耐药性金黄色葡萄球菌MecA和ErmA基因的多重荧光RPA检测方法及试剂盒
阅读说明：本技术 耐药性金黄色葡萄球菌MecA和ErmA基因的多重荧光RPA检测方法及试剂盒 (Multiplex fluorescence RPA detection method and kit for drug-resistant staphylococcus aureus MecA and ErmA genes ) 是由 朱灿灿 朱灵 时忠林 胡安中 杨柯 刘勇 于 2021-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开同时检测耐药性金黄色葡萄球菌MecA和ErmA耐药基因的引物探针,涉及耐药基因检测技术领域,本发明还公开包含引物探针的试剂盒、多重荧光RPA检测方法。本发明的有益效果在于：采用本发明中引物探针的多重荧光RPA检测方法具有很强的特异性、较好的抗干扰性和较高的敏感性。(The invention discloses a primer probe for simultaneously detecting drug-resistant genes MecA and ErmA of drug-resistant staphylococcus aureus, relates to the technical field of drug-resistant gene detection, and further discloses a kit containing the primer probe and a multiplex fluorescence RPA detection method. The invention has the beneficial effects that: the multiplex fluorescence RPA detection method adopting the primer probe has strong specificity, better anti-interference performance and higher sensitivity.)
技术领域
本发明涉及耐药基因检测技术领域，具体涉及耐药性金黄色葡萄球菌MecA和ErmA基因的多重荧光RPA检测方法及试剂盒。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,Sureus)属于葡萄球菌属，是一种可引起人和动物传染病的重要病原体。耐药性金黄色葡萄球菌在自然界中分布广泛，是人类化脓性感染最常见的病原体。
在临床中，与鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌等其他耐药病原菌相比，耐药性金黄色葡萄球菌在感染人群中所占比例更为显著，达到27.60％；同时可引起伤口化脓性感染、乳腺炎等人畜局部感染，也可引起全身感染。经临床调查发现耐药性金黄色葡萄球菌对多种药物均有耐药，主要包括β-内酰胺类、大环内酯类、氨基糖苷类、四环素类药物。其中，耐药性金黄色葡萄球菌对β-内酰胺类和大环脂类的耐药率最高，因为耐药性的金黄色葡萄球菌普遍含有MecA和ermA两个耐药基因。
目前临床上对耐药性金黄色葡萄球菌的检测主要有传统的分离鉴定方法、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点序列分型(MLST)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链反应(PCR)等。这些方法设计复杂、耗时、操作专业。当突发公共卫生事件需要进行流行病学调查和诊断时，如何满足现场快速、准确诊断的需求是一个挑战。如公开号为CN106222248A的专利申请公开一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的引物、探针、方法及试剂盒，但其最低检测限较高，为103copies/mL，因此，迫切需要一种快速、准确、独特、敏感的耐药性金黄色葡萄球菌检测技术，以协助医务人员进行早期诊断。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)是一种等温核酸扩增技术，通过重组酶-引物复合体特异性识别模板DNA互补序列，从而实现模板DNA快速扩增的方法。通过在扩增系统中添加Exo探针，可实现扩增产物的实时荧光监测。RPA方法具有灵敏度高、检测时间短、特异性高、常温扩增(37℃～42℃)的优势，非常适合临床病原微生物及耐药基因的快速检测。但也存在一些不足：由于RPA探针设计较复杂，引物间存在干扰等问题，使得采用多重荧光RPA进行多靶标检测的研究较少。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于现有技术中金黄色葡萄球菌耐药性基因检测最低检测限较高，提供快速简便的同时敏感检测耐药性金黄色葡萄球菌MecA和ErmA耐药基因的引物探针、试剂盒、多重荧光RPA检测方法。
本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题：
同时检测耐药性金黄色葡萄球菌MecA和ErmA耐药基因的引物探针，所述MecA耐药基因的引物对核苷酸序列为：
M-F:CCAAAGAATGTATCTAAAAAAGATTATAAAGCAATC；
M-R:AACGGTTTTAAGTGGAACGAAGGTATCATC；
所述ErmA耐药基因的引物对核苷酸序列为：
E-F:TCAGTAAACAAGACAACGTAATAGAAATCGGATC；
E-R:TATCCGTTTGAATCACTTTTATATTCTCAG；
所述MecA耐药基因的特异性探针核苷酸序列为：
M-Probe：ACTAAGTATTTCTGAAGACTATATCAAACAACAAA(FAMdT)C(THF)A(BHQ1-dT)CAAAATTGGGTACAA[3’-block]；
所述ErmA耐药基因的特异性探针核苷酸序列为：
E-Probe：AGAGCTAGTCAAAATGAGTCGATCAGTTAC(HEXdT)G(THF)TA(BHQ1-dT)AGAAATTGATGGAGGC[3’-block]。
有益效果：根据耐药性金黄色葡萄球菌的MecA、ErmA两个耐药基因的保守序列设计出的2条特异性探针以及对应的特异性引物，其中MecA耐药基因所对应的荧光探针标记FAM荧光素，ErmA耐药基因所对应的荧光探针标记为HEX荧光素。通过实验验证，本发明的引物间没有干扰，特异性强，采用本发明中引物探针具有很强的特异性、较好的抗干扰性和较高的敏感性，实现了基因的同时检测，达到耐药基因快速、高效、并行检测的目的。
包含上述引物探针的试剂盒。
有益效果：采用包含本发明中引物探针的试剂盒的多重荧光RPA检测方法具有很强的特异性、较好的抗干扰性和较高的敏感性。
优选地，所述试剂盒还包括水解缓冲液、MgOAC、ddH2O。
优选地，所述MecA耐药基因引物对的浓度、ErmA耐药基因引物对的浓度、MecA耐药基因特异性探针的浓度、ErmA耐药基因特异性探针的浓度均为10μM。
优选地，所述试剂盒进行RPA检测时的体系，以20μL计，包括以下组分：水解缓冲液11.8μl、10μM MecA基因上游引物0.85μl、10μM MecA基因下游引物0.85μl、10μM MecA基因探针0.24μl、10μM ErmA基因上游引物0.85μl、10μM ErmA基因下游引物0.85μl、10μM ErmA基因探针0.24μl、模板1μl、剩余ddH2O补齐，在实验开始前添加2.5μLMgOAC启动试验。
一种采用上述引物探针检测耐药性金黄色葡萄球菌MecA和ErmA耐药基因的多重荧光RPA检测方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样的DNA；
(2)以提取的DNA为模板，采用上述引物探针配制RPA反应体系，等温进行多重RPA扩增反应，检测探针所对应的荧光信号。
有益效果：采用本发明中引物探针的多重荧光RPA检测方法具有很强的特异性、较好的抗干扰性和较高的敏感性，最低可检测到拷贝数为2*101copies/μl。
通过反复优化引物、探针序列及扩增体系，在单重扩增体系中初步筛选出合适的引物、探针；其次，将两个耐药基因的适合引物、探针加入到同一扩增体系下，开展优化实验，通过观察能否同时、高效的扩增出特异性片段，最终筛选出合适的引物、探针。建立了耐药性金黄色葡萄球菌中耐药基因(MecA和ErmA)的多重荧光RPA方法，实现了两个耐药基因的快速、高效、并行检测。
本方法可靠性高，实用性强，可用于对组织、痰液、唾液等样本的检测，适用于任何实验室，在资源匮乏及现场快速检测中具有较大的应用前景及潜力。
优选地，所述RPA反应体系，以20μL计，包括以下组分：水解缓冲液11.8μl、10μMMecA基因上游引物0.85μl、10μM MecA基因下游引物0.85μl、10μM MecA基因探针0.24μl、10μM ErmA基因上游引物0.85μl、10μM ErmA基因下游引物0.85μl、10μM ErmA基因探针0.24μl、模板1μl、剩余ddH2O补齐，在实验开始前添加2.5μLMgOAC启动试验。
优选地，所述反应温度为39℃，反应时间为30min。
本发明的优点在于：根据耐药性金黄色葡萄球菌的MecA、ErmA两个耐药基因的保守序列设计出的2条特异性探针以及对应的特异性引物，其中MecA耐药基因所对应的荧光探针标记FAM荧光素，ErmA耐药基因所对应的荧光探针标记为HEX荧光素。通过实验验证，采用本发明中引物探针的多重荧光RPA检测方法具有很强的特异性、较好的抗干扰性和较高的敏感性，实现了基因的同时检测，达到耐药基因快速、高效、并行检测的目的。
采用包含本发明中引物探针的试剂盒的多重荧光RPA检测方法具有很强的特异性、较好的抗干扰性和较高的敏感性，最低可检测到拷贝数为2*101copies/μl。
本方法可靠性高，实用性强，可用于对组织、痰液、唾液等样本的检测，适用于任何实验室，在资源匮乏及现场快速检测中具有较大的应用前景及潜力。
附图说明
图1为本发明实施例3中多重荧光RPA灵敏度曲线示意图，其中实线为MecA耐药基因，所对应的荧光探针标记FAM荧光素；虚线为ErmA耐药基因，所对应的荧光探针标记HEX荧光素；
图2为本发明实施例3中多重荧光RPA特异性曲线示意图，其中实线为MecA耐药基因，所对应的荧光探针标记FAM荧光素；虚线为ErmA耐药基因，所对应的荧光探针标记HEX荧光素；
图3为本发明实施例5中多重荧光RPA检测实际样本适用性测定结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
以下实施例中使用RPA试剂盒Exo kit购自英国TwistDx Inc公司；其中，能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶是以冻干粉状态存在于试剂盒所提供的RPA反应管中，使用时直接用试剂盒所带的反应缓冲液稀释。整个RPA反应是在RPA反应管中进行。
实施例1
选取耐药性金黄色葡萄球菌MecA、ErmA基因保守序列，按照荧光RPA引物设计原则，设计M-F/M-R，E-F/E-R两组引物及M-Probe、E-Probe特异性探针；其中，MecA基因所对应的荧光探针标记FAM荧光素，ErmA基因所对应的荧光探针标记HEX荧光素。
M-F:CCAAAGAATGTATCTAAAAAAGATTATAAAGCAATC；
M-R:AACGGTTTTAAGTGGAACGAAGGTATCATC；
E-F:TCAGTAAACAAGACAACGTAATAGAAATCGGATC；
E-R:TATCCGTTTGAATCACTTTTATATTCTCAG；
M-Probe：ACTAAGTATTTCTGAAGACTATATCAAACAACAAA(FAMdT)C(THF)A(BHQ1-dT)CAAAATTGGGTACAA[3’-block]；
E-Probe：AGAGCTAGTCAAAATGAGTCGATCAGTTAC(HEXdT)G(THF)TA(BHQ1-dT)AGAAATTGATGGAGGC[3’-block]。
在此基础上设计试剂盒，该试剂盒包括10μM上述2种引物对、10μM上述2种探针、水解缓冲液。
实施例2
耐药性金黄色葡萄球菌MecA、ErmA耐药基因的多重荧光RPA检测方法的建立
(1)细菌培养与DNA提取：在LB培养基中培养金黄色葡萄球菌ATCC43300 24h左右，按细菌基因组DNA提取试剂盒提供的操作手册提取DNA；得到的核酸用NanoDrop分光光度计测定其浓度和纯度，A260/A280在1.8左右即可，备用。
(2)RPA反应体系为20μl，其中水解缓冲液Primer Free Rehydration buffer11.8μl、10μM MecA基因上游引物0.85μl、10μM MecA基因下游引物0.85μl、10μM MecA基因探针0.24μl、10μM ErmA基因上游引物0.85μl、10μM ErmA基因下游引物0.85μl、10μM ErmA基因探针0.24μl、模板1μl，剩余ddH2O补齐，在实验开始前添加2.5μLMgOAC启动试验，反应温度为39℃、时间30min，设置等温扩增反应程序及检测探针(FAM/HEX)所对应的荧光信号，在LightCycler 96上进行多重RPA扩增反应。
其中设置的程序包括两步法：39℃10s，变性；39℃50s，扩增。一共30个循环。
(3)实验中设置标准对照组及空白组，在30个循环扩增内，若模板组有荧光信号，且阴性组无荧光信号，则判定为阳性。
实施例3
多重荧光RPA灵敏度测定
用NanoDrop测定提取的耐药性金黄色葡萄球菌DNA浓度，根据标准曲线计算浓度，分别以不同浓度的DNA为模板，在实施例2中RPA检测方法最佳反应条件下进行检测，确定RPA检测方法的最小检出量，评价该方法的灵敏度。
图1可知所设计的多重荧光RPA检测方法，最低可检测到拷贝数为2*101copies/μl。
实施例4
多重荧光RPA特异性检测
选取呼吸道致病菌中最重要、最常见的三种致病菌，鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌为对照组，以三种致病菌的DNA为对照组模板，耐药性金黄色葡萄球菌DNA为实验组模板，在相同的反应条件、反应体系下进行检测，观察对照组、实验组荧光信号，评估该方法的特异性。
图2可知所设计的多重荧光RPA检测方法，特异性强，只有耐药性的金黄色葡萄球菌实验组有荧光信号检出。
实施例5
多重荧光RPA检测实际样本适用性测定
临床上金黄色葡萄球菌常出现在患者的痰中。利用临床患者痰样本用于评估实时荧光RPA检测的潜在用途和适用性。
首先对临床痰液标本进行富集培养，获得单菌落；选择单菌落在37℃液体振荡培养24小时。其次，提取基因组DNA，根据PCR扩增结果分析提取效果。最后，采用实施例2中的方法进行多重荧光RPA测试。根据临床样本扩增的荧光信号，评估该方法检测实际样本的适用性。
图3可知所设计的多重荧光RPA检测方法，68份临床检测样本中，实时荧光定量PCR检测阳性66例，阴性2例；65例检测结果为阳性，3例检测结果为阴性，该方法具有良好的临床适用性。
结果表明双重RPA方法在灵敏度方面与荧光PCR相当，但是在扩增时间上大幅减少，能更快的得出扩增结果。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。