中制备可能含有李斯特菌的样本的悬浮液，如本文别处所述。

样本通常在约37℃的温度下孵育，即使也可以使用例如介于25℃与38℃之间的温度，例如约30℃的温度，并且在1天和2天后观察培养物的颜色。当酚红用作pH指示剂时，颜色的变化，例如从红色变为黄色或橙色，表示推定的阳性样本。颜色可以这样读取，或者通过与比色表进行比较来找到颜色代码。

如果要执行定性方法，则孵育可能含有鼠李糖发酵李斯特菌属的样本的悬浮液以观察在第一培养基中孵育样本(即可能含有鼠李糖发酵李斯特菌属的样本在第一培养基中的悬浮液)期间是否存在颜色变化就足够了。如果观察到颜色变化，则样本中存在鼠李糖发酵李斯特菌属，例如单核细胞增生李斯特菌或英诺克李斯特菌，并且因此样本对鼠李糖发酵李斯特菌属呈阳性。如果没有观察到颜色变化，则样本中不存在鼠李糖发酵李斯特菌属，即样本对李斯特菌呈阴性。

对于要执行以对原始样本中的鼠李糖发酵李斯特菌属的浓度进行计数的方法，将可能含有鼠李糖发酵李斯特菌属的样本在第一培养基中的悬浮液转移到多孔托盘(平板)，例如定量托盘，例如来自IDEXX的Quanti-Tray 2000中。在例如上述的条件下孵育期间，由于第一培养基中存在pH指示剂，所以含有鼠李糖发酵李斯特菌属的孔会改变颜色。然后可以使用MPN(最可能数)方法估计原始样本中的鼠李糖发酵李斯特菌属的最有可能的浓度。例如，如果使用定量托盘来估计样本中鼠李糖发酵李斯特菌属的浓度，并且可能含有鼠李糖发酵李斯特菌属的样本的悬浮液的总体积为100ml，并且样本量为5g，则检测限将是1cfu/5g样本，这对应于0.2cfu/g样本的平均浓度。如果鼠李糖发酵李斯特菌属的浓度较高，例如100cfu/g，则含有5克样本的100ml溶液中将有500个细菌。这对应于5cfu/ml。那么很可能定量托盘中的大多数1ml孔会变黄，而最多50％的0.1ml孔会变黄。使用双倍浓度的鼠李糖发酵李斯特菌属，+0.1ml孔中的最多100％将变黄。高于此浓度，所有孔将均呈黄色，并且达到有效计数的上限。使用96个1ml孔和96个0.1ml孔获得的计数的最小极限和最大极限将在1cfu/5克(即0.2cfu/g)至200cfu/克的范围内。如果应用样本与第一培养基之间的另一比率，则可以调整检测限。

本文件的方法使得可以检测和计数大样本或汇集样本中极低水平的单核细胞增生李斯特菌和鼠李糖发酵李斯特菌属。样本量可高达100克，并且检测水平低至5cfu/100g食物，即1cfu/20g食物。由于样本量很大，因此可以在一个试剂盒中使用例如10个样本的集合，每个样本10克。这也导致了食物供应商的较低分析成本。此外，允许大样本或汇集的样本的更大可能样本量，是克服由于食物产品中李斯特菌分布不均导致的问题的重要因素。

用本文件的方法执行的分析可以在生产设施中执行，因为该系统可以制成封闭的，使得富集的李斯特菌阳性样本不能将细菌泄漏回生产设施或处理样本的人员。关闭系统意味着在将样本添加到第一培养基之后，无论该方法是定量的还是定性的，容器(例如烧瓶、袋子、烧杯、多托盘等)被密封，使得可能在培养基中生长的细菌不与空气、处理样本的人或接触样本的表面接触。样本制备，如均质化和切割，可以在封闭系统内完成。不需要气体交换，因为李斯特菌可以在没有氧气的情况下生长。关闭系统可以例如通过例如用盖子或塑料膜，例如以仅允许用特定工具打开系统的方式等密封样本来实现。然而，必须在分类为李斯特菌分析的实验室中进行对推定阳性样本中单核细胞增生李斯特菌的存在的确认，因为装有培养液的容器需要打开。

可以将各种样本运送到实验室以确认/测试单核细胞增生李斯特菌的存在。如果样本是推定的阳性样本，即在第一培养基中孵育样本后颜色已经变成黄色，则运输期间中应保持较低的温度以保持细菌。在样本在已经放入第一培养基后不久就被送出的情况下，则不需要冷却，因为运输期间的生长会缩短样本到达实验室后的检测时间。

有几种方法可用于确认单核细胞增生李斯特氏菌：

-在ALOA琼脂上形成区域。单核细胞增生李斯特菌形成区域，而英诺克李斯特菌没有。

-用于检测单核细胞增生李斯特菌的PCR分析。实际上，该测试可以在样本变黄之前执行，因为在获得阳性PCR反应之前达到的细胞数量如此之高以至于pH低于颜色变为黄色的水平。

-特定单核细胞增生李斯特菌基因的原位杂交分析，

-任何其他鉴定方法，例如ELISA、VITEC、API、MaldiToff测试和全基因组测序。

从上面可以明显看出，本文件的方法允许在1到2天内获得定性方法和定量方法两者的推定阳性和阴性结果，并在最多一天后确认阳性结果，而不是ISO方法的5或7天(分别用于定量方法和定性方法)。此外，本方法的优点在于它不必在实验室中执行，而是可以在例如采集样本的地点进行，例如在工业本身中执行。

试剂盒

本文件还涉及用于检测样本中的李斯特菌，例如单核细胞增生李斯特菌的试剂盒，所述试剂盒包括：

a)容器，所述容器包含培养基，所述培养基包含或由鼠李糖、一种或多种抗生素、pH颜色指示剂和LiCl组成；

b)容器或多孔托盘，所述容器或多孔托盘用于培养可能含有李斯特菌的样本；

c)任选的用于鉴定阳性样本的比色表；以及

d)任选的使用说明。

试剂盒中培养基的成分的浓度如本文别处针对第一培养基所公开的。第一培养基优选地是液体，但是它也可以是固体。

计算机实现的计算器

本文件还涉及一种计算机实现的计算器，所述计算机实现的计算器用于基于对样本中的菌落形成单位的检测和计数来显示对李斯特菌例如单核细胞增生李斯特菌的生长的预测，所述计算器包括：

a)输入设备，例如键盘或麦克风；

a)输出设备，例如显示器、电脑或移动电话屏幕或扬声器；

b)可下载或存储器中的软件，例如智能手机或网页上的应用程序；

使用输入设备，菌落形成单位的数量被设置为在样本中发现的任何数量，在0.04cfu/g至10cfu/g的范围内，尤其是在0.04cfu/g至1cfu/g的范围内。现有技术不允许在低范围内提供此类细节。

计算器可以输入参数，例如样本的pH值或样本类型，例如生鲑鱼、生鱼、寿司、鸡肉或牛肉。此外，还有诸如生产、商店和家用冰箱中的温度和存储时间以及室温和室外冷藏小时数的参数的输入。基于输入，计算器将根据存储的模型计算，然后用图表或数字显示各种预测，例如最高生长的天数、最可能的生长、最不可能的生长，并绘制这些对比法定极限、暴露消费者的可能疾病极限和健康成人的可能疾病极限的曲线。

计算器可以实现为每种食物类型的单个应用程序，或者为用户提供不同选择的集成计算器。

本发明将在以下实施例中进一步描述，这些实施例不限制权利要求书中描述的本发明的范围。

实验部分

实验部分

1实施例1：SensiList培养液的开发和测试

1.1 Sensilist培养液

下面将培养基中的内容物称为上述“Sensilist培养液”。

1.2 Sensilist培养液的灵敏度

SensiList培养液的选择性和灵敏度的第一项研究是使用直接从生产公司采集的鲑鱼样本执行的。将鲑鱼片用0cfu/g、2cfu/g、20cfu/g或200cfu/g的单核细胞增生李斯特菌接种。作为接种物，使用单个菌株或5个菌株的混合物。将样本立即使用，或冷冻保存直至使用。

在这些研究中调谐了SensiList培养液中的LiCl和鼠李糖的浓度。

使用SensiList方法和ISO方法两者分析样本以比较结果。对ISO方法进行调整，以允许以两种方式降低检测水平。首先，通过使用五倍多的平板来铺板更大体积的样本悬浮液。这种方法在日常工作中是不可行的，但在这里应用是为了验证本文方法的灵敏度。其次，如ISO方法中所述，在接种到琼脂培养基上之前，通过添加较少的稀释剂来使用5x浓度的样本悬浮液。

使用本文件的方法进行分析：如下所述制备鲑鱼样本(产品样本)并置于SensiList培养液中。对于定性样本(存在/不存在)，将样本和培养液置于100ml或500ml烧瓶中。为了使用MPN(最可能数)方法进行计数，将含有样本的培养液放入无菌玻璃管(1-10ml)或来自IDEEXX的具有49个大孔和24个小孔，总体积为100ml的Quantitray 2000中。如下所述孵育培养液，并在一天和两天后观察培养液的颜色。通过使用无菌针将液滴转移到ALOA平板上，进一步分析所有孔。具有典型区域的蓝绿色菌落推定为对单核细胞增生李斯特菌呈阳性，无区域的蓝绿色菌落推定为对英诺克李斯特菌呈阳性。其他颜色的菌落是阴性的。根据ISO 11290-1，用革兰氏染色和过氧化氢酶确认蓝绿色菌落。

用接种了2cfu/g、20cfu/g或200cfu/g单核细胞增生李斯特菌的鲑鱼，一式三份地重复研究约10次。在一些实验中，将一个李斯特菌阳性样本(立方体，约2×2×2cm)与9个相同大小的阴性样本放在一起，并以不同的形式堆叠，如图2所示。目的是研究是否在以下三个取样工序中检测到了阳性样本：i)分析堆叠中的所有样本，ii)在用培养液振荡样本然后孵育所述培养液之后分析培养液，以及iii)分析从鱼释放的水。

1.3 SensiList培养液的选择性

通过两种方式搜索假阳性和假阴性细菌：

1.选择在李斯特菌诊断中和试剂盒测试中用作阳性和阴性对照菌株的菌株。

2.来自不同供应商的鲑鱼是从奥斯陆地区的商店购买的，并在不含抗生素和LiCl的SensiList培养液中培养，以允许所有能够利用鼠李糖的细菌生长。将孵育期间培养液颜色从红色变为黄色的试管铺板在血琼脂和ALOA琼脂上，并分离细菌。将分离物用于后续实验中，以1)在SensiList培养液中配制抗生素组合物和2)测试培养液的稳定性。

1.4使用PCR确认推定的阳性样本

使用以下这些方法测试使用PCR的确认：

使用血液和组织试剂盒(Qiagen)从生长培养基培养液中培养的单核细胞增生李斯特菌(VI 58361菌株，血清型1/2a)中提取DNA。使用这些生长培养基：SensiList培养液、不含LiCl和抗生素的SensiList培养液、无抗生素的SensiList培养液。此外，还包括半弗雷泽培养基和缓冲蛋白胨水作为对照。将单核细胞增生李斯特菌菌落从琼脂平板转移到不同的培养液中。使用试剂盒根据来自供应商的工序提取DNA，并使用Nanodrop(来自ThermoFischer的用于测量DNA浓度的分光光度计)测量DNA浓度。

使用用于DNA提取和PCR的BioRad iQ-单核细胞增生李斯特菌II试剂盒，使用qPCR(定量PCR)根据以下遗传标记物分析分离的DNA：ORF2819、ORF2110、lmo1118、lmo0737、plcA和prs。

1.5 SensiList培养液的稳定性

SensiList培养液的不同制剂的稳定性检查如下：

以足够大的量制备SensiList培养液的四种制剂，以在一年的存储期间执行多次分析。所使用的制剂是不含LiCl和抗生素的SensiList培养液、含有LiCl但不含抗生素的培养液、在使用前立即添加抗生素的培养液和全培养液。用每种制剂的三个独立批次重复实验。

使用单核细胞增生李斯特菌(8个菌株)、其他李斯特菌属(2个菌株)和其他可能给出假阳性结果的细菌的组中的单个菌株执行实验。后一种菌株是基于自己对鲑鱼的实验(见上文)、用于测试ISO方法的菌株以及在其他单核细胞增生李斯特菌试剂盒中给出假阳性结果的菌株进行选择的。下面更详细地描述了所述菌株。

A.单核细胞增生李斯特菌菌株：

a.2个菌株用于在ISO方法中测试ALOA培养基。

i.单核细胞增生李斯特菌血清型4b VI 60847(WDCM00021/ATCC 13932)

ii.单核细胞增生李斯特菌血清型1/2a，VI 51285(WDCM00109/CCUG 15527)

B.在使用SensiList培养液的实验中使用的单核细胞增生李斯特菌菌株：

a.VI 51503

b.VI 58363(00EB250LM)

c.VI 58365(00EB254LM)

d.VI 59994

e.VI 59998

f.VI 58366

C.英诺克李斯特菌：用于在ISO方法中测试ALOA培养基。

a.VI 51284(WDCM00017/CCUG 15531)

D.伊氏李斯特菌：用于在ISO方法中测试ALOA培养基。

a.VI 51040(ATCC 19119)

E.其他菌株：

a.用于测试ALOA：

i.粪肠球菌(VI 52179)。

ii.大肠杆菌VI 51656(WDCM00013/CCUG 17620)

b.白色假丝酵母VI06652(ATCC10231)

F.在早期版本的SensiList中，当未施加抗生素时，来自鲑鱼的18种菌株会产生假阳性结果

a.5种蜂房哈夫尼菌：VI 54910、VI 54914、VI 54918、VI 54924、VI 54927

b.5种柠檬酸杆菌属：VI 54915、VI 54916、VI 54928、VI 54931、VI 54940

c.2种气单胞菌属：VI 54922、VI 54926

d.2种阴沟肠杆菌：VI 54935、VI 54941

e.1种粪产碱杆菌：VI 54929

f.1种粪肠球菌：VI 54946

g.1种蜡样芽孢杆菌：VI 54948

h.1种不确定的鉴定，可能是巨型球菌：VI 54952

G.2种在其他试剂盒中给出假阳性的菌株

a.麦芽香肉杆菌：VI 61406

b.铅黄肠球菌：VI 61407

H.能够发酵鼠李糖的菌株：

a.鼠李糖乳杆菌：VI 60846

培养单核细胞增生李斯特菌菌株并在7℃下冷适应7天，以使它们适应食物样本的代表性胁迫条件。将其他可能给出假阳性样本的菌株在37℃下培养过夜并转移到BHI培养基中。施加不同的温度以准备最坏情况的情境：应给予单核细胞增生李斯特菌菌株实际胁迫以检测假阴性结果，而应给予假阳性菌株在孵育期间在培养液中生长的最佳选项。

将SensiList培养液(0.9ml)的制剂接种(0.1ml)在96孔盒(类型)中。将该混合物在托盘中分8步稀释十倍，导致每个菌株一个柱，如下面的托盘1所示。每个培养基制剂需要三个托盘来测试所有菌株。在37℃孵育前将盒子盖上，并在孵育1天和2天后观察颜色变化。

表3：在96孔板(每块板中12列和8行)中稳定性测试中使用的菌株的分布。每列包含1个稀释10倍的菌株。A行包含第一10倍稀释的菌株，B行包含第二10倍稀释的菌株，依此类推。顶部的5个字母数字是每个菌株的标识。

1.6用本文件的方法处理样本以供分析

1.6.1食物产品样本

将10-125克样本以1∶1的比率添加到缓冲蛋白胨水(BPW)中，并用手或在袋子中或在匀质器中均质化。将10ml均质化的溶液加入90ml的SensiList培养液中。将整个样本在37℃下孵育，并在1天和2天后观察颜色。溶液从红色变为黄色表示推定的阳性样本。颜色可以这样读取，或者通过与比色表进行比较来找到颜色代码。例如，可以使用来自www.gioco.no颜色Y50R的比色表指示阳性结果。

如果按上述方法制备，则测试溶液含有5克产品。包括整个溶液，这导致检测水平为1cfu/5克。如果需要另一个检测水平，则可以通过应用样本与培养液之间的另一比率来获得这个检测水平。下面给出了一些实施例。如果需要大样本，例如5*25克样本的汇集样本，以满足在5个样本中测量的在25克中不存在微生物的标准，可以通过添加作为浓缩溶液的培养液来限制总体积。例如，6倍浓度的125克样本+125ml BPW+50ml SensiList培养液将总体积限制为300ml。这是足够高的液体级分以观察颜色变化，但在定量分析中一些食物将需要更高的稀释系数。

表4.考虑到所需检测水平的不同培养液与样本比率的实施例。

1.6.2来自生产环境样本的拭子

拭子是各种类型的布，经过干燥或添加缓冲液的，可以直接添加到SensiList培养液中，并在孵育期间留在容器中。工序在其他方面与针对食物产品的不同。

1.6.3水样本

工艺用水，包括洗涤水、冷却水、渗出水等，可以添加到SensiList培养液中。如对于产品样本，可以使用浓缩的培养液以降低检测水平，与此同时限制培养箱中的体积以及由此空间。例如，可以将100ml水样本中加入11ml的10x SensiList培养液，以获得1cfu/100ml的检测限。推定阳性样本的孵育和检测工序与针对食物样本的相同。

1.6.4计数方法-定量分析

所有类别的样本都可以定性或定量地执行。为了计数样本中李斯特菌的浓度，将上述SensiList培养液溶液的液体级分转移到例如定量盘中，其中培养液在96个小孔和大孔中分离。如果整个体积(100ml)包含1个李斯特菌，所述孔中的一个孔会变成黄色，而其他孔会保持红色。可以使用MPN方法估计最可能的浓度。在100ml溶液含有5克样本的情况下，检测限将为1cfu/5g样本，这对应于0.2cfu/g样本的平均浓度。如果李斯特菌的浓度很高，例如100cfu/g，则含有5克样本的100ml溶液中将有500个细菌。这对应于5cfu/ml。然后很可能所有1ml孔都变黄，而最多50％的0.1ml孔变黄。使用双倍浓度的李斯特菌，多达100％的+0.1ml孔会变黄。高于此浓度，所有孔将均呈黄色，并且达到有效计数的上限。使用96个1ml孔和96个0.1ml孔获得的计数的最小极限和最大极限将在1cfu/5克至200cfu/克的范围内。

可以通过使用样本与SensiList培养液之间的另一比率来调谐检测限。

1.7用人工和自然污染的样本测试本文件的方法

1.7.1案例1：人工和自然污染的鲑鱼

使用SensiList方法和改进的ISO方法分析接种样本的释放的解冻水。工序如上所述，并且研究目的在结果章节中。

1.7.2案例2：污染的热处理鸡肉

将样本用低浓度的单核细胞增生李斯特菌接种，并根据上述食物样本方案进行分析。

1.7.3案例3：自然污染的肉和奶产品，来自几种动物物种的加工的产品

根据上述食物样本方案分析样本。

1.7.4案例4：用于测试清洁后的生产表面的拭子

根据针对上述环境样本的方案对样本进行接种和分析。

1.7.5案例5：生产公司中的测试

将烧瓶中的SensiList培养液送到鲑鱼屠宰和切柳设施。还提供了简短的说明注意和彩色地图。该公司按照正常工序采集样本，将样本添加到SensiList培养液中，并在37℃下孵育所述培养液。在孵育后，公司拍下照片并将照片发给我们，以便讨论结果。他们还将样本送到当地实验室进行确认。

1.8结果

1.9方法的开发

1.9.1方法的准确度和灵敏度-检测水平

对于200cfu/g和20cfu/g的浓度，接种浓度、用本文件的方法计数的浓度和用ISO方法计数的浓度之间存在良好的相关性。对于2cfu/g的鲑鱼，仅使用本文件的方法检测到了单核细胞增生李斯特菌。这符合预期，因为当根据标准工序执行时，ISO方法的检测水平为10cfu/g。对于所有浓度，均确认了推定阳性浓度。

进一步测试该方法的灵敏度，以研究是否需要对整条鲑鱼偏进行均质化，或者用SensiList培养液振荡样本是否足够。将一份阳性样本与9份阴性样本混合，以获得非常低浓度的单核细胞增生李斯特菌(0.2-20cfu/g)的准确接种水平。培养液中的理论浓度为10倍低，因为样本和培养液以1∶2.5比率混合。结果在图3中示出。

用本文件的方法检测所有接种的样本，即使是最低浓度的单核细胞增生李斯特菌。ISO方法仅检测最高浓度(20cfu/g)。在将培养液培养过夜后，用ISO方法分析检测到所有样本的浓度为2cfu/g或更高，但三个样本中只有一个浓度为0.2cfu/g，即使单核细胞增生李斯特菌是在将鲑鱼片与培养液一起振荡后使立即用本文件的方法检测的。这一观察结果的最可能解释是只有小体积(0.1-1.0ml溶液)是采用ISO方法铺平板的，而整个培养液则是采用本文件的方法分析的。

1.9.2假阳性和假阴性细菌

使用李斯特菌菌株和鲑鱼样本的不同混合物执行如上所述的类似实验，但采用ISO方法的改编版本以获得该方法的更高灵敏度(参见材料和方法)。在所有情况下，方法之间存在良好的相关性，但在这里，也发现本文件的方法是最灵敏的方法。然而，在含有英诺克李斯特菌的样本中，无论是单独的还是与单核细胞增生李斯特菌的混合物，与ISO方法相比，本文件的方法给出的推定阳性的浓度高于确认的阳性的浓度。这是因为英诺克李斯特菌也能够发酵鼠李糖，并且对抗生素和LiCl具有与单核细胞增生李斯特菌相似的耐受性。因此需要确认步骤将单核细胞增生李斯特菌与英诺克李斯特菌分开。

菌株1-18是从鱼类熟食店购买的鲑鱼中获得的假阳性。用Malditoff技术将菌株鉴定为蜂房哈夫尼菌、柠檬酸杆菌属、气单胞菌属、阴沟肠杆菌、粪产碱杆菌、粪肠球菌、蜡样芽孢杆菌和巨型球菌(后者不确定)。菌株19-24是单核细胞增生李斯特菌。结论是所测试的抗生素足以避免假阳性结果。

1.9.3 SensiList培养液的稳定性

将测试菌株在不同的SensiList培养液制剂中培养达一年的时段。所有菌株在新鲜培养液和使用前存储了约一年的培养液中的SensiList培养液孵育48小时后的结果如下。正如预期的那样，所有单核细胞增生李斯特菌(托盘A的第1-7列和托盘C的第8列)菌株和英诺克李斯特菌(托盘A，第8列)菌株在所有制剂上都给出了阳性结果。然而，其他菌株仅在不含LiCl和/或不含抗生素的制剂中给出了假阳性结果。所有含有抗生素的制剂，无论是在使用前立即添加抗生素，还是抗生素已经在培养液中存在了一年，所有三个批次都获得了正确的结果，表明全培养液是稳定且精确的。结果如图4所示。

1.9.4推定阳性结果的确认

在使用SensiList培养液的所有实验中，铺板在ALOA上和ISO方法中描述的确认测试都产生了正确的结果。

用PCR技术确认也确实给出了正确的结果。用于DNA分离的市售试剂盒在所有测试案例中都提供了足够量和质量的DNA以执行PCR分析。所应用的qPCR方法与用于确定基因血清群的方法相同，也称为分子血清群。下表中列出了以下菌株之一的结果。对于SensiList培养液的所有制剂，相同的基因给出了正确的信号。阴性信号(标记为0)是阴性的，因为测试菌株是血清组IIa。

可以使用任何其他检测单核细胞增生李斯特菌的PCR方法，但是选择这种方法是因为它可以鉴定单核细胞增生李斯特菌和血清群两者。血清群的测试通常在单独的分析中执行。在这里，通过将其用作确认步骤，已在样本的初步分析中获得了确认和充分表征以检查与爆发的联系或与其他分离物的相似性。

表5

2实施例2：证明本文件的方法用于检测食物样本中的李斯特菌的可用性

2.1案例1：人工和自然污染的鲑鱼

上述研究是用鲑鱼执行的。结果在所有案例中都很好。

此外，还对冷冻和解冻的鲑鱼片执行了研究。使用ISO(ALOA)方法和本文件的方法对释放的解冻水进行取样。应用两种不同的单核细胞增生李斯特菌混合物，以2cfu/g和20cfu/g的浓度接种。对于孵育，测试了两种温度。结果如下表5所示。在所有分析的样本中，ISO方法给出了6个阴性结果，而本文件的方法仅给出了接种样本中的1个阴性结果。针对最低接种水平观察到了所有差异。鱼的冷冻存储时间增加而计数降低似乎是由于冷冻存储期间活细菌的减少。

该实验的结论是，本文件的方法适用于检测和定量来自新鲜鲑鱼和冷冻鲑鱼的低浓度李斯特菌。

表6

2.2案例2：受污染的热处理鸡肉

将热处理鸡肉接种单核细胞增生李斯特菌，并用较低稀释系数的样本，使用本文件的方法和改进的ISO(ALOA)进行分析，从而导致检测水平为1cfu/g。目的是首先调查鸡肉是否干扰了SensiList培养液并给出了假阳性结果，其次，是否正确估计了浓度。结果给出如下。

本文件的方法在所有情况下都产生了正确的检测，而经修改后的ISO方法给出了假阴性结果。这很可能是由于本文件的方法的更高灵敏度。

结论是热处理鸡肉不会干扰本文件的方法。

此外，与经修改的ISO方法相比，本文件的方法提供了精确计数，使用定量托盘精确计数低至0.2cfu/g，精确检测低至1-3cfu/总样本，参见表6。

表7

2.3案例3：自然污染的肉和奶产品，来自几种动物物种的加工的产品

自然污染的食物样本是从针对欧洲食物中单核细胞增生李斯特菌的参考实验室获得的。将样本冷冻，并且李斯特菌可能在存储期间已经死亡。然而，样品首先用于测试食物基质对本文件的方法的干扰，其次用于测试对正常背景菌群的干扰，第三用于测试计数水平。

同样在这种情况下，使用经修改的ISO方法以获得足够低的检测水平，以便与本文件的方法进行比较。

结果如下表所示。

通常，经修改的ISO方法之间存在良好的相关性。本文件的方法比ISO方法在多一个样本(含鸡肉的面条)中检测到了单核细胞增生李斯特菌，这可能是由于更高的灵敏度。测量的浓度为0.4cfu/g。

没有观察到测试食品基质的干扰导致使用本文件的方法时的假阳性或假阴性结果。

所述样本中一个样本含有威尔斯李斯特菌。这在使用SensiList时和ALOA上给出了假阳性结果。结果表明在用于检测和计数李斯特菌的本发明方法和现有技术方法中都可获得假阳性结果。然而，与英诺克李斯特菌和单核细胞增生李斯特菌相比，威尔斯李斯特菌是一种非常罕见的李斯特菌属，并且本文件的方法的特异性也被认为足够高，至少与目前可用的方法一样高。

来自这项研究的结论是，本文件的方法对自然污染的样本产生了真实的结果。未观察到复杂食物基质的显著负面干扰。参见表7。

表8.

2.4案例4：用于测试清洁后的生产表面的拭子

来自生产设备表面的测试的拭子是从三个设施获得的。这种拭子供应有中和溶液。执行该测试是为了研究材料、中和溶液或来自清洁溶液的残留物是否会干扰本文件的方法，例如通过引入生长抑制化合物或增加缓冲容量，这两者都会导致可能的假阴性结果。

将从这些公司获得的样本接种0cfu/拭子、15cfu/拭子或1500cfu/拭子的单核细胞增生李斯特氏菌。将拭子置于SensiList培养液中，并且将溶液转移到定量盘中并如上所述进行孵育。

没有一个未接种的拭子给出推定的阳性结果。对于接种了15cfu单核细胞增生李斯特菌的拭子，96个孔中有4-9个变黄并被证实为单核细胞增生李斯特菌阳性。对于接种1500cfu的拭子，58-96个孔变黄。在少数情况下，一些孔从红色变为橙色，但没有变为黄色。颜色变化低于针对推定阳性结果合格的颜色变化。

来自该研究的结论是，本文件的方法得到了生产环境取样用拭子中单核细胞增生李斯特氏菌的正确检测结果，并且计数是充分的。

2.5案例5.鲑鱼生产公司中生产样本的测试

一家鲑鱼加工公司从“sluk”中抽取了工艺用水和棉塞的样本，并将所述样本插入SensiList培养液中。将样本在该公司中孵育，并送到当地实验室进行确认。第一次培养后的结果如图4所示。

根据该公司，颜色变化的取样和读取是容易的。样本的确认表明黄色烧瓶含有英诺克李斯特菌，而红色烧瓶不含李斯特菌属。

水和“sluk”/排水样本是用吸水物(填塞物)采集的。这些都没有造成任何干扰。

鲑鱼样本每份100g。

如图5所示的该研究的结论是SensiList对用于公司而言足够用户友好。推定的阳性结果与实验室的结果相符。

实施例3：食品级鼠李糖与分析级鼠李糖的比较

鼠李糖是一种稀有的碳水化合物，并且相对昂贵。由于根据本文件的第一培养基使用该组分并且具有大体积，所以该组分将对方法/试剂盒的价格产生很大影响。为了检查是否可以使用食品级鼠李糖代替分析级鼠李糖，制备了两个版本的SensiList培养液并进行了比较。比较是在两个大型试验中进行的：

1.使用具有相同菌株的单细胞培养物进行培养液的稳定性测试。应用定性方法。

2.使用来自两家鱼类屠宰和加工公司的自然污染和未受污染的样本。样本为水、湿拭子、干拭子和鱼肉。应用定性方法和定量方法两者。在SensiList培养液中培养后，使用以下三种琼脂培养基进行确认：血琼脂、快速单核细胞增生李斯特菌(Rapid L′mono)和ALOA进行确认。

结果

单一菌株的测试在所有情况下都正确鉴定了分析级鼠李糖和食品级鼠李糖。

对于来自鱼类生产设施的样本，样本之间具有良好的相关性，这意味着阳性结果和阴性结果对于食品级鼠李糖和分析级鼠李糖均为阳性的。然而，有一些偏差。这很可能是由于单核细胞增生李斯特菌的浓度非常低，即从未超过6cfu/总样本。在如此低的浓度下，如果将李斯特菌转移到两种培养液中的哪一种是随机的，这继而意味着只有含有李斯特菌的培养液才有可能给出阳性结果。

下面给出了来自一家公司的结果概述，样本是随时间推移采集的。十字表示负样本，而Pos表示检测到。所有浓度都非常低。ISO方法的先前修订版使用较少的稀释剂，从而获得2cfu/g的计数检测水平不足以检测这些样本中的李斯特菌。

来自公司的样本阳性样本：不超过3个阳性孔：指示＜6cfu/样本

表9该表是工业中使用的示例。最左侧列中的挪威语文本显示了生产线中的位置。顶行显示了样本的日期，其中“Pos”表示正样本。最右边的列有对测试的注释，例如“10个鱼片的拭子”、“肉样本”、“水”。

样本中的三个样本的结果在图6中给出。左边的框代表定性方法，其中可以检测到样本中的1个单核细胞增生李斯特菌，所述样本在这种情况下为20ml水。只有左边的样本是阳性的。使用定量方法分析相同的样本(右小图)。在这种情况下，将100m1样本(10ml水和90mlSensiList培养液)转移到定量盘中。只有一个孔的颜色从红色变为黄色，这意味着水中单核细胞增生李斯特菌的最可能浓度为1cfu/10ml。孵育24小时后获得结果。

SensiList方法(即本文件的方法)适用于所有样本，但需要考虑稀释比例，特别是对于非常湿的样本和对于鱼肉。一方面，这是由于SensiList培养液的稀释，因为pH与产生的酸的量有关，从而与鼠李糖的浓度有关。另一方面，高相对量的其他碳源和能源，如鱼肉，可能会导致细菌在这些上生长而不是在鼠李糖上生长，并且将不会产生足够量的酸。如果使用足够高比例的培养液，则这两个挑战都可以在SensiList培养液中轻松解决。

图7中给出了推定阳性样本的结果。两个孔是黄色的，一些是橙色的，大多数孔是红色的。将来自每个孔的材料转移到三种不同的生长培养基中以测试特异性。只有黄色孔在血琼脂上溶血，在ALOA琼脂上出现了单核细胞增生李斯特氏菌的典型区域。橙色和红色的孔要么没有生长，要么生长出不是单核细胞增生李斯特菌的细菌。因此，使用鼠李糖培养液的SensiList的灵敏度和选择性与之前使用分析级鼠李糖时发现的一样好。

应当理解的是，虽然已经结合其详细描述描述了本发明，但前述描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。

除非有相反的明确描述，否则本文所述的优选特征中的每个优选特征都可以与本文所述的其他优选特征中的任何和所有其他优选特征组合使用。

参考文献

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