一种定量检测藻蓝蛋白的方法及其专用标准品
阅读说明：本技术 一种定量检测藻蓝蛋白的方法及其专用标准品 (Method for quantitatively detecting phycocyanin and special standard product thereof ) 是由 陈蕾 薛晓杰 姜蕾 于 2021-09-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及分子生物学领域,公开了一种定量检测藻蓝蛋白的方法,包括以下步骤：步骤一,以重组质粒为标准品模板,用实时定量PCR进行PCR扩增,建立标准品的浓度与临界循环数对应的一元线性回归曲线,即得到标准曲线；步骤二,以待测样品替换步骤一中的所述标准品,进行实时定量PCR扩增,根据扩增结果的临界循环数和标准曲线得到待测样品中cpcB基因的拷贝数,即得到待测样品中藻蓝蛋白的含量。(The invention relates to the field of molecular biology, and discloses a method for quantitatively detecting phycocyanin, which comprises the following steps: step one, taking a recombinant plasmid as a standard template, performing PCR amplification by using real-time quantitative PCR, and establishing a unary linear regression curve corresponding to the concentration of the standard and the critical cycle number to obtain a standard curve; and step two, replacing the standard substance in the step one with a sample to be detected, carrying out real-time quantitative PCR amplification, and obtaining the copy number of the cpcB gene in the sample to be detected according to the critical cycle number of the amplification result and a standard curve, so as to obtain the content of the phycocyanin in the sample to be detected.)
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种定量检测藻蓝蛋白的方法及其专用标准品。
背景技术
我国70％以上的湖泊和水库水体处于富营养化或超营养化状态，致使水体功能遭到严重破坏。水体富营养化最常见的结果是藻类会大量繁殖，形成蓝藻水华。蓝藻水华爆发时，可在水面形成一层“绿色浮渣”，水体散发异味，降低了水体水质和景观效果，部分蓝藻水华会释放各种天然毒素，严重威胁生态系统安全。
藻蓝蛋白是藻类进行光合作用重要的辅光色素蛋白之一，主要存在于蓝藻、隐藻，以及部分红藻的藻胆体中。在环境监测中，特别是在蓝藻水华频繁发生的水域，藻蓝蛋白浓度可以有效地表征蓝藻生物量，是水体富营养化及蓝藻水华重点关注指标。因此快速、准确表征水体中藻蓝蛋白，蓝藻水华监测具有重要意义。
发明内容
为克服上述现有技术存在的不足，本发明之目的在于提供一种定量检测藻蓝蛋白的方法及其专用标准品，以实现运用cpcB基因快速分析水体中藻蓝蛋白含量。
为达上述目的，本发明提出一种定量检测藻蓝蛋白的专用标准品，所述标准品为含有cpcB基因的重组质粒，所述cpcB基因的序列是序列表1中的序列。
优选地，所述重组质粒中的出发质粒是pMD-18T。
为达上述目的，本发明还提出一种定量检测藻蓝蛋白的方法，包括以下步骤：
步骤一，以重组质粒为标准品模板，用实时定量PCR进行PCR扩增，建立标准品的浓度与临界循环数对应的一元线性回归曲线，即得到标准曲线；
步骤二，以待测样品替换步骤一中的所述标准品，进行实时定量PCR扩增，根据扩增结果的临界循环数和标准曲线得到待测样品中cpcB基因的拷贝数，即得到待测样品中藻蓝蛋白的含量。
优选地，所述实时定量PCR的扩增体系由实时定量PCR扩增缓冲液、引物对和模板组成；上下游引物在反应体系中的浓度均为0.2μM/L，上游引物为5’-ATGTTACCTACGCTACCTTCTCTGG-3’下游引物为5’-GCGGCTTCTTTCATTTTGCT-3’。
优选地，所述标准模板在所述实时定量PCR扩增的体系中的浓度为4.65×102copies/μL、4.65×103copies/μL、4.65×104copies/μL、4.65×105copies/μL、4.65×106copies/μL和4.65×107copies/μL中之一。
优选地，所述PCR反应中的退火温度为60℃。
与现有技术相比，本发明针对cpcB基因设计特异性引物，采用实时定量PCR方法定量检测水环境中藻蓝蛋白，其关键的技术是制备外标准品，优化实时定量PCR反应条件。本发明的定量检测藻蓝蛋白的标准品具有广谱识别和特异性相结合的特点，敏感性高，制备方法简便，可以长期保存，纯度好，线性检测范围宽，可以用于水环境样品中藻蓝蛋白的快速定量检测。
附图说明
图1为本发明一种定量检测藻蓝蛋白的方法的步骤流程图；
图2为本发明具体实施例中定量PCR标准品的扩增曲线；
图3为本发明具体实施例中标准品PCR溶解曲线。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例并结合附图说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。本发明亦可通过其它不同的具体实例加以施行或应用，本说明书中的各项细节亦可基于不同观点与应用，在不背离本发明的精神下进行各种修饰与变更。
在本发明第一个实施例中，本发明一种定量检测藻蓝蛋白的专用标准品，所述标准品为含有cpcB基因的重组质粒；所述cpcB基因的序列是序列表1中的序列。
优选地，所述重组质粒中的出发质粒是pMD-18T。
在本发明第二个实施例中，本发明一种定量检测藻蓝蛋白的方法，如图1所示，本发明一种定量检测藻蓝蛋白的方法的步骤流程图，包括如下步骤：
步骤101，以重组质粒为标准品模板，用实时定量PCR进行PCR扩增，建立标准品的浓度与临界循环数对应的一元线性回归曲线，即得到标准曲线；
步骤102，以待测样品替换步骤一中的所述标准品，进行实时定量PCR扩增，根据扩增结果的临界循环数和标准曲线得到待测样品中cpcB基因的拷贝数，即得到待测样品中藻蓝蛋白的含量。
优选地，所述实时定量PCR的扩增体系由实时定量PCR扩增缓冲液、引物对和模板组成；上下游引物在反应体系中的浓度均为0.2μM/L，上游引物为5’-ATGTTACCTACGCTACCTTCTCTGG-3’下游引物为5’-GCGGCTTCTTTCATTTTGCT-3’。
优选地，所述标准模板在所述实时定量PCR扩增的体系中的浓度为4.65×102copies/μL、4.65×103copies/μL、4.65×104copies/μL、4.65×105copies/μL、4.65×106copies/μL和4.65×107copies/μL中之一。
优选地，所述PCR反应中退火温度为60℃。
优选地，所述重组质粒为含有cpcB基因的重组质粒；所述cpcB基因的序列是序列表1中的序列，所述序列表1中的序列1由139个脱氧核糖核苷酸组成。
优选地，所述重组质粒中的出发质粒是pMD-18T。
以下将通过具体实施例来进一步说明本发明：
实施例一、定量检测藻蓝蛋白质粒标准品的制备
1、针对cpcB基因设计特异性的引物
在GenBank中下载cpcB基因序列，进行同源性比较分析，设计和合成特异性的引物，PCR产物长度为139bp。引物序列如下：上游引物为5’-ATGTTACCTACGCTACCTTCTCTGG-3’，下游引物为5’-GCGGCTTCTTTCATTTTGCT-3’。用无菌双蒸水将引物配制成100μM的储存液，分装，于-20℃保存。
2、样品中总基因组DNA的提取
利用DNA提取试剂盒进行总DNA提取纯化，得到DNA样本。
3、质粒标准品制备
1)目的片段的制备
以步骤二中的DNA样本为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL。反应程序为：95℃预变性5min，随后95℃15s，退火温度60℃45s和72℃延伸40s，进行45个循环，最终72℃延伸10min。通过1.5％(wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认产物。
2)PCR产物纯化
对目标基因进行纯化：利用Axygen的DNA柱式胶回收试剂盒进行胶回收，对目标基因进行纯化，通过1.5％(wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认回收是否成功。
3)PCR产物与质粒链接
将上述纯化后的PCR产物与质粒载体pMD18-T连接，并进一步转化到DH5α感受态大肠杆菌溶液，然后涂布到加入Amp抗性的LB固体培养基上，通过蓝白斑筛选，挑选转化了质粒的白色菌落。
4)PCR鉴定阳性克隆和测序分析
选取饱满的单菌落接种于含有Amp的液体LB培养液中，于37℃、200转/min振荡培养过夜，用于菌液PCR鉴定和测序分析。
5)质粒标准品的大量获得
将转化了质粒接种于含有Amp的液体LB培养液中，过夜培养，利用质粒提取试剂盒提取质粒，获得大量的质粒标准品。
6)质粒的检测
将上述获得的大量质粒标准品用pH8.0的1×TE缓冲液梯度稀释后，利用超微量核酸蛋白测定仪(NanoDropND-2000C，美国)测定质粒标准品的浓度，计算质粒的拷贝数。计算后确定质粒标准品的拷贝数为4.65×108copies/μL。
实施例二、定量PCR检测方法的建立
1、定量PCR反应条件的优化
利用实施例1中提取的DNA样本作为模板。按照PremixExTaqTM试剂盒说明进行操作，加入实时定量PCR所需试剂，反应体系为20μL，2μLDNA样品。设立阴性对照和阳性对照。
应用ABI公司的SteponeplusDetectionSystem进行实时定量PCR反应，采用两步法进行PCR扩增，反应条件为：预变性，1个循环，95℃15s；PCR反应，45个循环，95℃5s，60℃45s。
实验结果表明，基因cpcB引物的最佳退火温度为60℃，最佳引物浓度为0.2μM/L，扩增效果最好。
2、定量PCR检测限、定量区间及标准曲线
将实施例一得到的质粒标准品进行10倍梯度稀释，作为定量PCR模版DNA。PCR反应体系为20μL，加入2μL质粒标准品作为反应模板，最终浓度为4.65×101～4.65×108copies/μL。以上述优化后的最佳条件进行定量PCR反应。以去离子水作为阴性对照。以标准品稀释梯度的对数值为横坐标，以临界循环数(ThresholdCycle，Ct)为纵坐标建立实时定量PCR的标准曲线。
标准品PCR扩增曲线如图2所示，目的基因的指数扩增期和平台期都十分明显，荧光定量动力学曲线平滑，扩增曲线平滑，说明本研究PCR方法扩增效果较好，可用于定量分析。
利用定量PCR反应条件检测质粒标准品，最低检测限为4.65×101copies/μL，定量检测区间为4.65×102～4.65×107copies/μL，标准曲线方程的标准曲线斜率为-3.56，R2为0.9995，扩增效率E为91％。
以上结果说明本研究的实时定量PCR方法扩增该标准品的效率较高，线性关系良好，检测方法精确可行，符合制备实时定量PCR标准曲线的要求。
3、定量PCR检测方法的特异性分析
标准品PCR溶解曲线如图3所示，通过溶解曲线分析发现，目的基因的溶解曲线呈现单一峰，溶解温度为85.31±1℃，表明基因cpcB可被特异性扩增，说明该PCR方法特异性好，实时定量PCR结果可信。
实施例三、利用定量PCR方法检测实际环境水体中藻蓝蛋白
1、实际水样采集和浓缩
在8月，于水面下0.5m处取地表水样。水样经过0.22μm微孔过滤后，将滤膜保存至-20℃，用于后续实验分析。
2、DNA的提取
实验结束后按照试剂盒操作说明进行样品总DNA的提取纯化，最终每个样品获得DNA样本50μL。
3、定量PCR检测
取2μL获得的DNA样本为模板，进行定量PCR检测，定量PCR检测体系和方法参考实施例二的1。
表1为利用定量PCR检测水体中cpcB基因的拷贝数的最终结果。
可见，本发明一种定量检测藻蓝蛋白的方法及其专用标准品，针对cpcB基因设计特异性引物，采用实时定量PCR方法定量检测水环境中藻蓝蛋白，其关键的技术是制备外标准品，优化实时定量PCR反应条件。
与现有技术相比，本发明优点在于：
本发明定量检测藻蓝蛋白的标准品及检测方法具有广谱识别和特异性相结合的特点，敏感性高，制备方法简便，可以长期保存，纯度好，线性检测范围宽，可以用于水环境样品中藻蓝蛋白的快速定量检测。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何本领域技术人员均可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰与改变。因此，本发明的权利保护范围，应如权利要求书所列。
序列表
<110> 上海城市水资源开发利用国家工程中心有限公司
<120> 一种定量检测藻蓝蛋白的方法及其专用标准品
<130> WISE-1798I-CN
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 139
<212> DNA
<213> 人工合成(人工序列)
<400> 1
atgttaccta cgctaccttc tctggcgacg gcagtgttct cgatgatcgt tgcttaaatg 60
gtctgcgcga aacctatgta gctttgggag taccaggagc ttccgtagct gctggcgtaa 120
gcaaaatgaa agaagccgc 139
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