一种能抑制肿瘤细胞的组合物及其相关应用
阅读说明：本技术 一种能抑制肿瘤细胞的组合物及其相关应用 (Composition capable of inhibiting tumor cells and related application thereof ) 是由 李劲 付珊珊 于 2021-08-04 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种能抑制肿瘤细胞的组合物及其相关应用,本发明的组合物包括2-苯甲酰胺基-1,4-萘醌和维生素C。本发明发现2-苯甲酰胺基-1,4-萘醌和维生素C联用可显著增加人肿瘤细胞内活性氧(ROS)的产生,能高效诱导膀胱癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌等肿瘤细胞的死亡。(The invention provides a composition capable of inhibiting tumor cells and related application thereof, wherein the composition comprises 2-benzamido-1, 4-naphthoquinone and vitamin C. The invention discovers that the combination of 2-benzamido-1, 4-naphthoquinone and vitamin C can obviously increase the generation of Reactive Oxygen Species (ROS) in human tumor cells, and can efficiently induce the death of tumor cells such as bladder cancer, lung cancer, breast cancer, colon cancer, cervical cancer and the like.)
技术领域
本发明是关于一种能抑制肿瘤细胞的组合物及其相关应用，具体地说，是关于2-苯甲酰胺基-1,4-萘醌和维生素C联合用于治疗肿瘤的技术。
背景技术
癌症的类型很多，如膀胱癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌等，其致死率也很高，具体的治疗要看肿瘤所处的阶段。目前临床上主要是通过手术切除癌变组织、化疗、放疗、免疫治疗的方法来帮助缓解癌症的症状。对于早期的癌症患者，主要是通过手术的方法来达到根治疾病的目的。对于一些中晚期的患者，无法进行手术治疗，此时一般是通过化疗和放疗的方法，来帮助杀灭体内的癌细胞，以维持患者的生命健康。
2-苯甲酰胺基-1,4-萘醌(2-benzamido-1,4-naphthoquinoe，又名NQN1，PPM-18)结构式如下：
2-苯甲酰胺基-1,4-萘醌的中心结构是一个萘醌环，和许多VK化合物类似。据文献报道，2-苯甲酰胺基-1,4-萘醌可以在体内体外抑制NF-κB的激活，通过这种作用，它抑制了脂多糖处理的巨噬细胞中iNOS(诱导型一氧化氮合成酶)的表达，从而抑制炎症和败血症的发生。同时，它也是HDAC(组蛋白去乙酰化酶)的抑制剂。此外，2-苯甲酰胺基-1,4-萘醌能够通过扮演一个在线粒体呼吸链(电子传递链上)电子载体的角色而增强线粒体电子传递链上的电子传递，增强线粒体有氧呼吸(氧气消耗)，推动线粒体呼吸链的ATP合成，从而可以抑制斑马鱼和小鼠的癫痫。CN 109172557 A报道了2-苯甲酰胺基-1,4-萘醌在较高剂量下诱导膀胱癌细胞凋亡的作用。
当前仍需要开发更为安全有效的治疗肿瘤的药物。
发明内容
本发明的一个目的在于开发一种安全高效的可针对多种肿瘤的抗癌组合物。
本发明的另一目的在于提供所述组合物的相关应用。
本案发明人在研究中发现，2-苯甲酰胺基-1,4-萘醌和维生素C(Vitamin C)联合应用，对膀胱癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌等肿瘤细胞具有明显的抑制作用。通过进行抗膀胱癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌细胞活性实验和细胞安全性实验研究发现，2-苯甲酰胺基-1,4-萘醌和维生素C联合应用，在低浓度情况下时即可对于膀胱癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌等肿瘤细胞具有高效的细胞活力抑制效果，而对人正常细胞(如肝细胞)未引起明显的细胞毒性作用。
从而，一方面，本发明提供了一种组合物，其包括2-苯甲酰胺基-1,4-萘醌和维生素C。
本发明的组合物，能抑制肿瘤细胞，具体包括抑制肿瘤细胞的活力和/或诱导肿瘤细胞凋亡。
本发明的组合物，其中2-苯甲酰胺基-1,4-萘醌和维生素C可以各自的有效量联合应用，以达到抑制肿瘤细胞的效果。
根据本发明的具体实施方案，本发明的组合物中，2-苯甲酰胺基-1,4-萘醌与维生素C的用量比例为(1μM-5μM)：(1mM-5mM)。
根据本发明的具体实施方案，本发明的组合物中，所述2-苯甲酰胺基-1,4-萘醌可以为化学合成的。
根据本发明的具体实施方案，本发明的组合物中，所述维生素C是指苏糖型-2,3,4,5,6-五羟基-2-己烯酸-4-内酯，其可以为天然提取得到的或化学合成的。
根据本发明的具体实施方案，本发明的组合物中，还可包括一种或多种医药上可接受的辅料，例如崩解剂、稀释剂、赋形剂等。
根据本发明的具体实施方案，本发明的组合物可以是实验用试剂材料，也可以是药物，例如可以是各种适合施予受试者的剂型，例如注射剂等。
另一方面，本发明还提供了所述的组合物在制备用于抑制肿瘤细胞、治疗肿瘤和/或延长肿瘤患者生存期的药物和/或制剂中的应用。
本发明中，所述“治疗”包括改善、预防或逆转疾病或失调或其至少一种明显的症状，改善、预防或逆转与正在治疗的疾病或失调相关的至少一种可测量的物理参数，和/或在身体上(例如，明显症状的稳定)和/或生理上(例如，物理参数的稳定)抑制或减缓疾病或失调的进展。
根据本发明的具体实施方案，本发明的组合物在应用时，2-苯甲酰胺基-1,4-萘醌与维生素C可分别给予或是混合后给予受试者。当2-苯甲酰胺基-1,4-萘醌与维生素C分别给予受试者时，可在同一时间段内、或是间隔时间内给予受试者。
根据本发明的优选具体实施方案，本发明的组合物在应用时，2-苯甲酰胺基-1,4-萘醌与维生素C应以有效量的剂量给予受试者。本发明的实验研究表明，2-苯甲酰胺基-1,4-萘醌与肿瘤细胞接触的有效量可为5μM或更低，例如1μM-5μM；维生素C与肿瘤细胞接触的有效量可为5mM或更低，例如1mM-5mM。
根据本发明的具体实施方案，本发明的组合物的应用中，所述抑制肿瘤细胞、治疗肿瘤和/或延长肿瘤患者生存期包括：抑制肿瘤细胞的活力和/或诱导肿瘤细胞凋亡。即，其中，本发明还提供了包括2-苯甲酰胺基-1,4-萘醌和维生素C的组合物在制备用于抑制肿瘤细胞的活力和/或诱导肿瘤细胞凋亡的制剂中的应用。
根据本发明的具体实施方案，本发明的组合物的应用中，所述肿瘤选自膀胱癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌中的一种或多种。
根据本发明的具体实施方案，本发明的组合物的应用中，所述组合物是通过激发细胞内产生ROS而诱导肿瘤细胞凋亡。
根据本发明的具体实施方案，本发明的组合物的应用中，所述治疗肿瘤包括在细胞水平和/或个体水平治疗肿瘤。
根据本发明的具体实施方案，本发明的组合物的应用中，所述组合物对人正常肝细胞无显著活力抑制作用。
在本发明的一些具体实施方案中，本案发明人通过体外实验证实了2-苯甲酰胺基-1,4-萘醌与维生素C联合用药对膀胱癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌的抑制作用。发现2-苯甲酰胺基-1,4-萘醌与维生素C在低浓度情况下时联合用药，对于膀胱癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌细胞具有更高效的细胞活力抑制效果，而对人正常细胞(如肝细胞)未引起明显的细胞毒性作用。此外，维生素C的加入可显著降低在抑制上述人肿瘤细胞的活性和诱导上述人肿瘤细胞死亡过程中2-苯甲酰胺基-1,4-萘醌的用药剂量，降低副作用和成本。综合考虑，2-苯甲酰胺基-1,4-萘醌与维生素C联用适合作为治疗包括膀胱癌在内的人肺癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌的新药物。
附图说明
图1A与图1B为PPM-18和Vitamin C联合用药抑制膀胱癌细胞EJ、T24细胞活力和克隆形成，而对人正常细胞L02无明显细胞活力抑制效应的实验结果。其中，图1A显示PPM-18和Vitamin C联合用药抑制EJ、T24细胞活力，对L02无明显抑制效应。图1B显示PPM-18和Vitamin C联合用药抑制EJ、T24细胞的克隆形成能力。以上结果均显示单一药物作用时无明显抑制效应。
图2A和图2B显示了PPM-18和Vitamin C联合用药诱导膀胱癌细胞EJ、T24自噬实验结果。图2A，电镜图片显示PPM-18和Vitamin C联合用药诱导EJ自噬小体产生。图2B，western bolt检测自噬相关蛋白LC3B的表达(β-actin作为内参)。
图3A和图3B显示PPM-18和Vitamin C联合用药通过产生细胞内ROS诱导膀胱癌细胞死亡实验结果。其中，图3A，PPM-18和Vitamin C联合用药诱导膀胱癌细胞T24、EJ中ROS的产生；图3B，PPM-18和Vitamin C联合用药通过产生ROS来诱导膀胱癌细胞T24、EJ死亡。
图4A与图4B为PPM-18和Vitamin C联合用药抑制非小细胞肺癌A549细胞、三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞、宫颈癌HeLa细胞、结直肠癌HCT-116细胞等多种癌细胞系细胞活力和克隆形成。其中，图4A显示PPM-18和Vitamin C联合用药抑制多种癌细胞系细胞活力。图4B显示PPM-18和Vitamin C联合用药抑制多种癌细胞系的克隆形成能力。以上结果均显示单一药物作用时无明显抑制效应。
图5A和图5B显示PPM-18和Vitamin C联合用药通过产生细胞内ROS诱导其他癌细胞系死亡实验结果，以非小细胞肺癌A549细胞为例。其中，图5A，PPM-18和Vitamin C联合用药通过产生ROS来诱导非小细胞肺癌A549细胞死亡；图5B，PPM-18和Vitamin C联合用药通过产生细胞内ROS来抑制非小细胞肺癌细胞克隆形成能力。
图6A与图6B为PPM-18和Vitamin C联合用药对人正常细胞L02无明显细胞活力抑制效应的实验结果。其中，图6A显示PPM-18和Vitamin C联合用药对L02细胞活力无明显抑制效应。图6B显示PPM-18和Vitamin C联合用药对L02细胞克隆形成能力没有明显影响。
无特殊说明情况下，结果图中显示的P均为5μM的PPM-18的缩写，C均为5mM的Vitamin C的缩写，P+C为5μM的PPM-18和5mM的Vitamin C联合用药。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例中所用的PPM-18和Vitamin C为化学合成的药物，其中PPM-18母液(DMSO溶解)保存在-80℃中，其水溶液现配现用，且注意避光；Vitamin C母液(灭菌双蒸水溶解)保存在-80℃中，其水溶液现配现用，且注意避光。
实施例1、PPM-18和Vitamin C联合用药可以抑制膀胱癌细胞活力和克隆的形成，而对正常细胞无明显活力抑制作用
本实施例中，PPM-18和Vitamin C联合用药抑制膀胱癌细胞活力实验主要包括以下步骤：
(1-1)细胞培养：将实验用膀胱癌细胞和人正常肝细胞进行体外培养，待细胞长到对数生长期，进行消化传代种板；
(1-2)种96孔板：将膀胱癌细胞系EJ和T24用含10％胎牛血清培养液制成单个细胞悬液，以每孔10000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μl，培养至细胞丰度达到80％-90％(一般培养24h)；
(1-3)加药处理：培养24h后，轻轻吸取掉旧培养液，用5μM的PPM-18和5mM的Vitamin C联合用药以及5μM的PPM-18和5mM的Vitamin C单一药物分别处理培养的细胞，加药处理时间24h；
(1-4)MTT检测：培养24h后，每孔加入20μL的MTT检测试剂，37℃避光孵育1-2h，然后选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果，并根据记录结果，绘制PPM-18和Vitamin C联合用药的细胞活力检测结果图。
PPM-18和Vitamin C联合用药抑制膀胱癌细胞克隆形成实验主要包括以下实验步骤：
(1-a)细胞培养：将实验用膀胱癌细胞进行体外培养，待细胞长到对数生长期，进行消化传代种板；
(1-b)收集细胞：将培养瓶中生长到对数生长期的膀胱癌细胞(细胞数约为5*106)，PBS润洗，加入胰蛋白酶于37℃细胞培养箱中消化2分钟，然后加入含胎牛血清的MEM培养基终止消化作用，并转移到15ml离心管中，于1500rpm，离心5min；
(1-c)稀释种板：离心结束，弃掉上清液，留下细胞沉淀，并加入1ml新鲜的MEM培养液，轻柔吹打混匀，同时，取2只1.5ml的EP管，分别加入1ml新鲜的MEM培养液。取15ml离心管中的细胞悬液100μL加入到其中的一只1.5ml EP管中，轻轻吹打混匀，然后从中取出100μL加入到另一只1.5ml EP管中，再次轻轻吹打混匀。然后从第二只1.5ml EP管中取出100μL加入到装有12ml新鲜MEM培养液的15ml离心管中，混匀后种12孔板，每孔1ml。以这种方式稀释种板，12孔板中每孔约200-500个细胞；
(1-d)加药处理：待12孔板中的细胞贴壁培养4-7天后，吸掉旧培养液，加入5μM的PPM-18和5mM的Vitamin C联合用药以及5μM的PPM-18和5mM的Vitamin C单一药物，刺激1h，然后吸掉含药物培养基，加入不含药物的新鲜MEM培养液继续培养4-7天；
(1-e)克隆形成：待形成肉眼可见的细胞克隆后，终止培养。吸取掉板中的旧培养液，每孔加入1ml PBS润洗一遍，然后加入无水甲醇固定10分钟，用PBS洗涤三次，再加入结晶紫染色30分钟，并于30分钟后，PBS润洗3-4遍，然后将板子避光干燥，并拍照留存。
实验结果请参见图1A和图1B。结果说明：计算PPM-18和Vitamin C分别对膀胱癌细胞的IC50以筛选联合浓度。如图1A所示，选取了0μM、5μM、10μM、15μM、20μM，这6个浓度的PPM-18，以及0mM、5mM、10mM、15mM、20mM，这6个浓度的Vitamin C分别加药处理膀胱癌细胞T24，24h，发现PPM-18和Vitamin C均呈现浓度梯度依赖的方式抑制癌细胞活力，并通过计算IC50，得出PPM-18对T24的IC50为9.043μM，Vitamin C对T24的IC50为8.652mM，同时根据PPM-18和Vitamin C的最适比例1:1000为基础，计算出PPM-18和Vitamin C联合用药对T24细胞的IC50为2.422，其中PPM-18：2.422μM，Vitamin C：2.422mM。确定了对膀胱癌细胞无杀伤5μM的PPM-18和5mM的Vitamin C进行联合用药用于接下来的研究。通过MTT实验，得出PPM-18和Vitamin C联合用药能够有效抑制膀胱癌细胞的活力，而对人正常肝细胞无明显抑制作用。MTT实验可以短期快速验证药物对细胞的作用，接下来用细胞克隆实验来进一步验证PPM-18和Vitamin C联合用药在长期增殖中对膀胱癌的作用效果。如图1B所示，在PPM-18和Vitamin C联合用药处理下，其对克隆形成抑制效果显著，而两种单独的药物都没有起到明显抑制作用，说明5μM的PPM-18和5mM的Vitamin C进行联合用药具有协同杀死膀胱癌细胞的作用。
实施例2、PPM-18和Vitamin C联合用药可以诱导膀胱癌细胞自噬
本实施例中，用电镜拍照显示自噬小体，主要包括以下实验步骤：
(2-1)细胞培养：将培养瓶中的细胞在37℃、5％的CO2的细胞培养箱中培养至细胞处于对数生长期；
(2-2)细胞种板：将需要传代的细胞加入PBS润洗、胰酶消化后，加入12mL的新鲜的培养液轻轻吹打混匀，种6孔板，每孔2mL细胞悬液，上下左右来回晃动5次，置于细胞培养箱中培养48h，培养24h时换液一次。
(2-3)加药处理：细胞培养48h后，当细胞处于90％-100％的丰度，加5μM的PPM-18和5mM的Vitamin C联合用药，并设置无药物添加对照组，处理20h左右。
(2-4)细胞收集：20h后，将6孔板中的细胞收集于15ml离心管中，转速1000rpm离心5分钟，弃去上清液后加入PBS缓冲液1ml离心洗涤1次。
(2-5)细胞固定：将细胞沉淀用1mL 2.5％戊二醛电镜固定液进行固定，并转移到1.5mL离心管中，密封，标记日期、药物处理类型及细胞系种类。
(2-6)电镜拍摄：将2.5％戊二醛电镜固定液固定好的细胞交由武汉谷歌生物进行自噬小体的拍摄。
采用western blot检测细胞自噬包括以下步骤：
(2-a)细胞培养：将培养瓶中的细胞在37℃、5％的CO2的细胞培养箱中培养至细胞处于对数生长期；
(2-b)细胞种板：将处于对数生长期的细胞加入PBS润洗消化后，加入12ml的新鲜的培养液轻轻吹打混匀，种6孔板，每孔2ml细胞悬液，上下左右来回晃动5次，置于细胞培养箱中培养48h，培养24h时换液一次；
(2-c)加药处理：48h后，细胞处于90％-100％的丰度，然后加5μM的PPM-18和5mM的Vitamin C联合用药以及5μM的PPM-18和5mM的Vitamin C单一药物处理20h；
(2-d)提取样品蛋白：去除含药物培养液后加1ml PBS冲洗一遍；然后加入含有磷酸酶抑制剂的裂解液，在冰上裂解30min；12000rpm，离心20min，收集上清；进行蛋白浓度测定；加入蛋白上样缓冲液，100℃，煮沸5min，进行蛋白变性；
(2-e)电泳：配置10％的分离胶，5％的浓缩胶；根据蛋白浓度，决定上样体积；跑电泳，初始电压80V，跑30min，之后调成电压100V，跑1.5h；根据目标蛋白分子量，进行切胶操作；
(2-f)转膜：将切下的胶置于转膜板上，按照三明治模型加上海绵、滤纸和PVDF膜。设置电流300mA，转膜1h；
(2-g)封闭和孵抗：将含有目的蛋白的PVDF膜放置于脱脂牛奶中室温摇床封闭3h；一抗(1:2000稀释)4℃摇床过夜；二抗(1：10000稀释)，室温摇床避光孵育3h；TBST洗涤3次，每次30min；
(2-h)显影。
结果参见图2A和图2B。结果说明：PPM-18和Vitamin C联合用药可以诱导膀胱癌细胞自噬。如图2A所示，在EJ细胞电镜图中，联合用药处理组的细胞，可以观察到自噬小体的产生，而对照组没有发现。本实施例中，通过Western blot实验进一步验证自噬的产生，结果参见图2B。经PPM-18和Vitamin C联合用药处理后，膀胱癌T24和EJ细胞内LC3BII蛋白表达发生极大程度上调，分别是对照组的2.76倍和2.98倍。
实施例3、PPM-18和Vitamin C联合用药通过产生细胞内ROS诱导膀胱癌细胞死亡
本实施例中，PPM-18和Vitamin C联合用药诱导膀胱癌细胞产生ROS包括以下几个步骤：
(3-1)细胞培养：将培养瓶中的细胞在37℃、5％的CO2的细胞培养箱中培养至细胞处于对数生长期；
(3-2)细胞种板：将处于对数生长期的细胞加入PBS润洗、胰酶消化后，加入12ml的新鲜的培养液轻轻吹打混匀，种6孔板，每孔2ml细胞悬液，上下左右来回晃动5次，置于细胞培养箱中培养48h，培养24h时换液一次；
(3-3)加药处理：48h后，细胞处于90％-100％的丰度，然后加联合药物诱导ROS产生，各组分别为不加药物的对照组、5μM的PPM-18单一药物、5mM的Vitamin C单一药物和5μM的PPM-18和5mM的Vitamin C联合用药，处理6h；
(3-4)收集细胞：6h后，将6孔板中的细胞收集于15ml离心管中，转速1500rpm离心5分钟，弃去上清液后加入PBS缓冲液1ml离心洗涤1次；
(3-5)加入ROS探针DCFH-DA：北京普利莱的活性氧检测试剂盒(母液浓度为10mM)，按照1：10000的稀释比用PBS稀释DCFH-DA，然后每管加入500μL的含稀释后的DCFH-DA探针，放入细胞培养箱中孵育30分钟，期间每隔10分钟混匀一次；
(3-6)流式分析仪检测ROS水平：将培养箱中孵育后的样本用PBS洗涤两遍，然后每管再加入500μL的PBS重悬，上流式分析仪检测ROS水平。
PPM-18和Vitamin C联合用药通过产生细胞内ROS来诱导膀胱癌细胞死亡包括以下步骤：
(3-a)细胞培养：将实验用膀胱癌细胞进行体外培养，待细胞长到对数生长期，进行消化传代种板；
(3-b)种96孔板：将膀胱癌细胞系EJ和T24用含10％胎牛血清培养液制成单个细胞悬液，以每孔10000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μl，培养至细胞丰度达到80％-90％(一般培养24h)；
(3-c)加药处理：培养24h后，轻轻吸掉旧培养液，然后加PPM-18+Vitamin C联合用药和NAC(清除细胞内ROS)共处理(各分组分别为对照组、6mM的NAC组、5μM的PPM-18和5mM的Vitamin C联合用药组、5μM的PPM-18和5mM的Vitamin C联合用药+6mM的NAC组)，处理24h；
(3-d)MTT检测：培养24h后，每孔加入20μL的MTT检测试剂，37℃避光孵育1-2h，然后选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果，并根据记录结果，绘制PPM-18+Vitamin C联合用药和NAC(清除细胞内ROS)共处理细胞活力效果检测结果图。
本实施例中检测了细胞内ROS的水平。图3A和图3B显示本实施例中PPM-18和Vitamin C联合用药通过产生细胞内ROS诱导膀胱癌细胞死亡实验结果。如图3A所示，当加入5μM浓度的PPM-18时和5mM浓度的Vitamin C时，ROS的水平相较于对照组以及单独药物处理组呈现显著上升趋势，证明了PPM-18和Vitamin C联合用药确实可以诱导膀胱癌细胞T24和EJ的ROS的产生。相较于对照组，PPM-18和Vitamin C联合用药处理组ROS的水平均达到对照组的2-3倍。接下来验证ROS是否是PPM-18和Vitamin C联合用药诱导膀胱癌细胞死亡的因素。本实施例使用了ROS的清除剂NAC(清除细胞内总ROS)，通过MTT检测，如图3B所示，发现当加入PPM-18和Vitamin C联合用药和NAC共处理时，可以显著拯救PPM-18和Vitamin C联合用药所诱导的癌细胞死亡。
综上所述，PPM-18可以通过使细胞内产生ROS，来诱导膀胱癌细胞死亡。
实施例4、PPM-18和Vitamin C联合用药可以抑制多种癌细胞系(肺癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌)细胞活力和克隆的形成
本实施例中，PPM-18和Vitamin C联合用药抑制肺癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌癌细胞系细胞活力实验主要包括以下步骤：
(4-1)细胞培养：将实验用癌细胞进行体外培养，待细胞长到对数生长期，进行消化传代种板；
(4-2)种96孔板：将多种癌细胞系细胞用含10％胎牛血清培养液制成单个细胞悬液，以每孔10000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μl，培养至细胞丰度达到80％-90％(一般培养24h)；
(4-3)加药处理：培养24h后，轻轻吸掉旧培养液，用5μM的PPM-18和5mM的VitaminC联合用药以及5μM的PPM-18和5mM的Vitamin C单一药物分别处理培养的细胞，加药处理时间24h；
(4-4)MTT检测：培养24h后，每孔加入20μL的MTT检测试剂，37℃避光孵育1-2h，然后选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果，并根据记录结果，绘制PPM-18和Vitamin C联合用药的细胞活力检测结果图。
PPM-18和Vitamin C联合用药抑制肺癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌癌细胞系多种癌细胞系细胞克隆形成实验主要包括以下实验步骤：
(4-a)细胞培养：将实验用癌细胞进行体外培养，待细胞长到对数生长期，进行消化传代种板；
(4-b)收集细胞：将培养瓶中生长到对数生长期的癌细胞(细胞数约为5*106)，PBS润洗，加入胰蛋白酶于37℃细胞培养箱中消化2分钟，然后加入含胎牛血清的MEM培养基终止消化作用，并转移到15ml离心管中，于1500rpm，离心5min；
(4-c)稀释种板：离心结束，弃掉上清液，留下细胞沉淀，并加入1ml新鲜的MEM培养液，轻柔吹打混匀，同时，取2只1.5ml的EP管，分别加入1ml新鲜的MEM培养液。取15ml离心管中的细胞悬液100μL加入到其中的一只1.5ml EP管中，轻轻吹打混匀，然后从中取出100μL加入到另一只1.5ml EP管中，再次轻轻吹打混匀。然后从第二只1.5ml EP管中取出100μL加入到装有12ml新鲜MEM培养液的15ml离心管中，混匀后种12孔板，每孔1ml。以这种方式稀释种板，12孔板中每孔约200-500个细胞；
(4-d)加药处理：待12孔板中的细胞贴壁培养4-7天后，吸掉旧培养液，加入5μM的PPM-18和5mM的Vitamin C联合用药以及5μM的PPM-18和5mM的Vitamin C单一药物，刺激1h，然后吸取掉含药物培养基，加入不含药物的新鲜MEM培养液继续培养4-7天；
(4-e)克隆形成：待形成肉眼可见的细胞克隆后，终止培养。吸取掉板中的旧培养液，每孔加入1ml PBS润洗一遍，然后加入无水甲醇固定10分钟，用PBS洗涤三次，再加入结晶紫染色30分钟，并于30分钟后，PBS润洗3-4遍，然后将板子避光干燥，并拍照留存。
实验结果请参见图4A和图4B。结果说明：PPM-18和Vitamin C联合用药可以抑制多种癌细胞系细胞活力和克隆的形成。如图4A所示，通过MTT实验，得出PPM-18和Vitamin C联合用药能够有效抑制不同多种癌细胞系细胞的活力。MTT实验可以短期快速验证药物对细胞的作用，接下来用细胞克隆实验来进一步验证PPM-18和Vitamin C联合用药在长期增殖中对多种癌细胞的作用效果。如图4B所示，在PPM-18和Vitamin C联合用药处理下，其对克隆形成抑制效果显著。而两种单独的药物都没有起到明显抑制作用，说明5μM的PPM-18和5mM的Vitamin C进行联合用药具有协同杀死多种不同癌细胞系细胞的作用。
实施例5、PPM-18和Vitamin C联合用药通过产生细胞内ROS诱导非小细胞肺癌细胞死亡
PPM-18和Vitamin C联合用药通过激活产生细胞内ROS来诱导非小细胞肺癌A549细胞死亡包括以下步骤：
(5-1)细胞培养：将实验用非小细胞肺癌进行体外培养，待细胞长到对数生长期，进行消化传代种板；
(5-2)种96孔板：将非小细胞肺癌A549细胞，用含10％胎牛血清培养液制成单个细胞悬液，以每孔10000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μl，培养至细胞丰度达到80％-90％(一般培养24h)；
(5-3)加药处理：培养24h后，轻轻吸掉旧培养液，然后加PPM-18+Vitamin C联合用药和NAC(清除细胞内ROS)共处理(各分组分别为对照组、6mM的NAC组、5μM的PPM-18和5mM的Vitamin C联合用药组、5μM的PPM-18和5mM的Vitamin C联合用药+6mM的NAC组)，处理24h；
(5-4)MTT检测：培养24h后，每孔加入20μL的MTT检测试剂，37℃避光孵育1-2h，然后选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果，并根据记录结果，绘制PPM-18+Vitamin C联合用药和NAC(清除细胞内ROS)共处理细胞活力效果检测结果图。
PPM-18和Vitamin C联合用药通过产生细胞内ROS来抑制非小细胞肺癌细胞克隆形成能力包括以下步骤：
(5-a)细胞培养：将实验用非小细胞肺癌进行体外培养，待细胞长到对数生长期，进行消化传代种板；
(5-b)收集细胞：将培养瓶中生长到对数生长期的非小细胞肺癌(细胞数约为5*106)，PBS润洗，加入胰蛋白酶于37℃细胞培养箱中消化2分钟，然后加入含胎牛血清的MEM培养基终止消化作用，并转移到15ml离心管中，于1500rpm，离心5min；
(5-c)稀释种板：离心结束，弃掉上清液，留下细胞沉淀，并加入1ml新鲜的MEM培养液，轻柔吹打混匀，同时，取2只1.5ml的EP管，分别加入1ml新鲜的MEM培养液。取15ml离心管中的细胞悬液100μL加入到其中的一只1.5ml EP管中，轻轻吹打混匀，然后从中取出100μL加入到另一只1.5ml EP管中，再次轻轻吹打混匀。然后从第二只1.5ml EP管中取出100μL加入到装有12ml新鲜MEM培养液的15ml离心管中，混匀后种12孔板，每孔1ml。以这种方式稀释种板，12孔板中每孔约200-500个细胞；
(5-d)加药处理：待12孔板中的细胞贴壁培养4-7天后，吸掉旧培养液，加入5μM的PPM-18和5mM的Vitamin C联合用药以及5μM的PPM-18和5mM的Vitamin C单一药物，刺激1h，然后吸掉含药物培养基，加入不含药物的新鲜MEM培养液继续培养4-7天；
(5-e)克隆形成：待形成肉眼可见的细胞克隆后，终止培养。吸掉板中的旧培养液，每孔加入1ml PBS润洗一遍，然后加入无水甲醇固定10分钟，用PBS洗涤三次，再加入结晶紫染色30分钟，并于30分钟后，PBS润洗3-4遍，然后将板子避光干燥，并拍照留存。
图5A和图5B显示本实施例中PPM-18和Vitamin C联合用药通过产生细胞内ROS诱导其他癌细胞系细胞死亡实验结果。如图5A所示，验证ROS是否是PPM-18和Vitamin C联合用药诱导非小细胞肺癌A549细胞死亡的因素。本实施实例使用了ROS的清除剂NAC(清除细胞内总ROS)，通过MTT检测，如图5B所示，发现当加入PPM-18和Vitamin C联合用药和NAC共处理时，可以显著拯救PPM-18和Vitamin C联合用药所诱导的癌细胞死亡。
接下来用细胞克隆实验来进一步验证PPM-18和Vitamin C联合用药通过产生细胞内ROS对多种癌细胞的长期增殖产生抑制效果。如图5B所示，在PPM-18和Vitamin C联合用药处理下，其对克隆形成抑制效果显著。而两种单独的药物都没有起到明显抑制作用，说明5μM的PPM-18和5mM的Vitamin C进行联合用药具有协同杀死多种癌细胞系细胞的作用。
综上所述，PPM-18可以通过使细胞内产生ROS，来诱导其他癌细胞系细胞死亡。
实施例6、PPM-18和Vitamin C联合用药对人正常肝细胞L02无明显活力抑制作用
本实施例中，研究PPM-18和Vitamin C联合用药对L02细胞活力的影响实验主要包括以下步骤：
(6-1)细胞培养：将实验用人正常肝细胞进行体外培养，待细胞长到对数生长期，进行消化传代种板；
(6-2)种96孔板：将正常细胞L02用含10％胎牛血清培养液制成单个细胞悬液，以每孔10000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μl，培养至细胞丰度达到80％-90％(一般培养24h)；
(6-3)加药处理：培养24h后，轻轻吸取掉旧培养液，用5μM的PPM-18和5mM的Vitamin C联合用药以及5μM的PPM-18和5mM的Vitamin C单一药物分别处理培养的细胞，加药处理时间24h；
(6-4)MTT检测：培养24h后，每孔加入20μL的MTT检测试剂，37℃避光孵育1-2h，然后选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果，并根据记录结果，绘制PPM-18和Vitamin C联合用药的细胞活力检测结果图。
研究PPM-18和Vitamin C联合用药对L02细胞克隆形成影响实验主要包括以下实验步骤：
(6-a)细胞培养：将实验用正常细胞进行体外培养，待细胞长到对数生长期，进行消化传代种板；
(6-b)收集细胞：将培养瓶中生长到对数生长期的L02细胞(细胞数约为5*106)，PBS润洗，加入胰蛋白酶于37℃细胞培养箱中消化2分钟，然后加入含胎牛血清的MEM培养基终止消化作用，并转移到15ml离心管中，于1500rpm，离心5min；
(6-c)稀释种板：离心结束，弃掉上清液，留下细胞沉淀，并加入1ml新鲜的MEM培养液，轻柔吹打混匀，同时，取2只1.5ml的EP管，分别加入1ml新鲜的MEM培养液。取15ml离心管中的细胞悬液100μL加入到其中的一只1.5ml EP管中，轻轻吹打混匀，然后从中取出100μL加入到另一只1.5ml EP管中，再次轻轻吹打混匀。然后从第二只1.5ml EP管中取出100μL加入到装有12ml新鲜MEM培养液的15ml离心管中，混匀后种12孔板，每孔1ml。以这种方式稀释种板，12孔板中每孔约200-500个细胞；
(6-d)加药处理：待12孔板中的细胞贴壁培养4-7天后，吸掉旧培养液，加入5μM的PPM-18和5mM的Vitamin C联合用药以及5μM的PPM-18和5mM的Vitamin C单一药物，刺激1h，然后吸掉含药物培养基，加入不含药物的新鲜MEM培养液继续培养4-7天；
(6-e)克隆形成：待形成肉眼可见的细胞克隆后，终止培养。吸取掉板中的旧培养液，每孔加入1ml PBS润洗一遍，然后加入无水甲醇固定10分钟，用PBS洗涤三次，再加入结晶紫染色30分钟，并于30分钟后，PBS润洗3-4遍，然后将板子避光干燥，并拍照留存。
实验结果请参见图6A和图6B。结果说明：PPM-18和Vitamin C联合用药对人正常细胞L02细胞活力和克隆的形成无明显影响。如图6A所示，通过MTT实验，得出PPM-18和Vitamin C联合用药处理对正常细胞L02活力无明显影响。用细胞克隆实验来进一步验证PPM-18和Vitamin C联合用药在长期增殖中对正常细胞的作用效果。如图6B所示，在PPM-18和Vitamin C联合用药处理下，其对正常细胞克隆的形成无明显影响。而两种单独的药物也都没有抑制作用，说明5μM的PPM-18和5mM的Vitamin C具有选择性杀死肿瘤细胞的作用，而对人正常细胞没有明显影响，说明5μM的PPM-18和5mM的Vitamin C在细胞水平具有一定的安全性。