一种吴茱萸碱衍生物在制备治疗浅表真菌感染药物中的应用
阅读说明：本技术 一种吴茱萸碱衍生物在制备治疗浅表真菌感染药物中的应用 (Application of evodiamine derivative in preparation of medicine for treating superficial fungal infection ) 是由 王震 张红花 邓杰丹 梁妍 石桃 李俊芳 于 2021-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种吴茱萸碱衍生物在制备治疗浅表真菌感染药物中的应用。本发明的吴茱萸碱衍生物是以邻氨基苯甲酸甲酯类化合物和色胺作为起始原料,经过胺酯交换、路易斯酸催化的一步合环反应制备得到。本发明吴茱萸碱衍生物能够对红色毛癣菌、须癣毛癣菌、白色念珠菌三种真菌表现出良好的抗菌活性。且对真菌孢子的细胞壁、细胞膜、各细胞器皆存在一定程度的破坏作用,能在一定程度上影响真菌生物膜的疏水性,能显著减轻经磨皮处理后皮肤出现渗血点结成的暗红色红斑,皮肤变硬,同时产生大量皮屑的现象,改善皮肤组织表皮层增厚,小面积的表皮层坏死,角质层小面积的角化不全等现象。并且毒性小、耐药性低,可应用于制备治疗浅表真菌感染的药物。(The invention provides application of an evodiamine derivative in preparing a medicament for treating superficial fungal infection. The evodiamine derivative is prepared by taking methyl anthranilate compounds and tryptamine as starting materials through one-step cyclization reaction catalyzed by amine ester exchange and Lewis acid. The evodiamine derivative disclosed by the invention can show good antibacterial activity on three fungi, namely trichophyton rubrum, trichophyton mentagrophytes and candida albicans. The skin-care product has a certain destructive effect on cell walls, cell membranes and organelles of fungal spores, can affect the hydrophobicity of fungal biofilms to a certain degree, can remarkably reduce dark red erythema formed by bleeding points on the skin after dermabrasion treatment, and can obviously harden the skin and generate a large amount of scurf, and improve the phenomena of thickening of epidermis layers of skin tissues, necrosis of epidermis layers with small areas, incomplete keratinization with small areas of horny layers and the like. And the toxicity is low, the drug resistance is low, and the preparation method can be applied to preparation of drugs for treating superficial fungal infection.)
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一系列吴茱萸碱衍生物的制备；本发明还同时涉及吴茱萸碱衍生物在制备抗浅表真菌感染药物中的应用。
背景技术
真菌病是一个日益引起公众关注的公共卫生问题，近年来正成为对人类的严重威胁，特别是对免疫功能低下的个体。真菌病的发病率逐年增高，特别是浅表真菌病，是真菌病发病率最高的一类，是由浅表真菌感染而引起。浅表真菌病是皮肤科常见病，并且也是困扰患者的顽疾，主要由真菌感染皮肤、头发和指甲等部位，仅侵犯角质层和皮肤浅表层，临床常见的浅表真菌病主要是花斑糠疹、黑癣、白皮癣、黑皮癣以及念珠菌病等，并且有些真菌病常常伴有炎症反应。浅部真菌病的在全球范围内广泛流行，据统计，全球约有20-25%的人一生中都不同程度地受到浅部真菌的影响。特别是在我国南方东南沿海地区极其普遍，约60%的人患有浅表真菌病。尽管它不像新型冠状病毒那样来势凶猛，但该病的危害性却十分深远和广泛。浅表真菌病能引起一系列并发症如丹毒、蜂窝组织炎等细菌性感染，头癣还可造成永久性脱发；脚气病的极易反复发，难以治愈，作令人苦不堪言，更是严重影响着人们的生活。
抗真菌药物研究依旧缓慢，近年来治疗皮肤癣菌药物以烯丙胺基和唑类为主，但皮肤癣菌对治疗药物如酮康唑、氟康唑的耐药性也逐渐增强，其主要耐药机制涉及药物靶酶的变化、外排泵的高表达和药物渗透性的改变种类少，疗效不佳，毒副作用大，加上抗菌谱窄且耐药现象的不断出现，临床有限的抗真菌药物远不能满足患者的用药需求，严重威胁人类健康和生活质量。因此，亟需研发新型高效、低毒和广谱的抗真菌药物，尤其是对浅表真菌有效的药物尤为重要。
近年来，中药和活性天然产物研究取得了许多突破性进展，越来越受到人们的重视。传统中药在防治传染性疾病中的实践已经积累了几千年的丰富经验。中药吴茱萸始载于《神农本草经》，用于厥阴头痛、寒疝腹痛、湿寒脚气、虚寒泄泻、脘腹胀痛、呕吐吞酸、口疮口疳等。研究发现，中药吴茱萸有效成分吴茱萸碱对多种细菌和真菌具有良好的抑制作用，并且毒性小和耐药性低。因此，基于吴茱萸碱结构进行抗真菌药物或先导化合物开发对寻找新型抗真菌药物具有重要的应用价值。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供吴茱萸碱衍生物在制备抗浅表真菌药物中的应用。
本发明的吴茱萸碱衍生物，其结构式如下：
其中，R1为氢、羟基、甲氧基、乙氧基、甲基、羧基、乙酰基、F、Cl或Br；R2为烷基、芳基或酰基的一种，其中烷基为乙基、正丙基、正丁基、正戊基、异丙基、异丁基、异戊基、2,2-二甲基丁烷、烯丙基、3,4-二甲氧基苯乙基、CH2CO2CH3、环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷、丙炔基，芳基为F、Cl、Br、I、氢、甲基、甲氧基或三氟甲基取代的苯基、吡啶、异喹啉或喹啉，酰基为丙烯酰基、丁烯酰基、乙酰基、对甲苯磺酰基、苯甲酰基；R3为F、Cl、Br、I、氢、甲基、甲氧基中的一种。
本发明的吴茱萸碱衍生物的制备方法，包括以下步骤：
（1）以邻氨基苯甲酸甲酯类化合物和色胺类化合物为原料，以三甲基铝为路易斯酸，以二氯甲烷为溶剂，在氩气条件下，于0-5℃冰浴中反应4~6 h，反应完成后，加水淬灭反应，用二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到化合物1。
邻氨基苯甲酸甲酯类化合物的结构式为：，R2为烷基、芳基、酰基中的一种；其中烷基为乙基、正丙基、正丁基、正戊基、异丙基、异丁基、异戊基、2,2-二甲基丁烷、烯丙基、3,4-二甲氧基苯乙基、CH2CO2CH3、环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷或丙炔基；芳基为F、Cl、Br、I、氢、甲基、甲氧基或三氟甲基取代的苯基、吡啶、异喹啉或喹啉；酰基为丙烯酰基、丁烯酰基、乙酰基、对甲苯磺酰基或苯甲酰基；R3为F、Cl、Br、I、氢、甲基、甲氧基中的一种。
色胺类化合物的结构式为：，R1为氢、羟基、甲氧基、乙氧基、甲基、羧基、乙酰基、F、Cl或Br。
化合物1的结构式为：，R1为氢、羟基、甲氧基、乙氧基、甲基、羧基、乙酰基、F、Cl或Br；R2为烷基、芳基、酰基中的一种；其中烷基为乙基、正丙基、正丁基、正戊基、异丙基、异丁基、异戊基、2,2-二甲基丁烷、烯丙基、3,4-二甲氧基苯乙基、CH2CO2CH3、环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷或丙炔基；芳基为F、Cl、Br、I、氢、甲基、甲氧基或三氟甲基取代的苯基、吡啶、异喹啉或喹啉；酰基为丙烯酰基、丁烯酰基、乙酰基、对甲苯磺酰基或苯甲酰基；R3为F、Cl、Br、I、氢、甲基、甲氧基中的一种。
色胺类化合物的用量为邻氨基苯甲酸甲酯类化合物摩尔量的1.5~2倍；三甲基铝的用量为邻氨基苯甲酸甲酯类化合物摩尔量的2.5~3.5倍。
（2）以化合物1和原甲酸三乙酯为原料，以三氟化硼乙醚为催化剂，以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，在氩气条件下，温度100~130℃下，反应2~8h，反应完成后，用水和乙酸乙酯萃取洗去N,N-二甲基甲酰胺，收集有机相旋干，柱层析分离得到最终产物吴茱萸碱衍生物。
原甲酸三乙酯的用量为化合物1摩尔量的2~4倍；三氟化硼乙醚的用量为化合物1摩尔量的0.1~0.5倍。
本发明所制备的吴茱萸碱衍生物的合成路线如下：
其中，R1为氢、羟基、甲氧基、乙氧基、甲基、羧基、乙酰基、F、Cl或Br；R2为烷基、芳基、酰基中的一种，其中烷基为乙基、正丙基、正丁基、正戊基、异丙基、异丁基、异戊基、2,2-二甲基丁烷、烯丙基、3,4-二甲氧基苯乙基、CH2CO2CH3、环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷或丙炔基，芳基为F、Cl、Br、I、氢、甲基、甲氧基或三氟甲基取代的苯基、吡啶、异喹啉或喹啉，酰基为丙烯酰基、丁烯酰基、乙酰基、对甲苯磺酰基或苯甲酰基；R3为F、Cl、Br、I、氢、甲基、甲氧基中的一种。
本发明所制备的吴茱萸碱衍生物能够对红色毛癣菌、须癣毛癣菌、白色念珠菌三种真菌表现出良好的抗菌活性。通过对真菌菌丝和孢子超微结构的影响分析，本发明所制备的吴茱萸碱衍生物对真菌孢子的细胞壁、细胞膜、各细胞器皆存在一定程度的破坏作用。通过对真菌生物膜疏水性的影响分析，本发明所制备的吴茱萸碱衍生物对上述三株真菌皆能在一定程度上影响其生物膜的疏水性。通过对用药处理前后豚鼠的皮肤表观变化分析，本发明所制备的吴茱萸碱衍生物能显著减轻经磨皮处理后皮肤出现渗血点结成的暗红色红斑，皮肤变硬，同时产生大量皮屑的现象。通过对接种处皮肤组织病理切片分析，本发明所制备的吴茱萸碱衍生物能显著改善皮肤组织表皮层增厚，小面积的表皮层坏死，角质层小面积的角化不全等现象。因此，该类吴茱萸碱衍生物可应用于制备治疗浅表真菌感染的药物。
附图说明
图1为本发明合成化合物的抑菌曲线。
图2为本发明合成化合物对真菌菌丝和孢子超微结构的影响。
图3为本发明合成化合物对真菌生物被膜的抑制率和对真菌生物膜疏水性的影响。
图4为本发明合成化合物用药处理前豚鼠的皮肤表观变化和给药处理后豚鼠的皮肤表观变化。
图5为本发明合成化合物接种处皮肤组织病理切片分析结果。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。
实施例1
14-ethyl-8,13,13b,14-tetrahydroindolo[2',3':3,4]pyrido[2,1-b]quinazolin-5(7H)-one (化合物BT1)
化合物BT1的结构式为：
（1）在室温条件下，将methyl 2-(ethylamino)benzoate（化合物1-1，1mmol), 色胺（1.5 mmol），三甲基铝（3.0 mmol），溶于二氯甲烷10 ml，于0 ℃反应6小时，经过萃取柱层析分离得到产物N-(2-(1H-indol-3-yl)ethyl)-2-(ethylamino)benzamide(化合物1-2)，产率为71%。
化合物1-1的结构式为：
化合物1-2的结构式为：
（2）N-(2-(1H-indol-3-yl)ethyl)-2-(ethylamino)benzamide （化合物1-2，1mmol），原甲酸三乙酯（3 mmol）和三氟化硼乙醚（0.5 mmol）加入25 mL圆底烧瓶中，以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，置换为氩气，反应6小时。经TLC监测反应完成后，用水和乙酸乙酯萃取洗去N,N-二甲基甲酰胺，收集有机相旋干，柱层析分离得到产物14-ethyl-8,13,13b,14-tetrahydroindolo[2',3':3,4]pyrido[2,1-b]quinazolin-5(7H)-one (BT1)，产率为75%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.52 (s, 1H), 8.12 (dd, J = 7.8, 1.6 Hz,1H), 7.59 (dd, J = 7.8, 1.1 Hz, 1H), 7.49 – 7.38 (m, 2H), 7.26 – 7.23 (m,1H), 7.21 – 7.09 (m, 3H), 5.93 (s, 1H), 4.89 (m, J = 13.0, 5.1, 2.1 Hz, 1H),3.28 (m, J = 13.0, 10.8, 5.0 Hz, 1H), 3.11 (m, 1H), 2.97 (m, 3H), 0.96 (t, J= 7.1 Hz, 3H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 165.05, 148.22, 136.48, 132.65,128.85, 128.68, 126.36, 124.13, 123.48, 122.86, 122.30, 119.88, 118.79,113.21, 111.34, 69.03, 45.30, 40.10, 19.94, 13.92.
实施例2
14-isobutyl-8,13,13b,14-tetrahydroindolo[2',3':3,4]pyrido[2,1-b]quinazolin-5(7H)-one （化合物BT2）
化合物BT2的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料methyl 2-(ethylamino)benzoate（化合物1-1）替换为methyl 2-(isobutylamino)benzoate（化合物2-1），其余步骤同实施例1制备而得，收率73%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.20 (s, 1H), 8.06 (dd, J = 7.8, 1.6 Hz,1H), 7.55 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.44 – 7.36 (m, 2H), 7.25 – 7.20 (m, 1H), 7.15(t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.11 – 7.02 (m, 2H), 5.92 (s, 1H), 4.86 (m, J = 13.1,5.6, 1.9 Hz, 1H), 3.30 (m, 1H), 3.08 (m, 1H), 3.00 – 2.82 (m, 3H), 2.71 (dd,J = 13.5, 9.5 Hz, 1H), 0.99 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.77 (d, J = 6.7 Hz, 3H). 13CNMR (101 MHz, CDCl3) δ 165.27, 148.73, 136.28, 132.72, 129.59, 129.07,126.57, 122.75, 122.65, 122.34, 120.59, 119.84, 118.72, 113.29, 111.30,70.54, 60.38, 58.18, 41.15, 27.23, 20.51, 19.86.
化合物2-1的结构式为：
实施例3
14-allyl-8,13,13b,14-tetrahydroindolo[2',3':3,4]pyrido[2,1-b]quinazolin-5(7H)-one （化合物BT3）
化合物BT3的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料methyl 2-(ethylamino)benzoate（化合物1-1）替换为methyl 2-(allylamino)benzoate（化合物3-1），其余步骤同实施例1制备而得，收率80%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.56 (s, 1H), 8.11 (dd, J = 7.8, 1.6 Hz,1H), 7.59 (dd, J = 7.8, 1.1 Hz, 1H), 7.47 – 7.38 (m, 2H), 7.28 – 7.24 (m,1H), 7.20 – 7.05 (m, 3H), 5.99 (t, J = 1.6 Hz, 1H), 5.82 (m, J = 16.9, 10.2,6.6, 5.3 Hz, 1H), 5.04 (m, J = 10.2, 1.4 Hz, 1H), 4.94 (m, J = 17.0, 1.5 Hz,1H), 4.87 (m, J = 12.9, 4.9, 2.3 Hz, 1H), 3.69 (m, J = 15.8, 5.4, 1.7 Hz,1H), 3.50 (m, J = 15.8, 6.6, 1.2 Hz, 1H), 3.26 (m, J = 12.9, 10.5, 5.2 Hz,1H), 3.05 – 2.89 (m, 2H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 165.06, 148.39, 136.44,134.84, 132.77, 128.84, 128.11, 126.20, 123.05, 122.99, 122.97, 121.14,119.89, 118.82, 117.47, 113.63, 111.36, 68.62, 53.34, 40.07, 19.93.
化合物3-1的结构式为：
实施例4
14-butyl-8,13,13b,14-tetrahydroindolo[2',3':3,4]pyrido[2,1-b]quinazolin-5(7H)-one （化合物BT4）
化合物BT4的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料methyl 2-(ethylamino)benzoate（化合物1-1）替换为methyl 2-(butylamino)benzoate（化合物4-1），其余步骤同实施例1制备而得，收率66%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.40 (s, 1H), 8.09 (dd, J = 7.7, 1.6 Hz,1H), 7.58 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.48 – 7.37 (m, 2H), 7.26 – 7.22 (m, 1H), 7.20– 7.07 (m, 3H), 5.92 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 4.87 (m, J = 13.0, 5.3, 2.0 Hz,1H), 3.28 (m, J = 13.0, 11.1, 4.7 Hz, 1H), 3.10 – 2.88 (m, 4H), 1.46 – 1.36(m, 2H), 1.23 – 1.04 (m, 2H), 0.74 (t, J = 7.4 Hz, 3H). 13C NMR (101 MHz,CDCl3) δ 165.15, 148.50, 136.41, 132.71, 129.03, 128.91, 126.47, 123.47,123.12, 122.84, 121.64, 119.88, 118.80, 113.24, 111.31, 69.48, 50.81, 40.49,30.63, 20.24, 19.92, 13.75.
化合物4-1的结构式为：
实施例5
14-benzyl-8,13,13b,14-tetrahydroindolo[2',3':3,4]pyrido[2,1-b]quinazolin-5(7H)-one （化合物BT5）
化合物BT5的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料methyl 2-(ethylamino)benzoate（化合物1-1）替换为methyl 2-(benzylamino)benzoate（化合物5-1），其余步骤同实施例1制备而得，收率71%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.12 (dd, J = 7.8, 1.6 Hz, 1H), 7.95 (s,1H), 7.56 (dd, J = 7.8, 1.1 Hz, 1H), 7.34 (m, J = 8.5, 7.3, 1.7 Hz, 1H), 7.25– 7.18 (m, 5H), 7.14 (m, J = 7.5, 3.2, 1.4 Hz, 2H), 7.10 – 7.05 (m, 2H), 6.82(dd, J = 8.1, 1.0 Hz, 1H), 6.05 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 4.85 (m, J = 13.0, 4.7,2.5 Hz, 1H), 4.27 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 4.04 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 3.25 (m, J= 13.1, 10.1, 5.8 Hz, 1H), 3.01 – 2.88 (m, 2H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ165.09, 148.95, 138.45, 136.45, 132.82, 129.07, 128.54, 128.33, 128.19,127.48, 126.24, 123.33, 123.03, 122.87, 121.22, 120.00, 118.84, 114.03,111.34, 69.24, 54.40, 40.33, 20.07.
化合物5-1的结构式为：
实施例6
14-(3,4-dimethoxyphenethyl)-8,13,13b,14-tetrahydroindolo[2',3':3,4]pyrido[2,1-b]quinazolin-5(7H)-one （化合物BT6）
化合物BT6的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料methyl 2-(ethylamino)benzoate（化合物1-1）替换为methyl 2-((3,4-dimethoxyphenethyl)amino)benzoate（化合物6-1），其余步骤同实施例1制备而得，收率68%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.16 (s, 1H), 8.14 (dd,J = 7.8, 1.6 Hz, 1H), 7.56 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.49 (m, J = 8.1, 7.3, 1.7Hz, 1H), 7.31 (dt, J = 8.2, 0.9 Hz, 1H), 7.25 – 7.12 (m, 4H), 6.70 (d, J =8.1 Hz, 1H), 6.52 (dd, J = 8.1, 2.0 Hz, 1H), 6.16 (t, J = 2.0 Hz, 1H), 5.90(d, J = 1.6 Hz, 1H), 4.86 (m, J = 12.9, 4.8, 2.4 Hz, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.42(s, 3H), 3.24 (m, 2H), 3.09 m, 1H), 3.04 – 2.90 (m, 2H), 2.72 – 2.58 (m, 2H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 164.99, 148.72, 148.58, 147.26, 136.52, 132.85,131.64, 129.10, 128.22, 126.16, 123.71, 123.51, 123.01, 121.65, 120.43,119.91, 118.68, 113.41, 111.47, 111.42, 110.77, 69.09, 55.80, 55.30, 52.68,39.95, 34.71, 19.99.
化合物6-1的结构式为：
实施例7
methyl 2-(5-oxo-7,8,13,13b-tetrahydroindolo[2',3':3,4]pyrido[2,1-b]quinazolin-14(5H) -yl)acetate （化合物BT7）
化合物BT7的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料methyl 2-(ethylamino)benzoate（化合物1-1）替换为methyl 2-((2-methoxy-2-oxoethyl)amino)benzoate（化合物7-1），其余步骤同实施例1制备而得，收率85%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 9.17 (s, 1H), 8.05 (dd, J =7.8, 1.6 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.44 – 7.35 (m, 2H), 7.22 (m, J =8.2, 7.0, 1.2 Hz, 1H), 7.17 – 7.10 (m, 1H), 7.05 (td, J = 7.6, 1.0 Hz, 1H),6.79 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.07 (t, J = 1.6 Hz, 1H), 4.88 (m, J = 12.9, 5.4,1.6 Hz, 1H), 4.12 – 3.87 (m, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.25 (m, J = 12.8, 11.4, 4.4Hz, 1H), 3.10 (m, 1H), 2.92 – 2.85 (m, 1H). 13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 171.13,164.68, 147.13, 136.63, 133.78, 131.12, 128.48, 126.57, 122.38, 120.37,119.44, 119.38, 118.70, 116.64, 112.04, 69.85, 52.29, 51.33, 41.93, 19.72.
化合物7-1的结构式为：
实施例8
(E)-14-(but-2-enoyl)-8,13,13b,14-tetrahydroindolo[2',3':3,4]pyrido[2,1-b]quinazolin-5(7H)-one （化合物BT9）
化合物BT9的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料methyl 2-(ethylamino)benzoate（化合物1-1）替换为methyl (E)-2-(but-2-enamido)benzoate（化合物8-1），其余步骤同实施例1制备而得，收率84%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.17 (s, 1H), 8.06 (dd, J = 7.8, 1.6Hz, 1H), 7.47 – 7.39 (m, 2H), 7.32 – 7.26 (m, 1H), 7.25 (p, J = 1.0 Hz, 2H),7.21 (dd, J = 7.6, 1.1 Hz, 1H), 7.14 (td, J = 8.4, 1.3 Hz, 2H), 7.07 (m, J =8.1, 7.1, 1.1 Hz, 1H), 6.38 (m, J = 15.0, 1.7 Hz, 1H), 5.06 – 4.98 (m, 1H),3.35 (m, J = 13.0, 11.7, 4.5 Hz, 1H), 3.21 (m, 1H), 2.72 – 2.65 (m, 1H), 1.98(dd, J = 7.0, 1.7 Hz, 3H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 167.37, 163.46, 145.93,136.75, 135.88, 132.52, 130.91, 129.08, 126.93, 125.79, 122.88, 122.73,122.64, 121.56, 119.85, 118.55, 112.83, 111.28, 66.79, 44.88, 20.06, 18.49.
化合物8-1的结构式为：
实施例9
10-methoxy-7,8,13,13b-tetrahydro-5H-benzo [5',6'][1,3]thiazino[3',2':1,2]pyrido[3,4-b]indol-5-one(化合物BT12)
化合物BT12的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料methyl 2-(ethylamino)benzoate（化合物1-1）替换为methyl 2-(phenylamino)benzoate（化合物9-1），其余步骤同实施例1制备而得，产率为90%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 11.17 (s, 1H), 8.07 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H),7.50 (m, 2H), 7.39 (td, J = 7.5, 1.5 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.04(d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.79 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.56 (s, 1H), 4.82 –4.65 (m, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.23 (m, 1H), 2.98 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 2.88 –2.76 (m, 1H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ 164.8, 153.9, 136.1, 132.5, 132.3,131.0, 129.4, 128.7, 127.5, 126.8, 126.3, 112.78, 112.76, 110.3, 100.7, 56.9,55.8, 20.6.
化合物9-1的结构式为：
实施例10
14-(3-chlorophenyl)-8,13,13b,14-tetrahydroindolo[2',3':3,4]pyrido[2,1-b]quinazolin-5 (7H)-one (化合物BT16)
化合物BT16的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料methyl 2-(ethylamino)benzoate（化合物1-1）替换为methyl 2-((3-chlorophenyl)amino)benzoate（化合物10-1），其余步骤同实施例1制备而得，收率75%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 11.31 (s, 1H), 7.86 (dd, J = 7.9, 1.6Hz, 1H), 7.47 (m, 1H), 7.41 – 7.30 (m, 3H), 7.26 (t, J = 2.1 Hz, 1H), 7.22 –7.13 (m, 3H), 7.08 (m, 2H), 6.97 (m, 1H), 6.69 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 4.60 (dd,J = 13.1, 5.8 Hz, 1H), 3.47 – 3.38 (m, 1H), 2.97 – 2.82 (m, 1H), 2.65 (dd, J= 15.7, 4.8 Hz, 1H). 13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 164.83, 148.28, 143.86, 136.45,133.90, 133.79, 132.34, 131.10, 128.47, 126.91, 124.48, 123.48, 123.30,122.15, 122.03, 121.74, 121.54, 119.34, 118.49, 112.15, 111.76, 72.22, 43.08,19.59.
化合物10-1的结构式为：
实施例11
14-(3-bromophenyl)-8,13,13b,14-tetrahydroindolo[2',3':3,4]pyrido[2,1-b]quinazolin-5(7H)-one (化合物BT17)
化合物BT17的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料methyl 2-(ethylamino)benzoate（化合物1-1）替换为methyl 2-((3-bromophenyl)amino)benzoate（化合物11-1），其余步骤同实施例1制备而得，收率68%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 11.32 (s, 1H), 7.86 (dd, J = 7.9, 1.6Hz, 1H), 7.47 (m, J = 8.5, 7.3, 1.7 Hz, 1H), 7.42 – 7.36 (m, 2H), 7.36 – 7.26(m, 3H), 7.23 (dt, J = 7.8, 1.8 Hz, 1H), 7.14 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.08 (td,J = 7.2, 4.5 Hz, 2H), 6.97 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 6.69 (s, 1H), 4.60 (dd, J =13.1, 5.8 Hz, 1H), 3.47 – 3.37 (m, 1H), 2.90 (s, 1H), 2.65 (dd, J = 15.6, 4.8Hz, 1H). 13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 164.82, 148.43, 143.89, 136.44, 133.79,132.31, 131.36, 128.46, 127.40, 126.90, 126.36, 123.32, 122.47, 122.33,122.15, 121.74, 121.55, 119.34, 118.49, 112.14, 111.77, 72.22, 43.05, 40.17,19.58.
化合物11-1的结构式为：
实施例12
14-(m-tolyl)-8,13,13b,14-tetrahydroindolo[2',3':3,4]pyrido[2,1-b]quinazolin-5(7H)-one (化合物BT18)
化合物BT18的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料methyl 2-(ethylamino)benzoate（化合物1-1）替换为methyl 2-(m-tolylamino)benzoate（化合物12-1），其余步骤同实施例1制备而得，收率73%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 11.27 (s, 1H), 7.82 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.45– 7.21 (m, 4H), 7.14 – 6.91 (m, 7H), 6.61 (s, 1H), 4.59 (dd, J = 13.4, 5.9Hz, 1H), 3.43 (d, J = 10.2 Hz, 1H), 2.94 (m,1H), 2.63 (m, 1H), 2.27 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 165.10, 147.00, 144.61, 139.13, 136.42, 133.64,132.98, 129.45, 128.34, 126.99, 125.51, 124.31, 122.41, 122.05, 121.51,120.95, 120.74, 119.31, 118.44, 112.21, 111.56, 72.57, 43.18, 21.51, 19.58.
化合物12-1的结构式为：
实施例13
14-(4-chlorophenyl)-8,13,13b,14-tetrahydroindolo[2',3':3,4]pyrido[2,1-b]quinazolin-5 (7H)-one (化合物BT21)
化合物BT21的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料methyl 2-(ethylamino)benzoate（化合物1-1）替换为methyl 2-((4-chlorophenyl)amino)benzoate（化合物13-1），其余步骤同实施例1制备而得，收率81%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 11.31 (s, 1H), 7.87 (dd, J = 7.8, 1.6Hz, 1H), 7.45 (m, J = 8.6, 7.3, 1.7 Hz, 1H), 7.41 – 7.35 (m, 3H), 7.32 (d, J= 8.1 Hz, 1H), 7.26 – 7.21 (m, 2H), 7.12 – 7.04 (m, 3H), 6.97 (t, J = 7.4 Hz,1H), 6.60 (s, 1H), 4.60 (dd, J = 13.1, 5.6 Hz, 1H), 3.40 (d, J = 5.0 Hz, 1H),3.36 (m, 1H)2.66 (dd, J = 15.7, 4.7 Hz, 1H). 13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 164.87,145.62, 144.76, 136.51, 133.76, 131.99, 129.47, 128.95, 128.49, 126.81,126.06, 123.13, 122.19, 121.76, 121.65, 119.34, 118.56, 112.15, 111.84,72.05, 42.80, 39.96, 19.63.
化合物13-1的结构式为：
实施例14
14-(2-iodophenyl)-8,13,13b,14-tetrahydroindolo[2',3':3,4]pyrido[2,1-b]quinazolin-5 (7H)-one (化合物BT14)
化合物BT14的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料methyl 2-(ethylamino)benzoate（化合物1-1）替换为methyl 2-((2-iodophenyl)amino)benzoate（化合物14-1），其余步骤同实施例1制备而得，收率44%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.64 (d, J = 115.0 Hz, 1H), 8.01 –7.76 (m, 2H), 7.64 – 7.18 (m, 5H), 7.13 – 6.86 (m, 4H), 6.67 – 6.26 (m, 2H),4.67 (t, J = 14.6 Hz, 1H), 3.08 (dt, J = 30.5, 15.5 Hz, 2H), 2.90 – 2.60 (m,1H). 13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 164.68, 146.68, 145.22, 140.35, 136.55, 133.67,132.60, 129.74, 128.97, 128.39, 125.84, 125.76, 122.28, 120.97, 120.34,119.42, 118.83, 117.56, 113.04, 112.34, 100.03, 69.77, 41.55, 19.51.
化合物14-1的结构式为：
实施例15
14-(3-fluorophenyl)-3-(trifluoromethyl)-8,13,13b,14 tetrahydroindolo[2',3':3,4] pyrido[2,1b]quinazolin-5(7H)-one (化合物BT34)
化合物BT34的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料methyl 2-(ethylamino)benzoate（化合物1-1）替换为methyl 2-((3-fluorophenyl)amino)-5-(trifluoromethyl)benzoate（化合物15-1），其余步骤同实施例1制备而得，收率34%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.33 (s,1H), 7.96 (s, 1H), 7.54 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.36(td, J = 8.2, 6.4 Hz, 1H), 7.30 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.20 (t, J = 7.5 Hz,1H), 7.16 – 7.04 (m, 5H), 7.01 (dt, J = 10.0, 2.3 Hz, 1H), 6.96 (td, J = 8.3,2.3 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 4.93 (dd, J = 12.7, 5.2 Hz, 1H), 3.28 (td, J =12.4, 4.5 Hz, 1H), 3.24 – 3.10 (m, 1H), 2.77 (dd, J = 15.5, 4.4 Hz, 1H).
化合物15-1的结构式为：
实施例16
14-(3-fluorophenyl)-2-methyl-8,13,13b,14-tetrahydroindolo[2',3':3,4]pyrido[2,1-b] quinazolin-5(7H)-one (化合物BT46)
化合物BT46的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料methyl 2-(ethylamino)benzoate（化合物1-1）替换为methyl 2-((3-fluorophenyl)amino)-4-methylbenzoate（化合物16-1），其余步骤同实施例1制备而得，收率46%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.07 (s, 1H), 7.94 (d,J = 7.9 Hz, 1H), 7.47 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.33 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.19 (t,J = 7.3 Hz, 1H), 7.11 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.95 –6.80 (m, 4H), 6.36 (s, 1H), 4.89 (dd, J = 13.1, 5.6 Hz, 1H), 3.25 (td, J =12.9, 4.7 Hz, 2H), 3.16 – 3.01 (m, 1H), 2.72 (dd, J = 15.4, 4.3 Hz, 1H), 2.28(s, 3H). 13C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 165.25, 163.35 (d, J = 247.3 Hz) ,148.80 (d, J = 9.5 Hz), 144.31, 144.00, 136.15, 131.03, 130.72 (d, J = 9.4Hz), 129.17, 127.27, 124.95, 123.04, 121.50, 120.22, 119.58, 119.32 (d, J =2.9 Hz) , 118.95, 113.86, 111.98 (d, J = 21.2 Hz), 111.47, 111.14 (d, J =23.5 Hz), 73.02, 43.37, 21.80, 19.75.
化合物16-1的结构式为：
实施例17
1-fluoro-14-(3-fluorophenyl)-8,13,13b,14-tetrahydroindolo[2',3':3,4]pyrido[2,1-b] quinazolin-5(7H)-one (化合物BT43)
化合物BT43的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料methyl 2-(ethylamino)benzoate（化合物1-1）替换为methyl 3-fluoro-2-((3-fluorophenyl)amino)benzoate（化合物17-1），其余步骤同实施例1制备而得，收率35%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.67 (s, 1H), 7.98 –7.91 (m, 1H), 7.47 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.25 – 7.20(m, 1H), 7.20 – 7.10 (m, 4H), 6.85 – 6.78 (m, 2H), 6.74 (d, J = 10.3 Hz, 1H),6.40 (s, 1H), 4.86 (dd, J = 13.2, 5.1 Hz, 1H), 3.26 (td, J = 12.7, 4.7 Hz,1H), 3.00 – 2.87 (m, 1H), 2.74 (dd, J = 15.8, 4.6 Hz, 1H).13C NMR (101 MHz,CDCl3) δ 164.13 (d, J = 3.3 Hz), 162.98 (d, J = 246.9 Hz), 154.81 (d, J =251.4 Hz), 147.72 (d, J = 9.1 Hz), 136.20, 132.42 (d, J = 12.1 Hz), 130.19(d, J = 9.3 Hz), 129.64, 126.90, 125.92, 125.40 (d, J = 7.4 Hz), 124.52 (d, J= 3.3 Hz), 123.19, 120.18 (d, J = 18.8 Hz), 120.16, 119.21 (d, J = 2.2 Hz),118.94, 113.92, 112.41 (d, J = 21.1 Hz), 111.61, 111.03 (d, J = 23.5Hz),73.57, 43.13, 19.81.
化合物17-1的结构式为：
实施例18
3-bromo-14-(3-fluorophenyl)-8,13,13b,14-tetrahydroindolo[2',3':3,4]pyrido[2,1-b] quinazolin-5(7H)-one (化合物BT37)
化合物BT37的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料methyl 2-(ethylamino)benzoate（化合物1-1）替换为methyl 5-bromo-2-((3-fluorophenyl)amino)benzoate（化合物18-1），其余步骤同实施例1制备而得，收率40%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.18 (d, J = 2.4 Hz,1H), 8.08 (s, 1H), 7.47 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.44 (dd, J = 8.7, 2.4 Hz, 1H),7.32 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.30 – 7.24 (m, 1H), 7.20 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.12(t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.98 – 6.94 (m, 2H), 6.93 – 6.85 (m, 2H), 6.37 (s, 1H),4.88 (dd, J = 13.2, 5.3 Hz, 1H), 3.26 (td, J = 13.0, 12.3, 4.8 Hz, 1H), 3.13– 3.03 (m, 1H), 2.75 (dd, J = 15.7, 4.8 Hz, 1H). 13C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 163.94, 163.48 (d, J = 247.7 Hz), 148.00 (d, J = 9.3 Hz), 143.20,136.36, 136.32, 132.04, 131.05 (d, J = 9.4 Hz), 130.36, 127.20, 123.46,123.42, 122.91, 120.49, 119.55 (d, J = 2.9 Hz), 119.10, 116.48, 114.21,112.71 (d, J = 21.2 Hz), 111.40 (d, J = 23.4 Hz), 111.28, 73.05, 43.63,19.91.
化合物18-1的结构式为：
实施例19
4-fluoro-14-(3-fluorophenyl)-8,13,13b,14-tetrahydroindolo[2',3':3,4]pyrido[2,1-b] quinazolin-5(7H)-one (化合物BT48)
化合物BT48的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料methyl 2-(ethylamino)benzoate（化合物1-1）替换为methyl 2-fluoro-6-((3-fluorophenyl)amino)benzoate（化合物19-1），其余步骤同实施例1制备而得，收率37%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.10 (s, 1H), 7.48 (d,J = 7.8 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.33 – 7.28 (m, 1H), 7.27 – 7.08(m, 3H), 6.89 – 6.74 (m, 5H), 6.28 (s, 1H), 4.82 (m, J = 13.1, 5.4, 1.7 Hz,1H), 3.25 (m, J = 13.1, 11.1, 5.0 Hz, 1H), 2.91 – 2.81 (m, 1H), 2.77 (dd, J =15.6, 4.9 Hz, 1H). 13C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ163.05 (d, J = 247.7 Hz),162.92 (d, J = 263.8 Hz), 147.70 , 147.00 (d, J = 9.2 Hz), 136.33 , 133.79(d, J = 11.1 Hz), 130.56 (d, J = 9.4 Hz), 128.88 , 126.69 , 123.36 , 121.01(d, J = 3.1 Hz), 120.32 , 119.10 , 117.45 (d, J = 3.9 Hz), 114.68 , 113.07(d, J = 21.0 Hz), 112.80 (d, J = 23.2 Hz), 111.96 (d, J = 22.1 Hz), 111.48 ,71.47 , 41.98 , 19.86.
化合物19-1的结构式为：
实施例20
10-ethoxy-3-fluoro-14-(3-fluorophenyl)-8,13,13b,14-tetrahydroindolo[2',3':3,4]pyrido [2,1-b]quinazolin-5(7H)-one (化合物BT53)
化合物BT53的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料methyl 2-(ethylamino)benzoate（化合物1-1）替换为methyl 5-fluoro-2-((3-fluorophenyl)amino)benzoate（化合物20-1），将实施例1步骤（2）中的原料色胺替换为5-乙氧基色胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率25%。1H NMR(400 MHz, Chloroform-d) δ 8.15 (s, 1H), 7.74 (dd, J = 8.7, 2.7 Hz, 1H), 7.25– 7.17 (m, 2H), 7.13 – 7.00 (m, 2H), 6.91 – 6.77 (m, 5H), 6.35 (s, 1H), 4.85(dd, J = 13.3, 5.6 Hz, 1H), 4.05 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.33 – 3.19 (m, 1H),3.06 – 2.91 (m, 1H), 2.68 (dd, J = 15.7, 4.6 Hz, 1H), 1.42 (t, J = 7.0 Hz,3H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 164.14 (d, J = 2.3 Hz), 163.33 (d, J = 247.5Hz), 159.16 (d, J = 244.2 Hz), 153.83, 148.69 (d, J = 9.3 Hz),140.47 (d, J =2.4 Hz), 131.32, 131.07,130.77 (d, J = 9.4 Hz), 127.58, 124.02 (d, J = 7.5Hz), 123.83 (d, J = 7.7 Hz), 121.02 (d, J = 23.8 Hz), 119.39 (d, J = 2.9 Hz),115.14 (d, J = 24.1 Hz), 113.99, 113.72, 112.37, 112.26 (d, J = 21.1 Hz),111.20 (d, J = 23.5 Hz), 101.76, 73.23, 64.36, 43.45, 19.95, 15.23.
化合物20-1的结构式为：
实施例21
10-chloro-14-(3-fluorophenyl)-8,13,13b,14-tetrahydroindolo[2',3':3,4]pyrido[2,1-b] quinazolin-5(7H)-one (化合物BT51)
化合物BT51的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料methyl 2-(ethylamino)benzoate（化合物1-1）替换为methyl 2-((3-fluorophenyl)amino)benzoate（化合物21-1），将实施例1步骤（2）中的原料色胺替换为5-氯色胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率54%。1H NMR (400 MHz,Chloroform-d) δ 8.69 (s, 1H), 8.02 (dd, J = 8.3, 1.5 Hz, 1H), 7.40 (d, J =2.0 Hz, 1H), 7.33 – 7.27 (m, 1H), 7.26 – 7.21 (m, 2H), 7.11 (dd, J = 8.7, 2.0Hz, 1H), 7.06 – 7.01 (m, 2H), 6.96 (dd, J = 8.1, 1.4 Hz, 1H), 6.90 (dt, J =10.4, 2.3 Hz, 1H), 6.84 (td, J = 8.2, 2.2 Hz, 1H), 6.38 (s, 1H), 4.87 (dd, J= 13.3, 5.4 Hz, 1H), 3.28 – 3.19 (m, 1H), 3.07 – 2.96 (m, 1H), 2.65 (dd, J =15.7, 4.8 Hz, 1H). 13C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 164.64, 163.41 (d, J =247.5 Hz), 148.59 (d, J = 9.4 Hz), 144.16, 134.66, 133.56, 132.48, 130.83 (d,J = 9.4 Hz), 129.30, 128.32, 125.97, 123.81, 123.37, 121.92, 121.44, 119.48(d, J = 2.9 Hz), 118.54, 113.45, 112.66, 112.31 (d, J = 21.2 Hz), 111.32 (d,J = 23.5 Hz), 72.98, 43.39, 19.80.
化合物21-1的结构式为：
实施例22
14-(3-fluorophenyl)-10-hydroxy-8,13,13b,14-tetrahydroindolo[2',3':3,4]pyrido[2,1-b] quinazolin-5(7H)-one (化合物BT52)
化合物BT52的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料methyl 2-(ethylamino)benzoate（化合物1-1）替换为methyl 2-((3-fluorophenyl)amino)benzoate（化合物21-1），将实施例1步骤（2）中的原料色胺替换为5-羟基色胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率24%。1H NMR (400 MHz,Methanol-d 4) δ 7.97 (dd, J = 7.8, 1.6 Hz, 1H), 7.45 (m, J = 8.6, 7.2, 1.6 Hz,1H), 7.28 – 7.18 (m, 1H), 7.19 – 7.10 (m, 3H), 6.95 – 6.91 (m, 1H), 6.89 –6.78 (m, 2H), 6.74 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.65 (dd, J = 8.7, 2.4 Hz, 1H), 6.48(s, 1H), 4.72 (m, J = 13.3, 5.8, 1.3 Hz, 1H), 3.37 – 3.31 (m, 1H), 2.87 –2.73 (m, 1H), 2.65 (dd, J = 15.5, 5.0 Hz, 1H). 13C NMR (101 MHz, DMSO) δ163.81, 162.60 (d, J = 243.6 Hz), 150.75, 148.28 (d, J = 10.0 Hz), 143.45,133.54, 132.58, 130.89 (d, J = 9.5 Hz), 130.63, 128.18, 127.39, 122.99,121.43, 121.08, 118.73 (d, J = 2.1 Hz), 112.32, 112.13, 110.90 (d, J = 21.0Hz), 110.60, 109.99 (d, J = 23.8 Hz), 102.13, 72.13, 43.00, 19.34.
实施例23
10-chloro-14-(3-fluorophenyl)-3-methyl-8,13,13b,14-tetrahydroindolo[2',3':3,4] pyrido[2,1-b]quinazolin-5(7H)-one (化合物BT61)
化合物BT61的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料methyl 2-(ethylamino)benzoate（化合物1-1）替换为methyl 2-((3-fluorophenyl)amino)-5-methylbenzoate（化合物23-1），将实施例1步骤（2）中的原料色胺替换为5-氯色胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率63%。1H NMR (400MHz, DMSO-d 6) δ 11.53 (s, 1H), 7.64 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 2.1 Hz,1H), 7.39 – 7.26 (m, 3H), 7.08 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.07 – 7.04 (m, 1H), 7.01– 6.91 (m, 3H), 6.68 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 4.56 (dd, J = 13.2, 5.8 Hz, 1H),3.43 – 3.34 (m, 1H), 2.92 – 2.78 (m, 1H), 2.62 (dd, J = 15.8, 4.8 Hz, 1H),2.24 (s, 3H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d 6) δ 164.73 , 162.65 (d, J = 230.9 Hz),148.59 (d, J = 9.9 Hz), 141.03 , 134.53 , 134.41 , 134.20 , 132.71 , 130.85(d, J = 9.4 Hz), 128.06 , 127.72 , 123.69 , 121.88 , 121.75 , 121.22 , 118.42, 117.56 , 113.32 , 111.27 , 110.67 (d, J = 21.1 Hz), 109.64 (d, J = 24.6 Hz), 71.82 , 42.66 , 20.21 , 18.86.
化合物23-1的结构式为：
实施例24
吴茱萸碱衍生物最小抑菌浓度（MIC）活性测定
试剂配制：
（1）SDA 固体培养基：准确称取 4 g Glucose，1 g Peptone，1.8 g Agar于250 mL 锥形瓶中，加入100 mL蒸馏水，充分搅拌溶解；滴加1 mol/L Na OH/HCl调节pH值至7.0；用封口膜封口后，121 ℃高压灭菌 20 min，待冷却至50 ℃左右备用。
（2）SDA 液体培养基（SDB）：准确称取 4 g Glucose，1 g Peptone，于250 mL锥形瓶中，加入100 mL蒸馏水，充分搅拌溶解；滴加1 mol/L NaOH/HCl调节pH值至7.0；用封口膜封口后，121 ℃高压灭菌20 min，待冷却至室温备用。
（3）0.9%生理盐水：准确称取 0.9 g NaCl于250 mL锥形瓶中，加入100 mL蒸馏水，用滤菌膜封口后，121℃高压灭菌20 min，待冷却至50 ℃左右备用。
（4）吴茱萸碱衍生物：采用DMSO配制成20 mmol/L的母液，备用。
（5）酮康唑药液：采用DMSO配置成20 mmol/L的母液，备用。
菌悬液的制备：
（1）红色毛癣菌（T. rubrum）菌悬液：将保存于-80℃的 T. rubrum 划线接种于SDA 平板，置于生化培养箱中 28℃培养 7 d 后，用接种环挑取 T. rubrum 单菌落接种于SDA固体斜面的上中下三个位置，于生化培养箱中28 ℃培养7 d。然后向斜面加入3 mL无菌生理盐水，用接种环刮取T. rubrum，将菌液转入10 mL 离心管中，于涡旋仪上涡旋1 min混匀，得到菌悬液，室温下静置10 min，用血细胞计数板调整T.rubrum菌液浓度为 1×106CFU/m L。
（2）须癣毛癣菌（Trichophyton mentagrophyte）菌悬液：将保存于-80℃的T.rubrum划线接种于SDA平板，置于生化培养箱中28 ℃培养7 d后，用接种环挑取T.rubrum单菌落接种于SDA固体斜面的上中下三个位置，于生化培养箱中28℃培养7 d。然后向斜面加入3 mL无菌生理盐水，用接种环刮取T.rubrum，将菌液转入10 mL离心管中，于涡旋仪上涡旋1 min混匀，得到菌悬液，室温下静置 10 min，用血细胞计数板调整T.rubrum菌液浓度为 1×106 CFU/m L。
（3）白色念珠菌（C. albicans）菌悬液：将保存于-80 ℃的C.albicans划线接种于SDA平板，置于生化培养箱中28 ℃培养3 d后，用接种环挑取C.albicans单菌落接种于SDA固体斜面的上中下三个位置，于生化培养箱中28 ℃培养3 d。然后向斜面加入3 mL无菌生理盐水，用接种环刮取C.albicans，将菌液转入10 mL离心管中，于涡旋仪上涡旋1 min混匀，得到菌悬液，室温下静置10 min，用血细胞计数板调整 C. albicans 菌液浓度为1×106 CFU/mL。
最小抑菌浓度（MIC）测定：
根据改良 CLSI M38-A2 方案，在超净工作台中吸取 196 μL SDB 依次加入 96孔板的第 1、2、3 行实验组的 2～12 列中，第 4、5、6 行阳性对照组的2～12 列中，第 7、8、9 行空白对照组的 1～12 列中；将待测化合物母液吸取 4 μL加入第 1、2、3 行的第 1列孔中，再吸取 100 μL加入到第 1、2、3行的第 2 列孔中，混合均匀后，吸取 100 μL到各行第 3 孔，依次进行梯度稀释，阳性对照选择酮康唑稀释方法同上，最后各孔的浓度为200、100、50、25、12.5、6.25 μmol·L-1，DMSO终浓度< 0.4% 且不影响试验结果。每个实验至少重复三次。最后吸取 10 μL制备好的菌悬液加入 96孔板，混合均匀后，置于 28℃生化培养箱培养 5 d 后用肉眼观察能 100%抑制真菌生长的浓度为 MIC值。所得结果如下表1所示（上述平行实验均独立重复三次）
试验结果：
实验结果发现部分测试化合物能够对以上三种真菌表现出至少抗一种真菌的抗菌活性，其中化合物BT18和化合物BT58对三种真菌都表现出良好的抗菌活性，且优于阳性药酮康唑。
表1.所合成化合物和阳性药酮康唑对红色毛癣菌、须癣毛癣菌、白色念珠菌的最小抑菌浓度（MIC）
a所有数据均通过三组重复的独立实验获得；IC50值由IBM SPSS Statistics 软件计算得到。
实施例25
杀菌曲线：
试验方法：制备红色毛癣菌（T. rubrum）菌悬液、须癣毛癣菌（Trichophytonmentagrophyte）菌悬液、白色念珠菌（C. albicans）菌悬液室温下静置 10 min，用血细胞计数板调整 C. albicans 菌液浓度为 1×106CFU/m L，加以不同浓度的化合物10和酮康唑分别予以处理，将加上化合物10的菌液放置在每分钟200转的摇晃培养箱中生长，温度设定为30℃,30℃孵育不同的时间点后，将稀释后的菌悬液涂在固体培养基上，在预定时间点计算活菌的个数并绘制杀菌曲线。上述试验分别进行三次。
图1为所选化合物的红色毛癣菌（T. rubrum）、须癣毛癣菌（Trichophytonmentagrophyte）、白色念珠菌（C. albicans）的杀菌效果。结果显示，化合物BT18对红色毛癣菌（T. rubrum）、须癣毛癣菌（Trichophyton mentagrophyte）、白色念珠菌（C.albicans）的杀菌效果优于阳性药酮康唑。
实施例26
透射电镜观察化合物BT18对红色毛癣菌（T. rubrum）、须癣毛癣菌（Trichophytonmentagrophyte）、白色念珠菌（C. albicans）超微结构的影响
试验方法：
菌悬液的制备：
（1）红色毛癣菌（T. rubrum）菌悬液：将保存于-80℃的 T. rubrum 划线接种于SDA 平板，置于生化培养箱中 28℃培养 7 d 后，用接种环挑取 T. rubrum 单菌落接种于SDA固体斜面的上中下三个位置，于生化培养箱中 28℃培养 7 d。然后向斜面加入 3 m L无菌生理盐水，用接种环刮取 T. rubrum，将菌液转入 10 m L 离心管中，于涡旋仪上涡旋1 min 混匀，得到菌悬液，室温下静置 10 min，用血细胞计数板调整T.rubrum菌液浓度为1×106 CFU/mL。
（2）须癣毛癣菌（Trichophyton mentagrophyte）菌悬液：将保存于-80℃的 T.rubrum 划线接种于 SDA 平板，置于生化培养箱中 28℃培养 7 d 后，用接种环挑取 T.rubrum 单菌落接种于 SDA固体斜面的上中下三个位置，于生化培养箱中 28℃培养 7 d。然后向斜面加入 3 m L 无菌生理盐水，用接种环刮取 T. rubrum，将菌液转入10 m L 离心管中，于涡旋仪上涡旋 1 min 混匀，得到菌悬液，室温下静置10 min，用血细胞计数板调整T.rubrum菌液浓度为 1×106 CFU/m L。
（3）白色念珠菌（C. albicans）菌悬液：将保存于-80℃的 C. albicans 划线接种于 SDA 平板，置于生化培养箱中28℃培养 3 d 后，用接种环挑取 C. albicans 单菌落接种于SDA固体斜面的上中下三个位置，于生化培养箱中 28℃培养 3 d。然后向斜面加入 3m L 无菌生理盐水，用接种环刮取 C. albicans，将菌液转入 10 m L 离心管中，于涡旋仪上涡旋 1 min 混匀，得到菌悬液，室温下静置 10 min，用血细胞计数板调整C. albicans菌液浓度为 1×106CFU/m L。
样品制备：
每株菌分别取 12 只无菌 10 m L 试管，每只试管加入 3 m L 菌悬液，实验组加入 3 m L 药液使得终浓度为 mic、2mic、4mic；阳性药组的浓度也为mic、2mic、4mic；空白组不加药液处理，以与实验组药液用量相同的 SDB 培养基代替；每组设置3个平行，置于生化培养箱中 28℃培养 7 d 后取出备用。
标本制作：
样品准备：分别将化合物10、阳性药酮康唑作用后的红色毛癣菌（T. rubrum）菌悬液、须癣毛癣菌（Trichophyton mentagrophyte）菌悬液、白色念珠菌（C. albicans）菌悬液装入 10 m L 无菌离心管中，以 4000 r/min 离心 10 min，小心吸去上清液，保留 1.5 mL 的真菌液体，再将菌块吹散，转移至1.5 mL EP 管中，以 10000 r/min 离心 15 min，小心吸去上清液，沿管壁缓缓加入戊二醛固定液于 4℃固定 4 h。
清洗：将样品用 0.1 mol/L 磷酸缓冲液清洗 3 次，每次 10 min。四氧化锇再固定：样品中加入四氧化锇固定 1～2 h。
再清洗：用双蒸水清洗 3 次，且时间每次不超过 3 min。
脱水：先用 50%乙醇脱水 15 min，再用 70%乙醇和醋酸双氧过饱和溶脱
水过夜；然后用 90%乙醇、1:1=90%乙醇：90%丙酮溶液、90%乙醇、100%丙酮依次脱水10 min。
浸透：先用 1:1=100%丙酮：包埋剂浸透 3 h，再用包埋剂于 37℃浸透 2 h。
包埋聚合：将样品用包埋剂包埋于 35℃聚合不少于 12 h，45℃聚合不少于8 h，60℃聚合不少于24 h，80℃不小于12 h。
切片：先用切片机制备 0.5 μm厚度半薄切片，光镜定位后再制备 60 nm
厚度超薄切片。
染色：用醋酸铀染色 3 min，双蒸水清洗后用枸橼酸铅染色 3 min，再用双蒸水清洗后干燥。
（4）透射电镜观察
将干燥后的样品于透射电镜观察，并拍照，记录。
图2为所选化合物处理后的三株真菌菌丝和孢子超微结构的影响。结果显示处理前三株真菌的细胞壁完整，厚薄均匀，细胞内容物饱满均匀，各细胞器排列整齐。经化合物BT18处理后的孢子细胞壁模糊降解，部分断裂，表面粗糙且厚度不均匀；细胞膜皱缩破损，膜上凹陷，表面粗糙，轮廓不清；细胞器损坏表现为膜碎片；细胞质的结构完整性减弱，内容物泄露；细胞核轻度凝固和压碎；且随着药液浓度的增加，对真菌孢子的超微结构的破坏作用增加。说明化合物BT18和酮康唑对真菌孢子的细胞壁、细胞膜、各细胞器皆存在一定程度的破坏作用。
实施例27
XTT法测定生物被膜活性
实验方法：
在96孔组织培养板中进行生物被膜形成试验。加100 μL的各个菌悬液(浓度1×106 CFU/mL)在SDB培养基中，于37℃静置培养。等真菌粘附90 min后，抽吸培养基，去除未粘附的细胞，再加入不同浓度的化合物BT18和酮康唑。将96孔板于37 ℃进一步孵育24小时。24 h后，取出96孔板，弃去含药培养基后，PBS 洗3次，于各孔中分别加入150 μl XTT/menadione 混合液，37 ℃静置孵育3 h（注意需要避光操作）。3 h后取出，另取出1块新的96孔板，吸取70 μl XTT/menadione 液体上清（尽量避免吸到底部的生物被膜细胞）至新的96孔板对应的各孔中，于495 nm处测OD值。
图3A-3C所示为所选化合物对真菌生物被膜的抑制率。试验结果显示化合物BT18对三株菌生物膜的抑制率优于阳性药酮康唑。
实施例28
对真菌生物膜疏水性的影响：
实验方法：
取6孔板加2mL各个菌悬液(浓度1×106 CFU/mL)，在37℃孵育建立生物膜3h，吸弃上清用PBS清洗2次以除剩余培养基和未黏附菌。加入2mLSDB培养基，设空白，阳性对照，化合物10设立4个浓度：1/2mic、mic、2mic、4mic，培养24h后将形成的生物膜用枪头刮下，PBS清洗3次，加入1.6mLPBS重悬，取1mL混悬菌液测OD600，即为对照组。测完后将菌液回收，将1.6mL菌液中加入0.4mL正辛烷，涡旋3min混匀后静置15min使得两相分离，再测此时的OD600值，即为实验组。疏水性的计算方式如下：
CSH（疏水性）=（OD600对照—OD600实验）/OD600对照×100%
图3D-3F为所选化合物对真菌生物膜疏水性的影响。试验结果显示，化合物BT18对三株菌皆能一定程度上影响真菌生物膜的疏水性。
实施例29
豚鼠模型的构建及药效评价
普通级豚鼠 36只，每组 6只，按体重、性别随机分为 6 组: 空白对照组、模型对照组、阳性药酮康唑组、化合物组取部位涂抹低、中、高剂量组。
实验动物预处理: 除空白对照组外，接种前 3d 开始，每日 1 次股部肌肉注射给予曲安奈德注射液 20 mg/kg·d。将红色毛癣菌菌株接种于综合PDA 培养基，10 d后轻轻用无菌PBS冲洗表面菌丝，收集孢子悬液，调整孢子浓度为 1 × 108cfu / ml待用。
实验前 24 h 剪除实验动物背部毛发，面积为2．5 cm × 2．5cm涂以硫化钡糊剂脱毛，用无菌生理盐水冲洗，电吹风吹干。24 h 后用 75% 酒精擦拭脱毛部位，待脱毛部位残余酒精挥发干燥后，用无菌粗砂纸轻轻磨破豚鼠背部皮肤，以观察到点状渗血为宜，涂布菌悬液，空白对照组涂无菌生理盐水。除空白对照组外的各组动物马上腹腔注射给予地塞米松注射液 7.5 mg/kg，隔日重复注射 1次，共 3~4 次。每日观察实验动物接种处皮肤红肿、渗出、鳞片样改变、脱屑、结痂和毛发生长变化。接种后第 4 d 开始刮取许动物背部接种处皮屑进行 10% 氢氧化钾常规镜检，隔日进行1 次，至接种后第 8 天，同时接种于综合PDA培养基，以镜检和培养阳性为造模成功。
造模成功后 48 h 内开始实验治疗，每日一次，空白对照组和模型对照组不给药。按体表面积计算，化合物低剂量、中剂量、高剂量，每日一次；阳性对照酮康唑乳膏组每次用药量为 0.2g/cm2，空白组、模型组给予基质 0.2g/cm2，每日一次。局部涂搽各种药物时，至少应超过皮损边缘 0.5cm，共给药一周。受试动物组前7天每天1次于感染区涂受试物，后7天停止涂药，阳性对照组前7天每天1次于感染区涂受试物，后7天停止涂药，观察并比较受试物和对照组的结果。各组豚鼠处死后，取病变部位皮肤一分为二，其中一块 10% 甲醛溶液中固定72 h后，石蜡包埋，切片厚 3μm，进行常规苏木精-伊红( HE) 染色后镜检，进行病理分析。
豚鼠接种处皮肤的表观变化
（1）用药处理前豚鼠皮肤表观变化
为了观察 T. rubrum 是否成功感染豚鼠，实验在用药前将各组豚鼠进行脱毛处理，并用无菌粗砂纸磨皮，然后实验组、模型组、阳性组用 T. rubrum 感染磨皮处皮肤，每天观察感染处皮肤变化。
（2）给药处理后豚鼠皮肤表观变化
为了化合物BT18低、中、高剂量组对感染后豚鼠皮肤的治疗效果，实验对比观察了未用药处理的模型对照组和阳性药酮康唑组治疗后的豚鼠皮肤表观变化。
图4为本发明合成化合物用药处理前豚鼠的皮肤表观变化和给药处理后豚鼠的皮肤表观变化。试验结果显示，豚鼠经脱毛处理后皮肤平整，无伤痕；经磨皮后处理，皮肤出现渗血点，和未磨皮处理组对比不是非常明显；经T. rubrum 感染 7 d 后渗血点结成暗红色的红斑，皮肤变硬，同时产生大量皮屑，即 T. rubrum 感染豚鼠构建成功。给药处理后，实验低剂量组给药5 d后，可观察到皮屑对比给药1d部分减少，结痂逐渐脱落，生长新的皮肤组织；用药10 d后可以看出，皮屑大部分消失，红斑面积减少；中剂量组给药5 d后，可观察到皮屑对比给药1 d后开始减少，结痂逐渐脱落，生长新的皮肤组织；用药10 d后可以看出，皮屑大部分消失，红斑面积减少；高剂量组给药5 d后，可观察到比给药1 d后皮屑开始减少，结痂逐渐脱落，生长新的皮肤组织，用药10 d后可以看出，皮屑大部分消失，红斑也基本消退；阳性药组给药5 d后可观察到皮屑对比用药1 d前有所减少，结痂部分脱落，红斑面积减少，用药10 d后，红斑面积基本消退但皮屑还大面积存在；模型组感染5 d后，可观察到大量皮屑生长，结痂处皮屑生长偏多且成块状，出现红斑，感染10 d后，皮屑持续增多并堆积成团状，且直至处死动物，皮屑均未掉落。
实施例30
接种处皮肤组织病理切片分析
为了比较用药前后皮肤组织的变化情况，将各组豚鼠处死，剪取实验处的皮肤做病理切片，用显微镜观察各组组织切片并进行病理分析，对典型病变部位成像并用箭头标识。
病变描述
图5为本发明合成化合物接种处病理切片分析结果。试验结果显示，空白组：皮肤组织各层结构清晰。表皮层结构完整，鳞状上皮细胞形态规则、排列紧密；真皮层胶原纤维丰富，毛囊，皮脂腺等附属器官清晰可见；皮下组织未见明显异常；未见明显的炎性改变。模型组：可见皮肤组织表皮层增厚，小面积的表皮层坏死，角质层小面积的角化不全；真皮层可见小面积的胶原纤维坏死溶解，毛细血管淤血扩张，可见纤维细胞增生，可见明显的炎性细胞浸润。阳性药组：同样出现表皮层增厚，部分表皮层坏死，伴有炎性细胞浸润；给药组：皮肤组织可见表皮层增厚，真皮层可见局灶性的纤维细胞增生，形成成熟的纤维结缔组织，表皮角层化程度逐渐随着给药剂量的增长而恢复正常。
综上，化合物BT18给药组病变程度显著低于模型组和阳性药组，可以治疗主要由红色毛癣菌（T. rubrum）引起的浅表真菌感染。
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