一种高灵敏度检测动物布鲁氏菌病的方法
阅读说明：本技术 一种高灵敏度检测动物布鲁氏菌病的方法 (Method for detecting brucellosis of animals with high sensitivity ) 是由 张皓博 樊晓旭 刘雨田 孙明军 刘婷婷 亓菲 邵卫星 田莉莉 孙翔翔 迟庆安 冯 于 2021-10-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种微滴数字PCR法检测布鲁氏菌病的引物、探针及检测方法,其中引物和探针适用于微滴数字PCR法检测,并且能够准确地检测出布鲁氏菌质粒,与猪链球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、苍白念球菌、牛分枝杆菌样本核酸无交叉反应,特异性达100％；检测方法灵敏、准确,利于检测潜伏感染和低量感染,本发明提供的基于微滴数字PCR法高灵敏度检测布鲁氏菌病的方法,可检测到样本中1个拷贝的布鲁氏菌。(The invention discloses a primer, a probe and a detection method for detecting brucellosis by a microdroplet digital PCR method, wherein the primer and the probe are suitable for detecting by the microdroplet digital PCR method, brucella plasmids can be accurately detected, and the primers, the probe and the probe have no cross reaction with sample nucleic acids of streptococcus suis, salmonella, staphylococcus aureus, pasteurella, escherichia coli, candida xanthii and mycobacterium bovis, and the specificity reaches 100%; the detection method is sensitive and accurate, and is beneficial to detecting latent infection and low-quantity infection, and the brucellosis can be detected by 1 copy of brucella in a sample based on the high-sensitivity detection method of the microdroplet digital PCR method.)
技术领域
本发明属于细菌分子生物学检测技术领域，具体涉及一种基于微滴数字PCR检测动物布鲁氏菌病的引物、探针及检测方法。
背景技术
布鲁氏菌病(Brucellosis)，简称布病，是由布鲁氏菌属细菌引起的一种人兽共患慢性传染病，可感染多种哺乳动物，包括人类和一些两栖动物，对畜牧业发展和人畜健康构成较大威胁。人主要通过与病畜接触或食用被布鲁氏菌污染的食物感染布鲁氏菌，世界动物卫生组织(OIE)将布病列为必须通报动物疫病，我国将其列的二类动物疫病。2012年，我国发布《国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020年)》，将布鲁氏菌病列为16种优先防治动物疫病病种。
人和动物感染布鲁氏菌后，短者1d即可发病，长者在6个月至1年才发病，潜伏期一般为7～60d，平均为14～21d。布病属多系统多脏器损伤性疾病，临床表现比较复杂。以发热、乏力、多汗、食欲差、体重下降，以及肝脾及淋巴结肿大、肌肉疼痛、骨关节炎等器质性病变等为主要症状。布病流行于170多个国家和地区，主要流行于中东、拉丁美洲、亚洲、非洲和地中海盆地等牛羊养殖集中但经济技术相对落后的地区，每年约有50万新发人间病例，造成的经济损失约30亿美元。我国当前人兽共患布病感染形势仍十分严峻。动物布病专项流调结果显示，牛羊总体布病个体阳性率为3.2％，群体阳性率为25％。
随着畜牧业的发展，我国动物布病检测的需求，特别是对动物隐形感染和鉴别诊断的需求缺口越来越大。因此，加强动物布鲁氏菌检测技术研究，为疫病的控制、净化，动物健康，公共卫生安全具有重要意义。
目前对动物布病的诊断方法有如下的几种：
1)临床诊断
动物感染布病后多数为隐形感染，症状不明显。感染早期会出现结膜炎和体温升高等特征。雌性最显著症状是流产，多为死胎或者弱仔，但大多数流产后2个月可以再次受孕。雄性发生睾丸炎、附睾炎，触摸时局部发热并有热痛感，并失去配种能力。还会出现关节炎、滑液囊炎、淋巴结炎或囊肿等。
2)细菌学诊断
布鲁氏菌的分离培养是诊断布病的最基础方法，也是检测布病的“金标准”。微生物培养技术是采集病畜的血液、骨髓、组织、脑脊液等样本做细菌培养，观察菌落生长状况并进行鉴别。但由于布鲁氏菌对环境和营养要求较高，分离培养操作过程复杂，需要专业技术人员在生物安全三级以上实验室操作，分离操作过程存在较高的生物安全风险。还受动物感染阶段、样本中病原体数量及检测前抗生素使用等因素影响，常导致细菌污染，不能及时做出诊断而使病情加重，具有明显的局限性，不适合推广应用。
2)血清学诊断
布鲁氏菌血清学诊断包括：虎红平板凝集试验(RBPT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、全乳环状试验(MRT)、试管凝集试验(SAT)、补体结合试验(CFT)和荧光偏振试验(FPA)等。
RBPT、SAT和MRT是检测布病常用的初筛方法，其本质都是抗原抗体反应。RBPT操作简单，敏感性较高，但特异性和准确性一般，不能准确判定结果；SAT的敏感性较高，但操作复杂，耗时较长；MRT操作简单，但敏感性较差，可能出现假阳性；ELISA、CFT和FPA常用于血清学诊断布病的确诊方法，都具有敏感性高、特异性强等特点，但对成本和试验条件的要求较高。
血清学诊断技术在常规诊断方面有重要作用，但对于鉴定动物的隐形感染以及疫苗株免疫与野毒株感染的鉴别诊断方面，还存在一定的局限性。
2)分子生物学诊断
分子生物学检测方法包括PCR、多重PCR、荧光定量PCR和LAMP等方法，这些方法具有快速、敏感性和特异性强的特点，广泛用于各种疫病的诊断和流行病学调查。针对16SrRNA和布鲁氏菌蛋白基因(BCSP 31)设计引物进行分子生物学检测，在动物布鲁氏菌病诊断、分型、和流行病学调查中具有重要意义。上述方法虽然特异性和敏感性均较高，但对于动物布病的隐形感染、病原的绝对定量及制备布鲁氏菌相关标准物质方面，仍存在局限性。因此，在保证特异性、灵敏度、重复性的前提下，开发适用于隐形感染诊断、病原绝对定量的检测方法，是本领域技术人员研究的方向。
发明内容
鉴于此，本发明提供了一种基于微滴数字PCR的方法检测动物布病的引物、探针及检测方法，可实现对于布鲁氏菌单拷贝的检测，具有高灵敏、特异性强，重复性好、操作简便，适用于隐形感染诊断和样品中病原的绝对定量。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明首先提供一种检测动物布鲁氏菌的基于微滴数字PCR方法扩增用引物和探针，所述引物和探针用于检测布鲁氏菌的BCSP 31片段。
具体所述的引物和探针为：
上游引物：5′-CCTCACGGAAGACGATATCAAG-3′(SEQ ID NO：1)；
下游引物：5′-AGCCGCCCACAAAGAAATA-3′(SEQ ID NO：2)；
探针：5′-FAM-AGGCGAGAGGCTGAAAGATGGTG-BHQ1-3′(SEQ ID NO：3)；
所述探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰，荧光报告基团为FAM；荧光淬灭基团为BHQ1。
上述的引物和探针用于制备微滴数字PCR检测试剂盒。
进一步，本发明还提供一种微滴数字PCR检测动物布鲁氏菌的方法，具体步骤如下：
1)提取待检测对象的核酸样品；
2)将微滴制备仪接通电源进行预热，放入收集反应体系的8联管，根据待检样品数，在控制电脑上选择相应孔道；
3)在反应缓冲液(dPCR Mix)中加入上游引物、下游引物和探针，再加入步骤1)中得到的核酸样品，充分混合，得到水相反应体系；
4)将微液滴生成芯片装入芯片适配件，在水相溶液孔中加入步骤3)得到的水相反应体系，在油相溶液孔中加入微滴生成油，盖上微滴生成密封盖，放入微滴制备仪生成微滴；
5)制备结束后，将收集反应体系的8联管取出，进行PCR反应；
6)微滴检测仪接通电源进行预热，将装有反应体系的8联管放入微液滴检测芯片适配件中，微液滴检测芯片放入适配件，确保芯片将8联排管盖刺穿，在芯片孔位加入检测试剂，盖上微液滴检测芯片密封垫盖，放入微滴检测仪中进行样本检测。
进一步，所述引物和探针的终浓度分别为300nM～1μM和150nM～500nM。
优选地，所述上游引物和下游引物的终浓度为800nM，
进一步，所述PCR反应温度为48.4～63.3℃。
优选地，所述PCR反应温度为54.5℃。
本发明相比于现有技术具有如下的优点：
1)本发明提供的引物和探针适用于基于微滴数字PCR法检测，并且能够准确地检测出布鲁氏菌，与猪链球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、苍白念珠菌、牛分枝杆菌无交叉反应，特异性达100％；
2)本发明提供的检测方法快速、容易实现高通量，本发明提供的基于微滴数字PCR法检测动物布鲁氏菌病的方法，操作简便，重复性好，检测限低、灵敏度高，反应检测灵敏度可达到单个拷贝，可实现对样品的绝对定量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图和附表作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图和附表仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图和附表获得其他的附图和附表。
图1：本发明引物探针组合筛选结果图；
图2：本发明引物探针最佳浓度结果图；
图3：本发明引物探针最佳退火温度结果图；
图4：本发明梯度稀释布鲁氏菌BCSP 31质粒后灵敏度检测结果图；
图5：本发明布鲁氏菌BCSP 31质粒的特异性检测结果图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图和附表，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
选择布鲁氏菌BCSP 31基因保守序列进行引物、探针设计在Gene bank中找到相应的全基因序列(www.ncbi.nlm.nih.gov)，运用Blast进行同源性分析和序列分析，筛出牛分枝杆菌BCSP 31基因高度保守序列如下：
TTATTTCAGCACGCCCGCTTCCTTGTAAAAGCGTTCTGCGCCGGGATGCAGCGGAATACCGAGGCTGCTCGTCGCACTATCGAGCTTGATGAGCTTGCCCTTCGCATGGCCCGCATCGAGTGCCTTGCGTGTATCCTCGTTCCAGAGAACCTTGGTGATGTTATAGATGAGGTCGTCCGGCTGCTTGGCGCTCGTCACCCACTGTGCGGCAACGGCAAGGGTCGGTGTTTCCGCCACGTCCTTATAGGCTCCGGCAGGAACCACATCCTTCGAGAAGAAGGAATATTTCTCCAGAATCTTGTCCGCTTCCGGCCCGGAGATCGGAACGAGCGAAATACCGTTCGAGATGGCCAGTTCCGAGATTGCGCCCGTCGGATAGCCGCCCACAAAGAAATAGGCGTCCAGCGCACCATCTTTCAGCCTCTCGCCTGCCGGTCCCGGCTTCAGGTGTTCAGCCTTGATATCGTCTTCCGTGAGGCCGTAGGCTTCAAGAACGATACGCGCATCGACGATGGTGCCAGAACCCGGCTCATCCAGCGAAACGCGCTTGCCTTTCAGGTCTGCGACCGATTTGATGTTTGCATCCTTACGCGCAACGATATGGATCGTTTCCGGGTAAAGCGTCGCCAGAAGGCGCAAATCTTCCACCTTGCCCTTGCCATCATAAAGGCCGGTGCCGTTATAGGCCCAATAGGCAACGTCTGACTGCGTAAAGCCGGACTCCAGAGCGCCCGACTTGATCGCATTGATATTGGCAACCGAGCCATTCGACGAAACGGCCGTCGCGACGAGACCCGGCACGCCCTTTTCGCCTGCGCCGGAAATCGCGTTCGCGATCAGACCACCAATCGGATAATAGGTTCCGGCTGTGCCGCCAGTGCCGATACGGAAAAATGTCGGGGCCTGTGCAACCGCAAAGCTCGCTCCCAACGCAATCGCGCCCGCCACCGCTGCAACAGCCAAGCGACGGATTTTGCTTCCGAATTTCAT；
以筛选获得的高度保守序列作为检测目的基因片段，并进行引物、探针设计筛选检测。
根据以上布鲁氏菌BCSP 31基因保守序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成DNA质粒，载体质粒为PUC57。
1)引物设计
根据布鲁氏菌BCSP 31基因保守序列，设计微滴数字PCR方法检测用的引物，长度20～24bp，序列如下表1：
表1：本发明用于筛选的引物探针组合信息表；
由于微滴数字PCR与荧光PCR所用引物探针相同，因此首先利用荧光PCR来确定微滴数字PCR的最佳引物。如图1和表2荧光PCR结果所示，在3组引物探针中，第2组在相同的11个梯度含BCSP 31的质粒浓度下，CT值相对较低，荧光值相对较高，则优选为第二组，具体为：
Digital PCR-F2：5’-CCTCACGGAAGACGATATCAAG-3’；
Digital PCR-P2：5’-FAM-AGGCGAGAGGCTGAAAGATGGTG-BHQ1-3’；
Digital PCR-R2：5’-AGCCGCCCACAAAGAAATA-3’。
表2：本发明引物探针组合筛选结果表
2)引物和探针的最佳浓度
为确定引物和探针的最佳浓度，按梯度分别设置了8组引物和探针浓度进行微滴数字PCR，如下表3所示：
表3：引物和探针的最佳浓度筛选表
1
2
3
4
5
6
7
8
引物
300nM
400nM
500nM
600nM
700nM
800nM
900nM
1μM
探针
150nM
200nM
250nM
300nM
350nM
400nM
450nM
500nM
如图2结果所示，当上下游引物终浓度为800nM，探针浓度为400nM时，在相同的含BCSP 31的质粒浓度下，阳性液滴数的荧光信号值相对较高，并且与阴性液滴数的荧光信号值相差较大，则为微滴数字PCR的优选浓度。
3)反应的最佳退火温度
为确定引物和探针的最佳退火温度，按梯度分别设置了8组温度，分别为：48.4℃、50.1℃、52.2℃、54.5℃、57.0℃、59.3℃、61.5℃和63.3℃。
如图3结果所示，当温度为54.5℃时，在相同的含BCSP 31的质粒浓度下，阳性液滴数的荧光信号值相对较高，并且与阴性液滴数的荧光信号值相差较大，则54.5℃为微滴数字PCR的优选温度。
4)引物、探针及质粒均委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。
5)基于微滴数字PCR法检测布鲁氏菌的检测试剂，包括反应缓冲液(dPCR Mix)、微滴生成油、微滴检测油、纯化水、阳性标准品、阴性标准品、引物和探针；微滴数字PCR的反应缓冲液(dPCR Mix)包含数字PCR所需的DNA聚合酶、离子和dNTP，购自新羿制造科技(北京)有限公司，货号为23053，规格为750μl/管。合成的布鲁氏菌BCSP 31基因质粒用超微量紫外分光光度计进行浓度测定并进行拷贝数计算，按浓度梯度10倍比稀释制备8.5×10- 2copies/μl～8.5×108copies/μL标准品备用。阴性标准品为ddH2O或超纯水。引物的使用浓度为10μM；探针的使用浓度为10μM。
实施例2
基于微滴数字PCR法检测布鲁氏菌的方法，包括如下步骤：
1)将待检样本组织，按组织提取DNA方法提取核酸，-20℃保存备用；如样本为拭子、奶样、细菌培养物，采用裂解、磁珠富集、洗涤、洗脱等步骤提取核酸；
2)将微滴制备仪接通电源进行预热，放入收集反应体系的8联管，根据待检样品数，在控制电脑上选择相应孔道；
3)在15μL反应缓冲液(dPCR Mix)中加入6μL水，浓度为10μM的2.4μL上下游引物和10μM的1.2μL探针，再加入3μL步骤1)中得到的核酸样品，充分混合，得到水相反应体系；
4)将微液滴生成芯片装入芯片适配件，在水相溶液孔中加入30μL步骤3)得到的水相反应体系，在油相溶液孔中加入180μL微滴生成油，盖上微滴生成密封盖，放入微滴制备仪生成微滴；
5)制备结束后，将收集反应体系的8联管取出，进行PCR反应，反应条件为：95℃10min；接着40个循环，94℃30s，55℃60s；12℃保持；
6)微滴检测仪接通电源进行预热，将装有反应体系的8联管放入微液滴检测芯片适配件中，微液滴检测芯片放入适配件，确保芯片将8联排管盖刺穿，在芯片孔位加入检测试剂，盖上微液滴检测芯片密封垫盖，放入微滴检测仪中进行样本检测。下面对本发明引物对探针的灵敏度、重复性和特异性进行检测。
1、灵敏度实验
1)引物探针
上游引物：5’-CCTCACGGAAGACGATATCAAG-3’(Digital PCR-F2)；
下游引物：5’-AGCCGCCCACAAAGAAATA-3’(Digital PCR-R2)；
探针：5’-FAM-AGGCGAGAGGCTGAAAGATGGTG-BHQ1-3’(Digital PCR-P2)。
采用荧光报告基团(FAM)和荧光淬灭基团(BHQ1)修饰探针。
2)制备质粒阳性标准品，分别为：
阳性标准品1，含有8.5×10-2copies/μL布鲁氏菌质粒非传染性DNA片段；
阳性标准品2，含有8.5×10-1copies/μL布鲁氏菌质粒非传染性DNA片段；
阳性标准品3，含有8.5×100copies/μL布鲁氏菌质粒非传染性DNA片段；
阳性标准品4，含有8.5×101copies/μL布鲁氏菌质粒非传染性DNA片段；
阳性标准品5，含有8.5×102copies/μL布鲁氏菌质粒非传染性DNA片段；
阳性标准品6，含有8.5×103copies/μL布鲁氏菌质粒非传染性DNA片段；
阳性标准品7，含有8.5×104copies/μL布鲁氏菌质粒非传染性DNA片段；
阳性标准品8，含有8.5×105copies/μL布鲁氏菌质粒非传染性DNA片段；
阳性标准品9，含有8.5×106copies/μL布鲁氏菌质粒非传染性DNA片段；
阳性标准品10，含有8.5×107copies/μL布鲁氏菌质粒非传染性DNA片段；
阳性标准品11，含有8.5×108copies/μL布鲁氏菌质粒非传染性DNA片段。
3)灵敏度实验方法：
步骤1、配制水相反应体系(按13个反应进行配制)
在195μL反应缓冲液(dPCR Mix)中加入78μL水，浓度为10μM的31.2μL上下游引物和15.6μL探针，充分混合后得到水相反应体系。
步骤2、加样
准备2个微液滴生成芯片(每个芯片可检测8个样本)，每次吸取27μL步骤1中混匀的水相反应体系分别加入到芯片12个水相反应孔中，再分别向水相反应孔中加入11个阳性标准品和1个超纯水3μL，总体积为30μL，并做好标记；在油相溶液孔中加入180μL微滴生成油，盖上微滴生成密封盖，放入微滴制备仪生成微滴。
步骤3、PCR反应
制备结束后，将收集反应体系的8联管取出，进行PCR反应，反应条件为：95℃10min；接着40个循环，94℃30s，55℃60s；12℃保持。
步骤4、检测及结果
微滴检测仪接通电源进行预热，将装有反应体系的8联管放入微液滴检测芯片适配件中，微液滴检测芯片放入适配件，确保芯片将8联排管盖刺穿，在芯片孔位加入检测试剂，盖上微液滴检测芯片密封垫盖，放入微滴检测仪中进行样本检测。
检测结果：如图4和表4所示为微滴数字PCR灵敏度实验结果，为了确认该方法的检出限，把上述灵敏度实验重复3次，同时进行荧光定量PCR灵敏度实验比对。结果显示，微滴数字PCR的检测上线为2.5×106个拷贝，检测下线为1个拷贝。
表4：本发明数字PCR与荧光定量PCR灵敏度检测对比
2、特异性实验
1)引物、探针及阴性质控品与实施例1相同。
2)特异性实验中的猪链球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、苍白念球菌、牛分枝杆菌和布鲁氏菌的样本核酸由本实验室保存。
3)样本提取方法：
样本先进行预处理，再按天隆细菌自动提取DNA方法提取核酸，-20℃保存备用。
4)特异性实验实施方法：
步骤1、配制反应液(按10个反应进行配制)：
在150μL反应缓冲液(dPCR Mix)中加入60μL水，浓度为10μM的24μL上下游引物和12μL探针，充分混合后得到水相反应体系。
步骤2、加样
准备1个微液滴生成芯片，每次吸取27μL步骤1中混匀的水相反应体系分别加入到芯片8个水相反应孔中，再分别向水相反应孔中加入猪链球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、苍白念球菌、牛结核分支杆菌和布鲁氏菌的样本核酸各3μL，总体积为30μL，并做好标记；在油相溶液孔中加入180μL微滴生成油，盖上微滴生成密封盖，放入微滴制备仪生成微滴。
步骤3、PCR反应
制备结束后，将收集反应体系的8联管取出，进行PCR反应，反应条件为：95℃10min；接着40个循环，94℃30s，55℃60s；12℃保持。
步骤4、检测及结果
微滴检测仪接通电源进行预热，将装有反应体系的8联管放入微液滴检测芯片适配件中，微液滴检测芯片放入适配件，确保芯片将8联排管盖刺穿，在芯片孔位加入检测试剂，盖上微液滴检测芯片密封垫盖，放入微滴检测仪中进行样本检测。
检测结果如图5所示：结果显示只有布鲁氏菌核酸有明显扩增，猪链球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、苍白念球菌、牛分枝杆菌核酸无明显扩增，显示出良好的特异性。
3、重复性实验
在进行引物筛选、灵敏度试验和特异性实验时，每个样品3个重复，同时进行重复性试验；
检测结果如图1和图4所示：单个样品的三个重复所得数值标准差SD＜1，重复性较好。
实施例3实际样本检测
1)引物、探针及阴性质控品与实施例1相同。
2)实验中组织样本31个，牛奶样本31个、拭子样本31个，共计93个，由国家动物布鲁氏菌专业实验室提供；
3)样本提取方法：
样本先进行预处理(均浆)，再按天隆细菌自动提取DNA方法提取核酸，-20℃保存备用。
4)实施方法
步骤1、配制反应液(按100个反应进行配制)：
在1.5mL反应缓冲液(dPCR Mix)中加入600μL水，浓度为10μM的240μL上下游引物和120μL探针，充分混合后得到水相反应体系。
步骤2、加样
准备12个微液滴生成芯片，每次吸取27μL步骤1中混匀的水相反应体系分别加入到芯片96个水相反应孔中，再分别向水相反应孔中加入组织样本、牛奶样本或拭子样本3μL，总体积为30μL，并做好标记；在油相溶液孔中加入180μL微滴生成油，盖上微滴生成密封盖，放入微滴制备仪生成微滴。
步骤3、PCR反应
制备结束后，将收集反应体系的8联管取出，进行PCR反应，反应条件为：95℃10min；接着40个循环，94℃30s，55℃60s；12℃保持。
步骤4、检测及结果
微滴检测仪接通电源进行预热，将装有反应体系的8联管放入微液滴检测芯片适配件中，微液滴检测芯片放入适配件，确保芯片将8联排管盖刺穿，在芯片孔位加入检测试剂，盖上微液滴检测芯片密封垫盖，放入微滴检测仪中进行样本检测。
检测结果如表5所示：结果显示96例临床样本核酸通过微滴数字PCR检测方法相比荧光定量PCR检测方法的检出率和灵敏度更高，阴性对照样品无扩增，而阳性对照样品出现阳性微滴。
表5：本发明布鲁氏菌临床样本检测结果表
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 中国动物卫生与流行病学中心
<120> 一种高灵敏度检测动物布鲁氏菌病的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctcacggaa gacgatatca ag 22
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agccgcccac aaagaaata 19
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aggcgagagg ctgaaagatg gtg 23
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