具体实施方式

本发明基于荧光定量PCR检测平台，在ARMS引物设计方法的基础上，针对SARS-CoV-2的ORF1ab、N和E基因保守区域，Delta和Lambda变异株的棘突蛋白编码基因的L452R、T478K、P681R、G75V&T76I、Δ246-252&D253N 和L452Q突变位点，设计特异性的引物和探针，从而判断是否为SARS-CoV-2 病毒感染，同时鉴定是否为Delta和Lambda变异株。此外，针对P-MRP基因保守区设计特异性的引物探针，作为临床样本的内参对照。

在一个具体实施方式中，本发明提供的2019新型冠状病毒及其德尔塔和拉姆达变异株分型核酸检测试剂盒包括SARS-CoV-2检测液、Delta检测液、 Lambda检测液、一步法PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品，其中：

所述SARS-CoV-2检测液包括：2×PCR buffer、20mM MgCl₂、50mM Tris-HCl、0.5mMdNTP、针对SARS-CoV-2的ORF1ab、N和E基因分别设计的特异性的扩增引物(依次如SEQ IDNO.4、5、7、8、10、11所示)和探针 (依次如SEQ ID NO.6、9、12所示)、P-MRP基因的特异性引物(如SEQ ID NO.1-2所示)和探针(如SEQ ID NO.3所示)，其中，各引物浓度均为0.2mM、探针浓度均为0.1mM；

所涉及的引物和探针序列如表1所示，其中，探针P0的5'端标记有报告荧光染料ROX、3'端标记有淬灭荧光染料BHQ，探针P1的5'端标记有报告荧光染料FAM、3'端标记有淬灭荧光染料BHQ，探针P2的5'端标记有报告荧光染料VIC、3'端标记有淬灭荧光染料BHQ，探针P3的5'端标记有报告荧光染料CY5、3'端标记有淬灭荧光染料BHQ。

所述Delta检测液包括：2×PCR buffer、20mM MgCl₂、50mM Tris-HCl、 0.5mMdNTP、针对Delta变异株L452R、T478K和P681R突变位点分别设计的特异性的扩增引物(依次如SEQ ID NO.13、14、17、18所示)和探针(依次如SEQ ID NO.15、16、19所示)、P-MRP基因特异性的引物(如SEQ ID NO.1-2所示)和探针(如SEQ ID NO.3所示)，其中，各引物浓度均为0.2mM、探针浓度均为0.1mM；

所涉及的引物和探针序列如表1所示，其中，探针P0的5'端标记有报告荧光染料ROX、3'端标记有淬灭荧光染料BHQ，探针P4的5'端标记有报告荧光染料FAM、3'端标记有淬灭荧光染料BHQ，探针P5的5'端标记有报告荧光染料VIC、3'端标记有淬灭荧光染料BHQ，探针P6的5'端标记有报告荧光染料CY5、3'端标记有淬灭荧光染料BHQ。

所述Lambda检测液包括2×PCR buffer、20mM MgCl₂、50mM Tris-HCl、 0.5mMdNTP、针对Lambda变异株G75V&T76I、Δ246-252&D253N和L452Q 突变位点分别设计的特异性的扩增引物(依次如SEQ ID NO.20、21、23、24、 26、27所示)和探针(依次如SEQ IDNO.22、25、28所示)、P-MRP基因特异性的引物(如SEQ ID NO.1-2所示)和探针(如SEQ IDNO.3所示)，其中，各引物浓度均为0.2mM、探针浓度均为0.1mM；

所涉及的引物和探针序列如表1所示，其中，探针P0的5'端标记有报告荧光染料ROX、3'端标记有淬灭荧光染料BHQ，探针P7的5'端标记有报告荧光染料FAM、3'端标记有淬灭荧光染料BHQ，探针P8的5'端标记有报告荧光染料VIC、3'端标记有淬灭荧光染料BHQ，探针P9的5'端标记有报告荧光染料、3'端标记有淬灭荧光染料BHQ。

表1引物和探针列表

一步法PCR反应液包括：1U/μl逆转录酶、2U/μl Taq-DNA聚合酶、2 U/μl RNase抑制剂、0.2U/μl UNG酶；

阳性对照品包括：携带SARS-CoV-2的ORF1ab、N和E基因的假病毒 RNA、携带Delta变异株棘突蛋白编码基因L452R、T478K和P681R突变的假病毒RNA、携带Lambda变异株棘突蛋白编码基因G75V&T76I、Δ 246-252&D253N和L452Q突变的假病毒RNA、携带内参基因P-MRP的假病毒RNA；

阴性对照品：DEPC水。

在另一个具体实施方式中，本发明提供的2019新型冠状病毒及其德尔塔和拉姆达变异株分型核酸检测方法包括以下步骤：

(1)使用核酸提取试剂，分别将临床样本、阴性质控品、阳性质控品进行核酸提取，然后将提取的核酸样品用于PCR检测；

(2)以上述提取的临床样本、阴性质控品和阳性质控品的核酸样品为模板，按照表2所示的PCR反应体系，每个样品分别使用SARS-CoV-2检测液、 Delta检测液和Lambda检测液进行多重荧光定量PCR检测，使用仪器型号为 ABI 7500，扩增程序如表3所示；

表2 PCR反应体系

表3扩增程序

(3)数据处理：反应结束后，根据实际情况分别调节FAM、VIC和CY5 通道的Baseline的Start值、End值以及Threshold的Value值(Start值建议设在5～10、End值建议设在10～20，同时调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击Analysis获得分析结果，得到FAM、VIC、CY5和ROX通道的Ct值；

(4)有效性判读：阴性和阳性质控品检测结果需满足表4要求，否则本次实验结果无效；

表4阴性和阳性质控品

(5)结果判读：

A.SARS-CoV-2管检测结果：ROX通道CT≤39为内参阳性，FAM通道CT≤39为ORF1ab基因阳性，VIC通道CT≤39为N基因阳性，CY5通道 CT≤39为E基因阳性；若ROX通道阳性，同时FAM、VIC和CY5通道均为阳性，则判断为2019新型冠状病毒阳性样本。若ROX通道阳性，同时FAM、 VIC和CY5通道均为阴性，则判断为2019新型冠状病毒阴性样本；若ROX 通道阳性，FAM、VIC和CY5中的一个或二个通道为阳性，则判断为疑似阳性样本，如复检结果仍为疑似，则判断为阴性样本；若ROX通道阴性，则FAM、 VIC和CY5通道检测结果无效，建议复测或重新采样。

B.Delta管检测结果：ROX通道CT≤39为内参阳性，FAM通道CT≤ 39为L452R突变阳性，VIC通道CT≤39为T478K突变阳性，CY5通道CT ≤39为P681R突变阳性。若ROX通道阳性，同时FAM、VIC和CY5通道均为阳性，则判断为德尔塔变异株阳性样本；若ROX通道阳性，FAM、VIC和 CY5中的一个、二个或三个通道为阴性，则判断为阴性样本；若ROX通道阴性，则FAM、VIC和CY5通道检测结果无效，建议复测或重新采样。

C.Lambda管检测结果：ROX通道CT≤39为内参阳性，FAM通道CT ≤39为G75V和T76I突变阳性，VIC通道CT≤39为Δ246-252和D253N突变阳性，CY5通道CT≤39为L452Q突变阳性。若ROX通道阳性，同时FAM、 VIC和CY5通道均为阳性，则判断为拉姆达变异株阳性样本；若ROX通道阳性，FAM、VIC和CY5中的一个、二个或三个通道为阴性，则判断为阴性样本；若ROX通道阴性，则FAM、VIC和CY5通道检测结果无效，建议复测或重新采样。

D.检测结果的判读：若SARS-CoV-2管检测结果为阳性，同时Delta管检测结果为阳性，则判断为2019新型冠状病毒德尔塔变异株阳性样本；若SARS-CoV-2管检测结果为阳性，同时Lambda管检测结果为阳性，则判断为 2019新型冠状病毒拉姆达变异株阳性样本；若SARS-CoV-2管检测结果为阳性，Delta管和Lambda管检测结果为阴性，则判断为2019新型冠状病毒阳性样本，且该阳性样本不属于德尔塔和拉姆达变异株；若SARS-CoV-2管检测结果为阴性，则无论Delta管和Lambda管检测结果如何，均为2019新型冠状病毒阴性样本。

首先，本发明采用SARS-CoV-2的ORF1ab、N和E基因特异性的扩增引物和探针，Delta变异株棘突蛋白编码基因L452R、T478K和P681R突变特异性的扩增引物和探针，Lambda变异株棘突蛋白编码基因G75V&T76I、Δ246-252&D253N和L452Q突变特异性的扩增引物和探针，这些引物和探针序列为首创且设计独特，特异性好，灵敏度高，实现不仅能够筛查SARS-CoV-2 阳性，还能鉴别是否为Delta和Lambda变异株。其次，本发明采用一步法PCR 反应液配方，该配方可直接使用RNA为模板，适用于多重荧光PCR扩增，且PCR扩增效率高，有效提高目标序列的检测灵敏度。

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为可从商业渠道购买得到的产品。

实施例1：引物和探针的设计

根据2019新型冠状病毒ORF1ab、N和E基因保守区域，以及Delta和 Lambda变异株的棘突蛋白编码基因的L452R、T478K、P681R、G75V&T76I、Δ246-252&D253N和L452Q突变位点，设计特异性的引物和探针；其检测效果不仅可以判断是否为2019新型冠状病毒，还能鉴别是否为德尔塔和拉姆达变异株。其特异性引物和探针如下：

引物F0：CGGTGTTTGCAGATTTGGACCT

引物R0：CGCGATTTTCCCTGTACAATTG

探针P0：ROX-ACCTTGGCTATTCAGTTGTTGCT-BHQ

引物F1：CACATAGATCATCCAAATCCTAA

引物R1：CTGTATACGACATCAGTACTAGTGC

探针P1：FAM-TGCTAATGACCCTGTGGGTTTTAC-BHQ

引物F2：AGGCAGCAGTAGGGGAACTTCT

引物R2：CCGAAAGCTTGTGTTACATTGTA

探针P2：VIC-CTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAA-BHQ

引物F3：ATTCGTTTCGGAAGAGACAGGTACG

引物R3：CGTAGACCAGAAGATCAGGAACTC

探针P3：CY5-CTTCGATTGTGTGCGTACTGCTGC-BHQ

引物F4：GTTGGTGGTAATTACAATTACCGG

引物R4：TAAACCACTGAAGTTGAAATTGAC

探针P4：FAM-GAGAGATATTTCAACTGAAATCT-BHQ

探针P5：VIC-CCGGTAGCAAACCTTGTAATGG-BHQ

引物F5：GACTCAGACTAATTCTCGTCG

引物R5：CTAATAGTAAAATTTGTGGGTATGGC

探针P6：ROX-TGTAGCTAGTCAATCCATCATTGC-BHQ

引物F6：TGTCTCTGGGACCAATGTTATTAA

引物R6：TGTTTTTGTGGTAATAAACACCCAA

探针P7：FAM-CTAACATAATAAGAGGCTGGATT-BHQ

引物F7：TACTTGCTTTACATAATTCTTCT

引物R7：AACAATAGATTCTGTTGGTTGGACT

探针P8：VIC-AACTGGAACCATTACAGATGCTGTA-BHQ

引物F8：TGGTGGTAACTATAATTACCAGT

引物R8：GACCATATGATTGTAAAGGAGAGT

探针P9：CY5-CAACTGAAATCTATCAGGCCGT-BHQ

实施例2：2019新型冠状病毒及其德尔塔和拉姆达变异株分型核酸检测方法

(1)材料、试剂、仪器：提取试剂使用菲鹏生物股份有限公司的磁珠法病毒核酸提取试剂，引物和探针(按照实施例1设计)委托上海捷瑞生物工程有限公司合成，RNA假病毒委托生工生物工程(上海)股份有限公司定制合成，荧光定量PCR仪采用美国赛默飞ABI7500。

(2)样品准备：阳性样本为人感染2019新型冠状病毒后的灭活病毒咽拭子样本；阴性对照标本为健康人的咽拭子样本。以上样本均来源于某临床单位。

(3)核酸提取：使用磁珠法病毒核酸提取试剂盒，分别提取阴/阳性样本、阳性对照品、阴性对照品的核酸，然后用于PCR检测。

(4)PCR扩增：

a.引物和探针：按照实施例1设计并进行合成。

b.阳性对照：

本方法中的阳性对照品包括携带SARS-CoV-2的ORF1ab、N和E基因的假病毒RNA，携带Delta变异株棘突蛋白编码基因L452R、T478K和P681R 突变的假病毒RNA，携带Lambda变异株棘突蛋白编码基因G75V&T76I、Δ 246-252&D253N和L452Q突变的假病毒RNA，以及携带内参基因P-MRP的假病毒RNA；用DEPC水进行10⁶倍稀释，将稀释后的假病毒RNA混合液作为本方法中的阳性质控品。

c.一步法RT-PCR反应平台：

PCR反应体系(总体积25μl)包括：一步法PCR反应液2.5μl， SARS-CoV-2检测液/Delta检测液/Lambda检测液12.5μl，核酸标本10μl。

PCR扩增反应条件：50℃逆转录20min；95℃预变性2min；95℃变性10s， 60℃退火和延伸40s(收集FAM/VIC/CY5/ROX通道荧光)，40个循环。

d.数据处理：反应结束后，根据实际情况分别调节FAM、VIC和CY5 通道的基线的Start值、End值以及阈值线的值(Start值建议设在5～10、End 值建议设在10～20，同时调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击Analysis获得分析结果，得到FAM、VIC、CY5和ROX通道的Ct值；

e.有效性判读：阴性和阳性对照品检测结果需满足表4要求，否则本次实验结果无效。

f.结果判读：

A.SARS-CoV-2检测液的阳性或阴性的标准为：

ROX通道CT≤39为内参阳性，FAM通道CT≤39为ORF1ab基因阳性， VIC通道CT≤39为N基因阳性，CY5通道CT≤39为E基因阳性；

进行结果判读时：

若ROX通道阳性，同时FAM、VIC和CY5通道均为阳性，则判断为2019 新型冠状病毒阳性样本；

若ROX通道阳性，同时FAM、VIC和CY5通道均为阴性，则判断为2019 新型冠状病毒阴性样本；

若ROX通道阳性，FAM、VIC和CY5中的一个或二个通道为阳性，则判断为疑似阳性样本，如复检结果仍为疑似，则判断为阴性样本；

若ROX通道阴性，则FAM、VIC和CY5通道检测结果无效，建议复测或重新采样；

B.Delta检测液的阳性或阴性的标准为：

ROX通道CT≤39为内参阳性，FAM通道CT≤39为L452R突变阳性， VIC通道CT≤39为T478K突变阳性，CY5通道CT≤39为P681R突变阳性；

进行结果判读时：

若ROX通道阳性，同时FAM、VIC和CY5通道均为阳性，则判断为德尔塔变异株阳性样本；

若ROX通道阳性，FAM、VIC和CY5中的一个、二个或三个通道为阴性，则判断为阴性样本；

若ROX通道阴性，则FAM、VIC和CY5通道检测结果无效，建议复测或重新采样；

C.Lambda检测液的阳性或阴性的标准为：

ROX通道CT≤39为内参阳性，FAM通道CT≤39为G75V和T76I突变阳性，VIC通道CT≤39为Δ246-252和D253N突变阳性，CY5通道CT≤ 39为L452Q突变阳性；

进行结果判读时：

若ROX通道阳性，同时FAM、VIC和CY5通道均为阳性，则判断为拉姆达变异株阳性样本；

若ROX通道阳性，FAM、VIC和CY5中的一个、二个或三个通道为阴性，则判断为阴性样本；

若ROX通道阴性，则FAM、VIC和CY5通道检测结果无效，建议复测或重新采样；

D.最终检测结果的判读为：

若SARS-CoV-2管检测结果为阳性，同时Delta管检测结果为阳性，则判断为2019新型冠状病毒德尔塔变异株阳性样本；

若SARS-CoV-2管检测结果为阳性，同时Lambda管检测结果为阳性，则判断为2019新型冠状病毒拉姆达变异株阳性样本；

若SARS-CoV-2管检测结果为阳性，Delta管和Lambda管检测结果为阴性，则判断为2019新型冠状病毒阳性样本，且该阳性样本不属于德尔塔和拉姆达变异株；

若SARS-CoV-2管检测结果为阴性，则无论Delta管和Lambda管检测结果如何，均为2019新型冠状病毒阴性样本。

(5)特异性与灵敏性检测试验结果：

a.特异性检测结果：

将携带SARS-CoV-2的ORF1ab、N和E基因的RNA假病毒模拟样本，携带T19R、L452R、T478K和P681R突变的RNA假病毒模拟样本，携带G75V、 T76I、Δ246-252、D253N、L452Q和F490S突变的RNA假病毒模拟样本，甲型流感病毒的RNA假病毒模拟样本，乙型流感病毒的RNA假病毒模拟样本，支原体，人类基因组(293T细胞系来源)以及阴性样本(DEPC水)分别通过以上检测方法进行测试，特异性检测结果见图1～3。

如图1所示，依据本发明建立的多重荧光PCR方法对SARS-CoV-2的 ORF1ab、N和E基因具有较好的特异性，对携带这三个基因的假病毒RNA 模拟样本的检测结果显示阳性，对其它病原体、人类基因组和空白对照(以 DEPC水为样本，经过核酸提取后得到的样本)等均无交叉反应。

如图2所示，依据本发明建立的多重荧光PCR方法对Delta变异株棘突蛋白编码基因L452R、T478K和P681R突变位点具有较好的特异性，对携带这三种突变位点的假病毒RNA模拟样本的检测结果显示阳性，对其它病原体、人类基因组和空白对照等均无交叉反应。

如图3所示，依据本发明建立的多重荧光PCR方法对Lambda变异株棘突蛋白编码基因G75V&T76I、Δ246-252&D253N和L452Q突变位点具有较好的特异性，对携带这些突变位点的假病毒RNA模拟样本的检测结果显示阳性，对其它病原体、人类基因组和空白对照等均无交叉反应。

b.灵敏性检测结果：

将携带SARS-CoV-2的ORF1ab、N和E基因的RNA假病毒模拟样本使用病毒核酸快速提取试剂进行核酸提取，然后使用Qubit 4.0仪器测定RNA浓度，按照定制的RNA假病毒产品说明书中的换算公式计算出样本的拷贝数，从而进行RNA定量分析。然后将其分别稀释至2000、2、0拷贝/μl，用本发明建立的多重荧光PCR方法进行检测。相关灵敏性检测结果见图4～6。如图4 (ORF1ab基因)、图5(N基因)、图6(E基因)所示，图中A、B、C的扩增曲线依次表示采用本扩增体系对2000、2、0拷贝/μl的假病毒RNA模拟样本进行扩增检测的结果，A1、B1、C1分别为其对应的内参基因检测结果，结果表明本方法检测SARS-CoV-2的ORF1ab、N和E基因的敏感性达到2拷贝 /μl。

将携带Delta变异株棘突蛋白编码基因L452R、T478K和P681R突变位点的RNA假病毒模拟样本使用市售的病毒核酸快速提取试剂进行核酸提取，然后使用Qubit 4.0仪器测定RNA浓度，按照定制的RNA假病毒产品说明书中的换算公式计算出样本的拷贝数，从而进行RNA定量分析。然后将其分别稀释至2000、5、0拷贝/μl，用本发明建立的多重荧光PCR方法进行检测。相关灵敏性检测结果见图7～9。如图7(L452R)、图8(T478K)、图9(P681R) 所示，图中A、B、C的扩增曲线依次表示采用本扩增体系对2000、5、0拷贝/μl的假病毒RNA模拟样本进行扩增检测的结果，A1、B1、C1分别为其对应的内参基因检测结果，结果表明本方法检测Delta变异株的敏感性达到5 拷贝/μl。

将携带Lambda变异株棘突蛋白编码基因G75V&T76I、Δ 246-252&D253N和L452Q突变位点的RNA假病毒模拟样本使用市售的病毒核酸快速提取试剂进行核酸提取，然后使用Qubit 4.0仪器测定RNA浓度，按照定制的RNA假病毒产品说明书中的换算公式计算出样本的拷贝数，从而进行RNA定量分析。然后将其分别稀释至2000、5、0拷贝/μl，用本发明建立的多重荧光PCR方法进行检测。相关灵敏性检测结果见图10～12。如图10 (G75V&T76I)、图11(Δ246-252&D253N)、图12(L452Q)所示，图中A、 B、C的扩增曲线依次表示采用本扩增体系对2000、5、0拷贝/μl的假病毒 RNA模拟样本进行扩增检测的结果，A1、B1、C1分别为其对应的内参基因检测结果，结果表明本方法检测Lambda变异株的敏感性达到5拷贝/μl。

实施例3：临床样本的验证

(1)材料、试剂、仪器：参照实施例2。

(2)标本准备：收集10例临床上做核酸检测的疑似患者的灭活病毒咽拭子样本作为待测样本，同时收集1例已确诊感染2019新型冠状病毒、1例已确诊感染2019新型冠状病毒德尔塔变异株和1例已确诊感染2019新型冠状病毒拉姆达变异株的灭活病毒咽拭子样本分别作为阳性参考品1、阳性参考品2和阳性参考品3，采集5例健康人的咽拭子样本作为阴性参考品。以上样本均来源于某临床单位。

(3)核酸提取：使用磁珠法病毒核酸提取试剂盒，分别提取待测样本、阳性参考品、阴性参考品的核酸，然后用于PCR检测。

(4)PCR扩增：参照实施例2。

(5)对比试剂：使用市售的2019新型冠状病毒核酸检测试剂(上海之江生物科技股份有限公司，新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光 PCR法)，25人份/盒，国械注准20203400057)作为对比试剂对以上临床样本对检测结果进行验证，同时通过二代测序方法(委托第三方医学检验单位做的新冠病毒测序项目)对检测结果做进一步验证。

(6)检测结果：如表5所示，本发明开发的检测试剂对临床样本的检测结果与市售的对比试剂和二代测序结果完全吻合。其中，二代测序方法所用检测周期约为两周，检测费用在3000-4000元/例；而本发明使用的检测方法所需检测周期在一天以内，检测费用低于50元/例。

由此说明，本发明开发的2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)及其德尔塔(Delta)和拉姆达(Lambda)变异株分型核酸检测试剂及方法的检测效果准确可靠，既弥补了市售的2019新型冠状病毒对比试剂无法鉴别德尔塔和拉姆达变异株的缺陷，又避免了二代测序检测周期长、成本贵、操作复杂的缺陷。

表5临床样本检测结果

序列表

<110> 北京艾瑞克阳医疗科技有限公司

<120> 2019新型冠状病毒及其德尔塔和拉姆达变异株分型核酸检测试剂盒及检测方法

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> P-MRP 正向引物(人工序列)

<400> 1

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> P-MRP 反向引物(人工序列)

<400> 2

<210> 3

<211> 23

<212> RNA

<213> P-MRP 探针P0(人工序列)

<400> 3

<210> 4

<211> 23

<212> RNA

<213> ORF1ab 正向引物(人工序列)

<400> 4

<210> 5

<211> 25

<212> RNA

<213> ORF1ab 反向引物(人工序列)

<400> 5

<210> 6

<211> 24

<212> RNA

<213> ORF1ab 探针P1(人工序列)

<400> 6

<210> 7

<211> 22

<212> RNA

<213> N基因 正向引物(人工序列)

<400> 7

<210> 8

<211> 23

<212> RNA

<213> N基因 反向引物(人工序列)

<400> 8

<210> 9

<211> 24

<212> RNA

<213> N基因 探针P2(人工序列)

<400> 9

<210> 10

<211> 25

<212> RNA

<213> E基因 正向引物(人工序列)

<400> 10

<210> 11

<211> 24

<212> RNA

<213> E基因 反向引物(人工序列)

<400> 11

<210> 12

<211> 24

<212> RNA

<213> E基因 探针P3(人工序列)

<400> 12

<210> 13

<211> 24

<212> RNA

<213> L452R/T478K 正向引物(人工序列)

<400> 13

<210> 14

<211> 24

<212> RNA

<213> L452R/T478K 反向引物(人工序列)

<400> 14

<210> 15

<211> 23

<212> RNA

<213> L452R/T478K 探针P4(人工序列)

<400> 15

<210> 16

<211> 22

<212> RNA

<213> L452R/T478K 探针P5(人工序列)

<400> 16

<210> 17

<211> 21

<212> RNA

<213> P681R 正向引物(人工序列)

<400> 17

<210> 18

<211> 26

<212> RNA

<213> P681R 反向引物(人工序列)

<400> 18

<210> 19

<211> 24

<212> RNA

<213> P681R 探针P6(人工序列)

<400> 19

<210> 20

<211> 24

<212> RNA

<213> G75V/T76I 正向引物(人工序列)

<400> 20

<210> 21

<211> 25

<212> RNA

<213> G75V/T76I 反向引物(人工序列)

<400> 21

<210> 22

<211> 23

<212> RNA

<213> G75V/T76I 探针P7(人工序列)

<400> 22

<210> 23

<211> 23

<212> RNA

<213> Δ246-252/D253N 正向引物(人工序列)

<400> 23

<210> 24

<211> 25

<212> RNA

<213> Δ246-252/D253N 反向引物(人工序列)

<400> 24

<210> 25

<211> 25

<212> RNA

<213> Δ246-252/D253N 探针P8(人工序列)

<400> 25

<210> 26

<211> 23

<212> RNA

<213> L452Q/F490S 正向引物(人工序列)

<400> 26

<210> 27

<211> 24

<212> RNA

<213> L452Q/F490S 反向引物(人工序列)

<400> 27

<210> 28

<211> 22

<212> RNA

<213> L452Q/F490S 探针P9(人工序列)

<400> 28