阅读说明：本技术 中药单体氧化苦参碱在制备治疗或预防非小细胞肺癌药物上的应用 (Application of traditional Chinese medicine monomer oxymatrine in preparation of medicines for treating or preventing non-small cell lung cancer ) 是由 胡亚娥 杨萍 茅家慧 刘霞 朱燕 李小青 于 2019-11-05 设计创作，主要内容包括：本发明提供单体氧化苦参碱(Oxymatrine,OMT)在制备治疗或预防非小细胞肺癌药物上的应用,其特征在于,包括以下方面：(1)OMT抑制A549细胞增殖：分别以0、5mmoL/L、10mmoL/L、15mmoL/L、20mmoL/L的OMT处理细胞24、48和72小时,CCK8方法检测OMT对A549细胞增殖的抑制率；(2)OMT抑制脂多糖(LPS)诱导的A549细胞迁移和侵袭：Transwell分析检测OMT对A549细胞迁移和侵袭的影响；(3)OMT抑制LPS诱导的A549细胞TLR4和MyD88的表达：通过qRT-PCR和Westernblot分析TLR4和MyD88mRNA和蛋白水平；(4)OMT下调LPS诱导的A549细胞中MMP-2,MMP-9和VEGF mRNA和蛋白水平。本发明的中药单体氧化苦参碱制备的药物在治疗或预防非小细胞肺癌药物上具有显著作用,为临床上预防和治疗小细胞肺癌的新突破口。(The invention provides an application of monomer Oxymatrine (OMT) in preparing a medicament for treating or preventing non-small cell lung cancer, which is characterized by comprising the following aspects: (1) OMT inhibits a549 cell proliferation: the cells are treated by OMT with the concentration of 0, 5, 10, 15 and 20mmoL/L for 24, 48 and 72 hours respectively, and the inhibition rate of OMT on the proliferation of A549 cells is detected by a CCK8 method; (2) OMT inhibits Lipopolysaccharide (LPS) -induced a549 cell migration and invasion: transwell analysis detects the influence of OMT on the migration and invasion of A549 cells; (3) OMT inhibits LPS-induced expression of TLR4 and MyD88 in A549 cells: TLR4 and MyD88mRNA and protein levels were analyzed by qRT-PCR and Westernblot; (4) OMT down-regulates MMP-2, MMP-9, and VEGF mRNA and protein levels in LPS-induced A549 cells. The medicine prepared from the traditional Chinese medicine monomer oxymatrine has a remarkable effect on treating or preventing non-small cell lung cancer, and is a new breakthrough for clinically preventing and treating small cell lung cancer.)

中药单体氧化苦参碱在制备治疗或预防非小细胞肺癌药物上 的应用

技术领域

本发明属于药物新用途领域，具体涉及中药单体氧化苦参碱在制备治疗或预防非小细胞肺癌药物上的应用。

背景技术

肺癌是严重威胁人类生存的主要恶性肿瘤之一。在我国肺癌是发病率和死亡率最高的肿瘤。75%-80%的肺癌患者属于非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。在中国，非小细胞肺癌患者的医疗支出急剧增加，特别是由于新开发的治疗方案。NSCLC 患者当前的标准治疗仍然是手术，化学疗法和靶向治疗。尽管肺癌的诊断和治疗手段不断改进，肺癌患者的 5 年生存率仍不到 15%。因此，进一步研究肺癌的侵袭和转移机制以及寻找新的治疗药物越来越重要。

发明内容

本发明提供中药单体氧化苦参碱在制备治疗或预防非小细胞肺癌药物上的应用，以解决背景技术中所提出的问题。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供中药单体氧化苦参碱在制备治疗或预防非小细胞肺癌药物上的应用。

进一步的，包括以下方面：

（1）OMT抑制A549细胞增殖：分别以0、5mmoL/L、10mmoL/L、15mmoL/L、20mmoL/L的OMT处理细胞24、48和72小时，CCK8方法检测OMT对A549细胞增殖的抑制率；

（2）OMT抑制脂多糖（LPS）诱导的A549细胞迁移和侵袭：Transwell分析检测OMT对A549细胞迁移和侵袭的影响；

（3）OMT抑制LPS诱导的A549细胞TLR4和MyD88的表达：通过qRT-PCR和Westernblot 分析TLR4和MyD88mRNA和蛋白水平；

（4）OMT下调LPS诱导的A549细胞中MMP-2，MMP-9和VEGF的表达：10mg/L的LPS处理24小时后，A549细胞中MMP-2，MMP-9和VEGF的mRNA和蛋白水平。

本发明的实施例还提供一种治疗或预防非小细胞肺癌的药物，其特征在于，至少包括中药单体氧化苦参碱。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明的中药单体氧化苦参碱在制备治疗或预防非小细胞肺癌药物上的应用，通过OMT抑制A549细胞增殖，OMT抑制脂多糖（LPS）诱导的A549细胞迁移和侵袭，OMT抑制LPS诱导的A549细胞TLR4和MyD88的表达，OMT下调LPS诱导的A549细胞中MMP-2，MMP-9和VEGF的表达这几个方面，中药单体氧化苦参碱制备的药物在治疗或预防非小细胞肺癌药物上具有显著作用，本发明在中药单体氧化苦参碱在抗小细胞肺癌治疗中的应用提供实验和理论依据，找到临床上预防和治疗小细胞肺癌的新突破口。

附图说明

图1为本发明的实施例中OMT 对 A549 细胞增殖的影响图；分别以OMT（0、5、10、15、20 mmoL/L）处理 A549 细胞 24、48 和 72 小时，并通过 CCK8 分析 OMT 对细胞的抑制率；与对照组相比，**P<0.01；所有结果均为平均值±SD；每组 n = 6。

图2为本发明的实施例中OMT 抑制 A549 细胞的迁移和侵袭的结果图；其中，图2A-B为Transwell 法检测 OMT 对 A549 细胞迁移的影响图；图2A为在显微镜下，通过观察五个独立的视野来量化迁移细胞的总数，并使用 Wright-Giemsa 染色试剂盒对细胞进行染色图；图2B为定量数据统计图。图2C-D为Transwell 法检测 OMT 对 A549 细胞侵袭的影响；图2C在显微镜下，通过计数五个独立的视野来量化侵袭细胞的总数，使用 Wright-Giemsa 染色试剂盒对细胞染色图；图2D为定量数据统计图；与对照组相比，**P<0.01；与LPS 组相比，##P<0.01。放大倍数×100。在图2B和图2D中，柱状图下方，1为对照组，2为LPS组， 3为LPS+OMT（5 mmoL/L）组， 4为LPS+OMT（10 mmoL/L）组，5为LPS+OMT（15 mmoL/L）组，6为LPS+TAK 组。

图3为OMT 抑制 A549 细胞中 LPS 诱导的 TLR4 和 MyD88 的表达的结果图；图3A为qRT-PCR 检测 TLR4 和MyD88 mRNA 表达水平的结果图；与对照组比较，** P <0.01；与 LPS 组比较，##P <0.01；图3B 和图3 C分别为蛋白质印迹分析检测 TLR4 和 MyD88 的蛋白表达水平的结果图；与对照组相比，** P <0.01；与 LPS 组比较，##P <0.01。所有结果均为平均值±SD； 每组 n = 3。

图4为OMT 降低 LPS 诱导的 A549 细胞 MMP-2，MMP-9 和 VEGF 的表达水平的结果图。 图4A为qRT-PCR 检测 MMP-2，MMP-9 和 VEGF mRNA 表达水平的结果图。与对照组比较，** P <0.01；与 LPS 组比较，

##P <0.01。图4B和图4C均为蛋白质印迹分析 MMP-2，MMP-9 和 VEGF 蛋白表达水平的结果图；与对照组比较，** P <0.01；与 LPS 组比较， ## P <0.01；所有结果均为平均值±SD；每组 n = 3。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。

实施例1

中药单体氧化苦参碱在制备治疗或预防非小细胞肺癌药物上的应用。

本发明的中药单体氧化苦参碱在制备治疗或预防非小细胞肺癌药物上的应用，包括以下方面：

首先，在本发明中进行细胞培养和处理：取人NSCLC细胞系A549（美国模式培养物保藏所ATCC），在RPMI1640培养基（10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/mL链霉素）中培养。置于5%CO₂，37°C细胞培养箱。

A549细胞分为六组。第一组（对照组），细胞用RPMI1640培养基培养；第二组（LPS组），用LPS（10μg/ml）处理细胞；第三组、第四组、第五组均为LPS+OMT组，分别将细胞用不同浓度的OMT（5、10、15mmoL/L）预处理24小时，然后再将LPS（10μg/ml）处理24小时；第六组为LPS+TAK组，将细胞用（TLR4抑制剂）TAK-242 （100nmol/L）预处理1h，然后将细胞用LPS（10μg/ml）处理24h。

（1）OMT抑制A549细胞增殖：分别以0、5mmoL/L、10mmoL/L、15mmoL/L、20mmoL/L的OMT处理细胞24、48和72小时，CCK8方法检测OMT对A549细胞增殖的抑制率。

细胞计数试剂盒 8（CCK8）测定步骤：将 A549 细胞接种在 96 孔板（2×10³/孔）中并培养过夜。 随后，将各种浓度的 OMT（5、10、15 和 20 mmol / L）添加到细胞中 24 小时，48 小时和 72 小时。然后将上清液替换为 100μL含 10μL CCK8 的 RPMI 1640 培养基，并将细胞在 37°C 下孵育 2 小时。用 ELX-800 酶标仪（BIO-TEK，Winooski，VT，美国）在 450nm 处测量光密度（OD）。计算 A549 细胞的增殖抑制率。

如图1所示，OMT 以剂量和时间依赖性方式抑制 A549 细胞的增殖。

（2）OMT抑制脂多糖（LPS）诱导的A549细胞迁移和侵袭：Transwell分析检测OMT对A549细胞迁移和侵袭的影响。

（3）Transwell 小室检测细胞迁移和侵袭能力的具体步骤如下：将美国 Corning公司的 Transwell 小室置于 24 孔培养板中，分成上部和下部腔室。在细胞迁移试验中，无血清 RPMI 1640 培养基中接种 1.5×10⁴个细胞，并在下腔室内加入 500 μL 的完整培养基（RPMI 1640 培养基和 10%胎牛血清）。37℃培养过夜。细胞侵袭试验中，用 Matrigel处理聚碳酸酯膜。在无血清的 RPMI 1640 培养基中，上室接种细胞（3×10⁴）。将 600 μL的完整培养基加入下腔室内。显微镜下计数五个独立的视野（日本 Olympus 600），量化迁移或侵入细胞的数量，并用 Wright Giemsa Stain 试剂盒（中国南京建城生物工程研究所）染色观察细胞形态。

如图2A-图2D所示，与对照组相比，第二组-第六组均可增强 A549 细胞的侵袭和迁移能力。OMT 浓度分别为 10 和 15 mmoL/L 时可以显著降低 LPS诱导的 A549 细胞迁移和侵袭。与 LPS 组相比，LPS+TAK 组的细胞迁移和侵袭显著减少，这表明 OMT 能抑制A549 细胞的迁移和侵袭。

（4）OMT抑制LPS诱导的A549细胞TLR4和MyD88的表达：通过qRT-PCR和Westernblot分析TLR4和MyD88mRNA和蛋白水平。

Real-time PCR 方法：Trizol 试剂提取总 RNA，将 2 μg 总 RNA 逆转录为cDNA。5 μL SYBR Green 混合液、0.5μL cDNA、正向引物和反向引物各 0.2 μL 和 4.1 μL不含核酸酶的水组成的总体积为 10 μL 的聚合酶链式反应。反应条件为：95°C 一次循环初始变性 10 min，变性 40 次循环 95°C 15s，退火 60°C 30s，延伸 72℃ 30s 。选择GAPDH 作为内参。用 2^−ΔΔCT方法计算相关基因表达水平。

Western blot 分析过程：细胞用冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次，在裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂）中 4℃裂解 30 分钟，12000 g 离心 10min。10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离 50 μg 总蛋白，在恒电流（200 mA）下，转膜 120 min。膜封闭 1 小时，多克隆兔抗 TLR4 抗体（1:200）、MyD88 (1: 1000)、MMP-2 (1:1000)、MMP-9 (1:1000)、VEGF (1: 1000) and GAPDH (1:2000)孵育过夜，然后 HRP 结合的二抗室温孵育 1 小时。采用增强的化学发光法进行检测。用 Scion 图像软件扫描，选择 GAPDH 作为内参。

为了确定 TLR4 信号传导是否参与 OMT 的抗迁移和抗侵袭作用，通过 qRT-PCR和 Western blot 分析 TLR4 和 MyD88 mRNA 和蛋白水平。qRT-PCR 结果显示，LPS（10 µg/mL）增强了 A549 细胞 TLR4 和 MyD88 mRNA 表达水平，这被 OMT（10 mmoL/L 或 15mmoL/L）抑制，并被 TLR4

拮抗剂 TAK-242 几乎完全阻断（图 3A）。LPS+OMT（10 mmoL/L）组，LPS+OMT（15 mmoL/L）组和 LPS+TAK 组显著降低 LPS 刺激后的 TLR4 和 MyD88 的蛋白质水平（如图 3B 和3C）。

（4）OMT下调LPS诱导的A549细胞中MMP-2，MMP-9和VEGF的表达：10mg/L的LPS处理24小时后，A549细胞中MMP-2，MMP-9和VEGF的mRNA和蛋白水平。

LPS（10 mg / L）处理 24 小时后，与对照组比较，A549 细胞中 MMP-2，MMP-9 和VEGF 的mRNA 和蛋白水平均显着增加（如图 4A–C）。 与 LPS 组比较， LPS+ OMT（10 mmoL/L）组，LPS+OMT（15 mmoL/L）组和 LPS+TAK 组，MPS-2，MMP-9 和 VEGF 的表达水平明显降低（如图4A–C）。

实施例2

一种治疗或预防非小细胞肺癌的药物，其特征在于，至少包括中药单体氧化苦参碱。

治疗或预防非小细胞肺癌的药物对非小细胞肺癌中A549细胞的抑制方法与实施例1相同。

在本实施例中治疗非小细胞肺癌的药物中，重要单体氧化单体氧化苦参碱抑制非小细胞肺癌与实施例1中相同，在此不作赘述。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。