一种地夸磷索四钠的含量及有关物质检测方法
阅读说明：本技术 一种地夸磷索四钠的含量及有关物质检测方法 (Method for detecting content of diquafosol tetrasodium and related substances ) 是由 刘小斌 胡俊 翟洪 于 2020-05-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种地夸磷索四钠的含量测定及有关物质检测方法,该方法主要采用高效液相色谱法对地夸磷索四钠原料药的含量,以及其有关物质进行了测定和检查。该方法省时省力,精密度高,含量测定结果准确,重复性和回收率良好,且该方法通过验证,可以用于地夸磷索四钠原料药和制剂样品的常规分析和质量控制。(The invention discloses a method for measuring the content of diquafosol tetrasodium and detecting related substances. The method is time-saving and labor-saving, has high precision, accurate content measurement result and good repeatability and recovery rate, and can be used for conventional analysis and quality control of the diquafosfomycin tetrasodium raw material medicine and preparation samples through verification.)
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体而言，涉及一种地夸磷索四钠原料药的质量控制方法，尤其涉及一种夸磷索四钠的含量测定及有关物质检测方法。
背景技术
地夸磷索四钠，英文名Diquafosol Tetrasodium，化学名为 [[(2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxopyrimidin-1-yl)-3,4-dihydroxy-oxolan-2-yl]methoxy-hy droxy-phosphoryl]oxy-[[[(2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxopyrimidin-1-yl)-3,4-dihydroxy-oxolan-2-yl]methoxy-hydroxy-phosphoryl]oxy-hydroxy-phosphoryl]oxy-phosphinicacid。3％地夸磷索四钠(diquafosol tetrasodium)滴眼液是参天和Inspire两制药公司联合开发的产品(商品名：Diquas)，用于治疗干眼病。2017年10月在国内进口上市。
干眼症又称角结膜干燥症(KCS)或眼干燥症，是指由于泪液的质和量的异常，引起泪膜不稳定和眼表面损害，从而导致眼不适的一类疾病。干眼病的一般症状是眼睛有干涩，灼痛感，眼屎较多；眼酸、眼痒、怕光和视力减退。其他症状还有头痛、烦燥、疲劳、注意力难以集中，严重时会发生角膜软化穿孔，在检查时可以看到有眼结膜充血。以下几大人群易患干眼症：
1.年龄超过65岁的人群中有75％患有干眼症。因为老年人泪液的产生随年龄的增加而减少。泪液分泌减少使眼睛易受刺激，有时会引起剧烈的流泪反应，即溢泪。
2.计算机使用者。长时间盯着荧光屏，缺乏正常的眨眼，而眨眼可使泪液更好地湿润眼睛。每天在电脑前工作3小时以上的人中，有90％以上的人眼睛有问题。
3.某些疾病因素。如类风湿性关节炎、糖尿病、甲状腺异常、哮喘、白内障、青光眼及红斑狼疮等。
4.药物因素。某些药物可使泪液分泌减少，导致干眼症状，如抗抑郁药、抗组胺药、利尿剂、降血压药、麻醉剂、抗溃疡药等。
5.戴隐形眼镜者。隐形眼镜是漂浮在泪液上，戴隐形眼镜会加速泪液的蒸发。戴隐形眼镜的不适感和耐受性差，主要是干眼引起的，尤其是软性隐形眼镜可很快将泪液蒸发，产生异物感，使蛋白质在镜片上沉淀。另一方面，干眼症又可使戴隐形眼镜的人的角膜抗损伤能力下降，使隐形眼镜更易刮伤角膜。
6.环境因素。烟雾、紫外线、空气污染、高温、空调和气候干燥，都可增加泪液的蒸发，导致干眼症。
7.绝经期、怀孕期、哺乳期及口服避孕药的妇女。因激素水平的改变可产生干眼症状。
8.长期使用某种眼药水。如血管收缩性眼药水，也很容易形成干眼症。
9.睑板腺功能障碍、泪小点阻塞。使泪液分泌和排出减少，导致干眼症。
地夸磷索四钠是全球获准上市的首个P2Y2受体激动剂滴眼液，以新作用机制治疗干眼病：通过促进水和黏蛋白分泌改善干眼病症状，使泪膜更接近正常状态。在日本的临床研究中，未发现严重的眼部和全身性不良反映。地夸磷索四钠用药的耐受性好，故可用于长期治疗干眼病症状。
目前，已上市的地夸磷索四钠剂型为滴眼液，然而由于数据保护等原因，该原料药的含量和有关物质分析方法尚无文献报道。为了保证地夸磷索四钠制剂研发和生产的质量，需要对原料药含量和有关物质进行控制。因此，研究获得一种地夸磷索四钠的含量测定及有关物质检测方法，这对医药生产企业来说显得尤为迫切。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明人通过大量实验摸索了地夸磷索四钠原料与制剂的质量控制方法，并严格进行方法验证，保证方法的科学严谨，满足了研发和生产的需要。因此，本发明的目的在于提供一种地夸磷索四钠的含量测定及其有关物质检测方法。
本发明的目的是这样实现的：
一种测定地夸磷索四钠含量的方法，其特征在于：采用反相高效液相色谱法，其流动相为乙腈；70-90mmol/L磷酸二氢钾溶液＝40:60(V/V)，并以磷酸调pH＝6-7。
上述测定夸磷索四钠含量的方法，优选流动相为乙腈：80mmol/L磷酸二氢钾溶液＝40:60(V/V)，并以磷酸调pH＝6.60。
上述测定夸磷索四钠含量的方法，优选色谱柱为C8，5μm，4.6×250mm (I.D.)；流速为1.0ml/min；柱温为40℃，检测波长为266nm。
一种测定地夸磷索四钠有关物质的方法，采用反相高效液相色谱法，按以下流动
相条件进行梯度洗脱：流动相A为70-90mmol/L磷酸二氢钾溶液，并以磷酸调pH＝6-7；流动
相B为乙腈或甲醇；流动相的梯度设置如下：
时间(min) 流动相A 流动相B 0 80 20 15 80 20 25 30 70 30 30 70 45 80 20 55 80 20
上述测定地夸磷索四钠有关物质的方法，优选流动相A为80mmol/L磷酸二氢钾溶液，并以磷酸调pH＝6.60；流动相B为乙腈。
上述检测地夸磷索四钠有关物质的方法，色谱柱为C8，5μm，4.6×250mm (I.D.)；流速为1.0ml/min；柱温为40℃，检测波长为266nm。
地夸磷索四钠原料药在干眼症的治疗上，有着重要的作用，但是原料药的含量和有关物质分析方法尚无文献报道。本发明涉及的夸磷索四钠的含量测定及有关物质检测方法省时省力，精密度高，含量测定结果准确，重复性和回收率良好，且该方法通过验证，可以用于地夸磷索四钠原料药和制剂样品的常规分析和质量控制。另外，经过严格的方法验证，可以满足研发和生产的需求，为地夸磷索四钠药物在国内的早日上市提供必要的技术支持。
附图说明
图1位实施例1地夸磷索四钠含量测定方法的系统适应性研究色谱图。
具体实施方式
以下通过实施例形式，对本发明涉及的地夸磷索四钠含量测定及有关物质检测方法作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1地夸磷索四钠含量的反相高效液相色谱法测定
色谱条件及系统适应性：以辛烷基硅胶为填充剂(AgilentSB-C8，5μm，4.6× 250mm)检测波长为266nm流速为1.0ml/min；柱温为40℃。流动相乙腈： 80mmol/L磷酸二氢钾溶液＝40:60(V/V)，并以磷酸调pH＝6.60，理论板数应不低于3000。
取地夸磷索四钠样品约30mg，精密称定，置于50ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液；另取地夸磷索四钠对照品适量，同法配制成地夸磷索四钠浓度约为0.6mg/ml，作为对照液，分别量取供试品及对照液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算并折干，即得。
对含量测定方法的以下项目进行了验证：
1、系统适应性
用地夸磷索四钠来分析此色谱条件是否符合要求。由图1可见此条件下各杂质与主峰分离度符合要求，峰纯度和单点阈值均符合要求。
2、标准曲线
配制各浓度梯度的供试品，分别精密量取100μl，注入色谱仪，记录色谱图。以浓度(mg/ml)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制回归曲线，计算回归系数。由结果可见，本品的含量测定于地夸磷索四钠浓度在10.0-90.0mg/ml的浓度范围内有良好线性。
3、重复性
取样品6份，分别精密测定，按高效液相色谱法含量测定方法进行测定，考察测定方法的重复性。由结果可见，本品含量测定高效液相色谱法的重复性良好。
4、回收率
取本品30mg共九份于50ml容量瓶中，标示为低、中、高三个浓度梯度，分别加入24mg、30mg、36mg的对照品各三份。照含量测定的高效液相色谱法测定，计算测得量和回收率。由结果可见，本品高效液相色谱法含量测定的回收率良好。
5、溶液稳定性
取本品(批号：DK-1)含量测定的供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、 24小时，考察本品
含量测定液相法的溶液稳定性。由结果可见，本品含量测定的高效液相色谱法溶液于24小
时内稳定。
时间 主峰峰面积 0 11967188 2 11967888 4 11966422 6 11965311 8 11961355 12 11967488 24 11967222 均值 11966125 RSD(％) 0.02
6、中间精密度
以重复性结果为中间精密度数据组1，另行试验结果为中间精密度数据组2和数据组3。考察本品含量测定高效液相色谱法中间精密度。由结果可见，本品含量测定高效液相色谱法的中间精密度良好。
实施例2地夸磷索四钠有关物质的反相高效液相色谱法测定色谱条件及系统适应
性：以辛烷基硅胶为填充剂(AgilentSB-C8，5μm，4.6×250mm)检测波长为266nm流速为
1.0ml/min；柱温为40℃。流动相A为80mmol/L磷酸二氢钾溶液，并以磷酸调pH＝6.60；流动
相B为乙腈；流动相的梯度设置如下：
时间(min) 流动相A 流动相B 0 80 20 15 80 20 25 30 70 30 30 70 45 80 20 55 80 20
对有关物质检测方法的以下项目进行了验证：
1、系统适应性
在上述确定的色谱条件下，再分别用地夸磷索四钠起始原料A(尿苷5’-磷酸钠盐)，地夸磷索四钠起始原料B(游离尿苷5’-磷酸)，中间体(尿苷5’-磷酸三正丁胺盐)的混合物来分析此色谱条件是否符合要求。由图谱2可见此条件下各杂质与主峰以及杂质之间的分离度符合要求，峰纯度和单点阈值均符合要求。
2、专属性
取本品适量，分别于各苛刻条件下进行破坏，考察破坏产物与主成分峰的分离情况。
酸破坏：取本品适量(约含地夸磷索四钠30mg)，置50ml量瓶中，加 4.0M的盐酸溶液2ml，在室温下放置6小时后，用4.0M的氢氧化钠溶液调节pH 至中性，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
碱破坏：取本品适量(约含地夸磷索四钠30mg)，置50ml量瓶中，加 4.0M的氢氧化钠2ml，在室温下放置6小时后，用4.0M的盐酸溶液调节pH至中性，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
氧化破坏：取本品适量(约含地夸磷索四钠30mg)，置50ml量瓶中，加 3％双氧水溶液2ml，在室温下放置6小时后，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
高温破坏：取本品适量(约含地夸磷索四钠30mg)，置坩埚中，置100℃烘箱中放置6小时后，转移至50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
光照破坏：取本品适量(约含地夸磷索四钠30mg)，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。在4500±500lx光照的环境下放置2天。
取各破坏条件下的样品，照有关物质的液相条件进样，记录色谱图，结果可见，本品与各破坏条件下生成的杂质峰均能与主成分分离良好。本品在各破坏条件下产生的杂质均在266nm附件有较大吸收。
3、起始原料、中间体的响应值及标准曲线
取本品合成起始原料A、起始原料B、中间体及地夸磷酸四钠分别配制成梯度浓度的供试液(1)、(2)、(3)、(4)(5)。分别吸取各供试液20μl，注入色谱仪，记录色谱图。以浓度(μg/ml)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制回归曲线，计算回归系数。由结果可见，本品与各步中间体在10.0-90.0μg/ml 的浓度范围内有良好线性。
起始原料A低浓度标准曲线
起始原料B低浓度标准曲线
中间体低浓度标准曲线
地夸磷酸四钠低浓度标准曲线
4、溶液稳定性
取本品有关物质测定的供试液，分别于0、2、4、6、8、12、24小时，考察本品有关物质检测测定液的溶液稳定性。由结果可见，本品含量测定的高效液相色谱法溶液于24小时内稳定。
5、耐用性
由于本品色色谱条件为梯度洗脱，并规定了相应色谱柱型号、柱温、波长，故我们将这些条件作相应的微调，考察色谱条件的耐用性。
由图可见，更换色谱柱型号，柱温变化在±5℃，波长±2nm范围内，各杂质分离均较好，耐用性均良好。
6、定量限和检测限
取本品对照品适量，精密称定，加水配制成地夸磷酸四钠溶液后，再精密量取供试液适量，逐级稀释，进样考察，结果显示本品定量限为6.11ng/ml，检测限为 3.01ng/ml。
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