去氢骆驼蓬碱在促进神经再生和修复神经损伤方面的应用
阅读说明：本技术 去氢骆驼蓬碱在促进神经再生和修复神经损伤方面的应用 (Application of harmine in promoting nerve regeneration and repairing nerve injury ) 是由 周炳 柳瑞璇 杨晓燕 于 2021-10-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了去氢骆驼蓬碱在制备促进神经再生和修复神经损伤药物方面的应用。本发明利用微流控系统在体外培养皮层神经元和DRG神经元,形成中枢神经系统和周围神经系统的神经轴突损伤后,采用去氢骆驼蓬碱进行治疗,发现去氢骆驼蓬碱可以显著促进皮层神经元和DRG神经元轴突的损伤后的再生,该发现为脊髓损伤和外周损伤等神经损伤患者的治疗提供了新的方向。(The invention discloses application of harmine in preparing a medicament for promoting nerve regeneration and repairing nerve injury. In the invention, the cortical neuron and the DRG neuron are cultured in vitro by utilizing the microfluidic system to form the nerve axon injury of the central nervous system and the peripheral nervous system, and then the harms are treated by using the harmine, so that the harmine can remarkably promote the regeneration of the damaged cortical neuron and the DRG neuron axon after discovery, and the discovery provides a new direction for the treatment of nerve injury patients such as spinal cord injury, peripheral injury and the like.)
技术领域
本发明属于医药领域，涉及一种去氢骆驼蓬碱在促进神经再生和修复神经损伤方面的应用，具体涉及一种去氢骆驼蓬碱在制备促进神经再生和修复神经损伤药物中的应用。
背景技术
神经损伤主要包括脊髓损伤和周围神经损伤，尤其是脊髓损伤会造成不可逆转的损伤。神经元的轴突通常具有超长结构，神经损伤导致受损部位的神经信号中断，影响神经系统的正常功能，致残率高。神经元是高度分化的细胞，本身不具有分裂再生能力，因此神经系统损伤再生领域一直致力于神经元轴突的再生研究。
外周神经系统的神经元轴突损伤后具有一定的再生能力，丧失的功能也往往能够部分恢复。但成年中枢神经系统神经元则不具有轴突再生能力，严重损伤通常会导致永久性的功能缺失。因此，神经损伤如何再生是目前迫切需要解决的主要难题，但是现阶段的临床实现神经轴突再生和功能恢复并不理想。因此，亟待开发一种可以促进神经损伤后轴突再生的药物，这对于神经损伤的治疗具有重大意义。
发明内容
针对上述现有技术中的不足，本发提出了一种去氢骆驼蓬碱或其药学上可接受的盐、酯及其衍生物在促进神经再生和修复神经损伤方面的应用，具体技术方案如下：
本发明的实施例提出一种去氢骆驼蓬碱在制备促进神经再生和修复神经损伤药物中的应用。
本发明的实施例还提供一种去氢骆驼蓬碱的盐、酯或衍生物在制备促进神经再生和修复神经损伤药物中的应用。
优选的，所述神经再生和神经损伤为神经元轴突再生和神经元轴突损伤。
优选的，所述神经元轴突损伤为中枢神经元的轴突损伤。
优选的，所述神经元轴突损伤为周围神经元轴突损伤。
优选的，所述的去氢骆驼蓬碱(Harmine)，CAS No.442-51-3，结构式如式I所示：
相比于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明独创性地发现去氢骆驼蓬碱可以促进中枢神经元的突起生长，还可以促进中枢神经元和周围神经元损伤后的轴突再生长。因此，采用去氢骆驼蓬碱制备的药物可通过促进DRG神经元轴突再生长参与周围神经损伤修复，以及促进皮层神经元轴突再生长参与中枢神经损伤修复，为神经损伤类疾病的治疗提供新了的靶点。
附图说明
通过参考附图可更好地理解本发明。图中的构件不应视作按比例绘制，重点应放在示出本发明的原理上。
图1为本发明的实施例1中所用微流控体系神经元培养和损伤后轴突再生示意图；
图2为本发明的实施例1中去氢骆驼蓬碱促进了皮层神经元的突起生长；
图3为本发明的实施例2中去氢骆驼蓬碱促进了损伤后的皮层神经元轴突再生；
图4为本发明的实施例3中去氢骆驼蓬碱促进了损伤后的DRG神经元轴突再生。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。
下述实施例中所使用的去氢骆驼蓬碱为去氢骆驼蓬碱的DMSO溶液。
1.皮层神经元的体外培养方法
(1)细胞接种前，在超净台中将无菌的直径25mm圆玻片放入35mm的培养皿中，并加入2ml多聚-D-赖氨酸氢溴酸盐(l00μg/ml，Sigma-Aldrich)和层粘连蛋白(Roche)混合物在37℃、5％CO2细胞培养箱中进行包被2h。
(2)解剖：分离出生后小于12h的SD大鼠幼鼠大脑，在显微镜下用弯镊将脑膜剥离出来，用弯曲钳从大脑中取出皮层神经组织，将组织剪碎并置于15ml离心管中。
(3)消化：向所述15ml离心管中加入5ml加入HBSS(Gibco)溶解的木瓜蛋白酶(Worthington)，将所述离心管中的沉淀细胞轻轻吹打、混匀；然后，将离心管在37℃、5％CO2培养箱中水平放置40min，接着用5ml移液管吹打细胞液10-15次，最后将离心管中经离心机在300rpm转速下离心5min；
(4)制备神经元细胞悬液：取出消化液，用5ml 1:1溶液重新悬浮细胞，将较大的组织块静置5min，然后将悬浮液经离心机在300rpm转速下离心10min，离心后弃去上清，加入神经元基础培养基((Neurobasal-A Medium、B27 Supplement、GlutaMAX Supplement、胎牛血清及青霉素-链霉素)重悬，得到原代神经元细胞悬浮液；
(5)接种皮层神经元：取10μl吹打混匀的皮层神经元细胞悬液进行细胞计数，按3万每培养皿的数量接种在微流控装置中，加入皮层神经元基础培养基，并置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养7天。
2.DRG神经元的体外培养方法
(1)细胞接种前，在超净台中将无菌的直径25mm圆玻片放入35mm的培养皿中，加入2ml多聚-D-赖氨酸氢溴酸盐(l00μg/ml，Sigma-Aldrich)和层粘连蛋白(Roche)混合物溶液，在37℃、5％CO2细胞培养箱中进行包被2h。
(2)取材：待P8的SD大鼠麻醉后，用剪刀将整个脊椎取出，从中间中线剪开暴露出脊髓。接着将脊髓剥离后，用弯镊取出DRG，将中枢和外周端的轴突剪去。
(3)消化：放入分散酶(Yeasen)和胶原酶(Worthington)溶液中，放入37℃、5％CO2细胞培养箱消化30min。
(4)制备神经元细胞悬液：将消化后的DRG轻轻吹打均匀，放置10min将大块组织沉淀，接着将细胞悬浮液移入1.5ml中，经离心机在300rpm转速下离心3min。离心后弃去上清，将DRG神经元基础培养基(Neurobasal Medium、B27 Supplement、GlutaMAX Supplement以及青霉素-链霉素)重悬，得到DRG神经元细胞悬浮液。
(5)接种DRG神经元：取10μl吹打混匀的DRG神经元细胞悬液进行细胞计数，按3万/孔的数量接种在微流控装置中，加入DRG神经元基础培养基，并置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养7天。
3.建立皮层神经元损伤模型
微流控装置将皮层神经元的胞体和轴突两侧分离，培养7天的皮层神经元的轴突沿着微流控装置的微孔道生长到对侧腔室中。借助真空吸取将轴突切断，加入去氢骆驼蓬碱或基础培养基继续培养48h。
4.建立DRG神经元损伤模型
微流控装置将DRG神经元的胞体和轴突两侧分离，培养7天的DRG神经元的轴突沿着微流控装置的微孔道生长到对侧腔室中。借助真空吸取将轴突切断。
实施例1：去氢骆驼蓬碱促进皮层神经元突起生长
将皮层神经元细胞悬液培养在微流控装置和圆玻片组成的微流控体系中。该体系由SU-8硅片母版光蚀刻处理形成微流孔道，经PDMS材料浇筑(SYLGARD 184硅酮胶与催化剂按10:1比例混合(THINKY混合液ARF-310处理混合和脱泡两步)，Bel-Art真空脱泡及80度烘干2小时制备，其效果如图1所示。应用该系统(Microfluidic chamber)，可有效分隔神经元胞体(somachamber)与轴突远端(axonterminalchamber)。利用真空泵进行轴突切断后，对再生神经元轴突染色(βIII-Tubulin，红色)，可与原有神经元轴突良好区分和定量分析。应用此系统，可进行神经再生的通量药物筛选和线粒体等重要细胞器功能研究，其发现重要靶点一为本发明所述去氢骆驼蓬碱。
实验将神经元置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养2天。于体外培养2天后，在皮层神经元中加入去氢骆驼蓬碱，置入培养箱后继续培养48h。用4％的PFA(Sigma-Aldrich)进行固定皮层神经元，用Anti-βIII Tubulin mAb(Promega，1:500)一抗和荧光二抗488(1:1000)对神经元特异性免疫荧光染色，发现用去氢骆驼蓬碱处理的皮层神经元，显著增强了皮层神经元的突起生长。与对照组相比，基线水平下，去氢骆驼蓬碱处理的皮层神经元突起增加了1.3倍(如图2所示)，同时，去氢骆驼蓬碱处理神经元后的细胞密度没有显著性差异。结果表明，去氢骆驼蓬碱在不损害神经元存活的情况下能够促进中枢神经元的突起生长。
实施例2：去氢骆驼蓬碱促进损伤后的皮层神经元轴突再生
将皮层神经元细胞悬液培养在微流控装置和圆玻片组成的微流控体系中，并置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。借助真空泵将体外培养7天的皮层神经元轴突切断后，加入去氢骆驼蓬碱继续培养48h。用4％的PFA(Sigma-Aldrich)进行固定皮层神经元，用Anti-βIII Tubulin mAb(Promega，1:500)一抗和荧光二抗488(Life Technologies，1:1000)或二抗555(1:1000)分胞体侧和轴突侧，对神经元特异性免疫荧光染色，用去氢骆驼蓬碱处理损伤后的皮层神经元，发现去氢骆驼蓬碱显著增强了皮层神经元的轴突再生。与对照组相比，再生条件下，去氢骆驼蓬碱处理损伤后皮层神经元轴突增加了3倍(如图3所示)。结果表明，去氢骆驼蓬碱能够促进损伤的中枢神经元的轴突再生。
实施例3：去氢骆驼蓬碱促进损伤的DRG神经元轴突再生
将DRG神经元细胞悬液培养在微流控装置和圆玻片组成的微流控体系中，并置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。借助真空泵将体外培养7天的DRG神经元轴突切断后，加入去氢骆驼蓬碱继续培养48h。用4％的PFA(Sigma-Aldrich)进行固定DRG神经元，用Anti-βIII Tubulin mAb(Promega，1:500)一抗和荧光二抗488(Life Technologies，1:1000)对神经元的特异性免疫荧光染色，用去氢骆驼蓬碱处理损伤后的DRG神经元，发现去氢骆驼蓬碱显著增强了DRG神经元的轴突再生。与对照组相比，去氢骆驼蓬碱处理损伤后的DRG神经元轴突增加了1.35倍(如图3所示)。结果表明，去氢骆驼蓬碱能够促进损伤的周围神经元的轴突再生。
应理解，前述仅说明了一些实施方式，可进行改变、修改、增加和/或变化而不偏离所公开的实施方式的范围和实质，该实施方式是示意性的而不是限制性的。此外，所说明的实施方式涉及当前考虑为最实用和最优选的实施方式，其应理解为实施方式不应限于所公开的实施方式，相反地，旨在覆盖包括在该实施方式的实质和范围内的不同的修改和等同设置。此外，上述说明的多种实施方式可与其它实施方式共同应用，如，一个实施方式的方面可与另一个实施方式的方面结合而实现再另一个实施方式。另外，任何给定组件的各独立特征或构件可构成另外的实施方式。
以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。
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