具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明涉及格兰地新或/和其可药用盐在制备预防或/和治疗脑血管疾病的药物中的应用。

本发明提供了一种格兰地新和/或其可药用盐的新用途，主要是将格兰地新和/或其可药用盐用于制备预防或者治疗脑血管疾病药物。本发明基于构建的细胞模型，验证了格兰地新和/或其可药用盐能够保护脑神经元，有效避免神经元数量和/或活力降低，以及保护神经元功能学形态免受损伤，这说明，格兰地新和/或其可药用盐能够用来有效防治脑血管疾病。

优选地，所述脑血管疾病为脑神经元损伤所致脑血管疾病。

优选地，所述脑神经元的功能学形态受损。

优选地，所述脑神经元的树突数量降低。

优选地，所述脑神经元的树突长度降低。

优选地，所述脑神经元的数量减低或/和活力降低。

优选地，所述损伤为脑缺氧所致损伤。

优选地，所述损伤为脑缺血所致损伤。

优选地，所述损伤为脑血栓所致损伤。

优选地，所述脑神经元为脑皮层神经元。

优选地，所述可药用盐为格兰地新的水溶性盐。

优选地，所述格兰地新的水溶性盐为格兰地新的硫酸盐、格兰地新的硬脂酸盐、格兰地新的月硅酸盐、或者格兰地新的盐酸盐。

进一步优选地，所述格兰地新的水溶性盐为格兰地新的盐酸盐。

优选地，所述药物包含格兰地新或/和其可药用盐，以及药学上可以接受的辅料。

可以理解的是，所述药物可以是口服型药物，也可以是注射型药物，也可以是局部给药型药物。

优选地，所述药物的剂型为片剂、丸剂、颗粒剂、滴丸剂、胶囊剂、口服液、注射剂、注射用冻干粉针剂、滴眼剂、软膏剂、喷雾剂、软膏剂、或者栓剂。

可以理解的是，药物剂型不同，制备该药物剂型所选用的药用辅料的制备原料也不同。

以药物剂型为片剂为例，药学上可以接受的辅料包括但不限于淀粉、阿拉伯胶、羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁、以及食用乙醇等等。具体地，以格兰地新盐酸盐片剂为例，其原料配方可选用：格兰地新盐酸盐90g，淀粉900g，阿拉伯胶4g，羧甲基纤维素钠3g，硬脂酸镁3g，以及95％食用乙醇20mL。

以药物剂型为水针剂为例，药学上可以接受的辅料包括但不限于氯化钠、甘露醇、酸碱调节、以及蒸馏水等等。具体地，以格兰地新盐酸盐水针剂为例，其原料配方可选用：格兰地新盐酸盐10.0g，氯化钠20.0g，甘露醇50.0g，1％盐酸水溶液以及蒸馏水，蒸馏水调整总体积为1000ml。

以药物剂型为滴眼剂为例，药学上可以接受的辅料包括但不限于氯化钠、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、以及蒸馏水等等。具体地，以格兰地新盐酸盐滴眼液为例，其原料配方可选用：格兰地新盐酸盐5.0g，氯化钠90.0g，尼泊金甲酯0.23g，尼泊金丙酯0.11g，以及蒸馏水，调整至1000mL。

本发明涉及一种预防或/和治疗脑血管疾病的方法，该方法包括：

对脑血管疾病患者进行药物预防或/和治疗，所述药物包含格兰地新和/或其可药用盐。可以理解的是，药物的给药方式或者剂型不受限制，可以是药学上可接受的任何的剂型或者给药方式。

实施例1、格兰地新在OGD损伤后对神经元的保护作用

1实验材料

1.1药品与试剂

格兰地新溶解于DMSO，-80℃避光保存备用；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)；胰蛋白酶(Trypsin)；胰蛋白酶抑制剂(Trypsin inhibitor)；脱氧核糖核酸酶(DNase)；青-链霉素；皮层神经元培养基(Neurobasal，NB)；浓硝酸(68-70％)；超纯水；75％酒精；磷酸盐缓冲液(PBS)；解剖液(CMF-HBSS)；0.05％MTT；L-多聚赖氨酸(poly-L-Lysine，PLL)；D-多聚赖氨酸(poly-D-Lysine，PDL)；无糖DMEM培养基；MEM生长培养基；Map2；DAPI；Alexa Fluor 488/546Goat Anti-Mouse IgG二抗。

1.2仪器

一次性培养皿；细胞冻存管；离心管；玻片；烘箱；孔板；手术器械；垂直超净工作台；CO₂恒温培养箱；恒温水浴锅；缺氧箱；全自动高压灭菌器；LDH试剂盒；解剖显微镜；荧光显微镜；微量移液枪；离心机；涡旋仪；旋转摇床；超纯水系统；电子天平。

1.3材料

SD孕鼠，用于提取E18天胎鼠大脑皮层的原代皮层神经元细胞。

2实验方法

2.1原代皮层神经元提取和培养

原代皮层神经元提取自E18天的SD孕鼠的胎鼠大脑皮层，在进行提取原代皮层神经元细胞前对要用到的玻片、细胞培养板以及培养皿进行如下处理：

将玻片、细胞培养板预先用浓硝酸浸泡过夜，超纯水洗3次，1小时/次，至于200℃烘箱内4h，再将玻片、细胞培养板放置于生物安全柜紫外照射过夜；用稀释的PDL包被玻片或PLL包被孔板或培养皿过夜，用灭菌水清洗完成包被的玻片、细胞培养板3次，10min/次，加入半体积的平衡液平衡过夜备用。

SD孕鼠颈脱臼处死并用75％的酒精消毒处理，迅速用高温灭菌消毒过的手术器械解剖SD孕鼠，将里面的胎鼠取出，断头，用预冷的PBS漂洗两次后置于解剖液(CMF-HBSS)中，在解剖显微镜下用解剖剪将胎鼠的脑膜去掉，分离出大脑皮层，转移于生物安全柜，用消毒过的刀片切碎皮层组织并转移至15mL离心管中，加入3mL解剖液(CMF-HBSS)洗两次，最后加入3mL解剖液(CMF-HBSS)，再按1:100比例(体积比)加入100×DNase和1：10比例(体积比)加入10×胰蛋白酶(Trypsin)，放入预热至37℃的恒温水浴锅中消化15min，每隔2min摇晃一次，使其充分消化，再按1:20比例(体积比)加入1％胰蛋白酶抑制剂(Trypsin inhibitor)以终止消化，混匀后离心。吸掉上清，加入4mL皮层神经元培养基(NB)洗一次，离心3min，1000转。再弃上清，加入4mL皮层神经元培养基，轻轻吹打20次，静置2分钟后，将上清转移，再静置2分钟。再将上清转移至新的离心管。混匀后去10μL细胞液用培养基稀释20倍用于计数，细胞计数后，按4×10⁴个细胞接种至12well中培养，按8×10⁵个细胞接种至35mm培养皿中培养，按1×10⁵个细胞接种至96孔培养板中培养。细胞每隔三天半换液，体外培养至第7天(DIV 7)用于实验。

2.2缺糖缺氧(OGD/R)模型构建

培养至DIV7的原代皮层神经元的培养基换成MEM生长培养基，预处理2h后，再换成无糖DMEM培养基；转移至缺氧箱中，通入含95％N₂和5％CO₂气体约10min，5L/min，使缺氧培养箱中形成无氧环境，再将含有细胞的缺氧箱放在37℃恒温培养箱中4h；将细胞取出，移去无糖DMEM培养基，加入生长培养基继续培养24h后收取细胞进行后续实验，构建缺糖缺氧(OGD/R)模型。

空白对照组采用的DIV7的原代皮层神经元不经上述缺氧处理，进行正常的常规培养，即：

培养至DIV7的原代皮层神经元的培养基换成MEM生长培养基，2h后，再换成无糖DMEM培养基；不放入缺氧箱中进行诱导，在37℃恒温培养箱中常规培养4h；将细胞取出，移去无糖DMEM培养基，加入生长培养基继续培养24h后收取细胞进行后续实验。

2.3实验分组及给药

将培养至DIV7原代皮层神经元，以每孔1×10⁴个细胞接种于96孔培养板，每孔100μL细胞悬液；设空白组、模型组和3个不同浓度(0.2μM、0.04μM、0.008μM)的给药组，每组设3个平行复孔。具体如下：

空白组：步骤2.1所得细胞，不做处理，使其正常生长。

模型组：步骤2.1所得细胞，用生长培养基处理2h后，换成无糖DMEM培养基，转移至缺氧箱中，通入含95％N₂和5％CO₂气体约10min，5L/min，使缺氧培养箱中形成无氧环境，再将含有细胞的缺氧箱放在37℃恒温培养箱中4h，将细胞取出，移去无糖DMEM培养基，加入生长培养基继续培养24h。

给药组：用分别含有不同终浓度(0.2μM、0.04μM以及0.008μM)的格兰地新的生长培养基处理2h后，再换成含有不同(0.2μM、0.04μM以及0.008μM)的格兰地新的无糖DMEM培养基，转移至缺氧箱中，通入含95％N₂和5％CO₂气体约10min，5L/min，使缺氧培养箱中形成无氧环境，再将含有细胞的缺氧箱放在37℃恒温培养箱中4h，将细胞取出，移去无糖DMEM培养基，加入生长培养基继续培养24h。

2.4MTT法测试格兰地新在OGD损伤后对细胞的保护作用

取步骤2.3的空白组、模型组、以及给药组的细胞培养板，每孔加入30μL MTT(5mg/mL)，作用4h后除去上清液并加入100μL DMSO溶解反应产物，使用酶标仪在595nm波长处检测各孔OD值。

细胞存活率(％)＝(实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100％

2.5神经元树突形态观察测试格兰地新在OGD后对原代神经元树突完整性的保护作用

建立模型后，将各组细胞取出，用PFA固定20min，室温，PBS洗三次。加入Map2(1：2000)和DAPI(1：3000)，4℃，过夜。PBS洗三次，敷荧光二抗Alexa Fluor 488/546GoatAnti-Mouse IgG二抗。封片，荧光显微镜下拍照观察。用Image J软件分析树突的分支数和神经突起的平均长度等指标。

2.6统计学处理

使用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理，实验数据采用均数±标准差表示，两组间比较采用独立T检验，多组间比较采用单因素方差分析，检验水准α＝0.05，P＜0.05时认为差异具有统计学意义。

3实验结果

3.1MTT法测试格兰地新在OGD损伤后对细胞的保护作用

通过MTT法检测神经元的存活率，结果如图1，对照组、模型组、给药组(0.2μM)、给药组(0.04μM)、给药组(0.008μM)的平均存活率分别为100％、38.5％、82.3％、84.5％、84.0％。与空白组相比，模型组神经元在缺糖缺氧4h后，其细胞存活率显著降低(p<0.01)。而与模型组相比，格兰地新组各浓度均可显著提升神经元的细胞活力(p<0.05)。

3.2通过神经元树突形态观察测试格兰地新在OGD后对原代神经元树突完整性的保护作用

对照组、模型组、给药组的神经元形态图如图2所示：空白组呈梭形或多边形，拥有多突起，突起长且有许多分叉；模型组神经元氧糖剥夺损伤明显减少了神经元树突数量及长度；格兰地新组神经元细胞形态与空白组相似，拥有多突起，突起长。需要说明的是，图2中标注“格兰地新”的结果具体是浓度为0.04μM的给药组的测试结果。

对照组、模型组、给药组的神经元突起长度和数量的统计分析结果如图3所示：模型组神经元细胞的长度和数量均显著低于空白组，说明造模成功；与模型组相比，格兰地新组可显著的恢复神经元树突的完整性。具体地，对照组、模型组、给药组的树突平均数量分别为16、5、9，对照组、模型组、给药组的树突平均长度分别为370μm、80μm、217μm。需要说明的是，图3中标注“格兰地新”的结果具体是浓度为0.04μM的给药组的测试结果。

急性缺氧性卒中具有死亡率、致残率高的特点，严重危害人类健康。本发明以原代培养的皮层神经元为模型，采用氧糖剥夺模拟缺氧再灌注损伤，通过细胞存活率和神经元树突形态观察，研究格兰地新对皮层细胞的保护作用。结果表明，格兰地新可显著提升神经元细胞存活率，恢复神经元树突的完整性，表现出显著的神经元保护作用。

实施例2、格兰地新盐酸盐片剂的制备

取格兰地新盐酸盐90g，粉碎成粉末，加入淀粉900g、阿拉伯胶4g、羧甲基纤维素钠3g，混匀，喷洒95％食用乙醇20mL制成软材，置制粒机内制成颗粒(一号筛大小)，于60℃下烘干至水分含量3-5％，经上述干燥整粒后，加入润滑剂硬脂酸镁，充分混合均匀，上压片机压制成0.25g/片，瓶装，经检验合格后，包装即得成品。

实施例3、格兰地新盐酸盐水针剂的制备

取格兰地新盐酸盐10.0g，在100级以下车间内，加入氯化钠20.0g、甘露醇50.0g、注射用水9000mL，充分搅匀后，加入1％的盐酸水溶液，调节pH值3.0-5.0，搅匀，加注射用水调整总体积至10000mL，加入0.1％的活性炭80℃保温15min，过滤，滤液经0.2μm微孔滤膜超滤，得澄明溶液，溶液无菌分装于安瓿中，每安瓿5mL，熔封，灭菌，经检验合格后，包装即得成品。

实施例4、格兰地新盐酸盐滴眼液得制备

取格兰地新盐酸盐5.0g，在100级以下车间内，加入氯化钠90.0g、尼泊金甲酯0.23g、尼泊金丙酯、蒸馏水100mL，充分搅匀后，加入1％得盐酸水溶液适量，调节pH值3.0-5.0，搅匀，加蒸馏水调整总体积至1000mL，加入0.1％的活性炭80℃保温15min，过滤，滤液经0.2μm微孔滤膜超滤，得澄明溶液，溶液无菌罐装于滴眼瓶中，每瓶2mL，100℃灭菌30min，经检验合格后，包装即得成品。

综上所述，本发明提供了一种格兰地新和/或其可药用盐的新用途，主要是将格兰地新和/或其可药用盐用于制备预防或者治疗脑血管疾病药物。本发明基于构建的生物模型，验证了格兰地新和/或其可药用盐能够保护脑神经元，有效避免神经元数量和/或活力降低，以及保护神经元功能学形态免受损伤，这说明，格兰地新和/或其可药用盐能够用来有效防治脑血管疾病。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。