一种检测叙利亚仓鼠多瘤病毒的试剂盒及其检测方法
阅读说明：本技术 一种检测叙利亚仓鼠多瘤病毒的试剂盒及其检测方法 (Kit for detecting Syrian hamster polyoma virus and detection method thereof ) 是由 苗晋鑫 于 2021-09-07 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种检测叙利亚仓鼠多瘤病毒的试剂盒及其检测方法,涉及叙利亚仓鼠多瘤病毒检测技术领域,所述试剂盒包括叙利亚仓鼠多瘤病毒检测试剂、阳性对照和阴性对照；所述叙利亚仓鼠多瘤病毒检测试剂中包括HaPV1-F/R、HaPV2-F/R、HaPV3-F/R三对引物,本发明针对叙利亚仓鼠多瘤病毒核酸序列特点,设计不同靶点引物,上述引物对分别应用聚合酶链式反应引物组和荧光定量PCR反应引物组,提高检测的准确性和可靠性,防止漏检。本发明试剂盒对叙利亚仓鼠多瘤病毒检测准确度高,可有效避免检测结果呈假阳性或假阴性。另外,本发明采用的检测体系的特异性更好,不受其他病原体及影响,灵敏度更高,可实现叙利亚仓鼠多瘤病毒低拷贝样本的检测。(The invention provides a kit for detecting Syrian hamster polyoma virus and a detection method thereof, relating to the technical field of Syrian hamster polyoma virus detection, wherein the kit comprises a Syrian hamster polyoma virus detection reagent, a positive control and a negative control; the detection reagent for the syrian hamster polyoma virus comprises three pairs of primers HaPV1-F/R, HaPV2-F/R, HaPV3-F/R, different target primers are designed according to the characteristics of nucleic acid sequences of the syrian hamster polyoma virus, and a polymerase chain reaction primer group and a fluorescent quantitative PCR reaction primer group are respectively applied to the primer pairs, so that the detection accuracy and reliability are improved, and the omission is prevented. The kit has high detection accuracy on the Syrian hamster polyoma virus, and can effectively avoid the detection result from being false positive or false negative. In addition, the detection system adopted by the invention has better specificity, is not influenced by other pathogens, has higher sensitivity, and can realize the detection of the low copy sample of the syrian hamster polyoma virus.)
技术领域
本发明涉及叙利亚仓鼠多瘤病毒检测技术领域，具体地，涉及一种检测叙利亚仓鼠多瘤病毒的试剂盒及其检测方法。
背景技术
叙利亚仓鼠多瘤病毒(HaPV)属于乳多空病毒科多瘤病毒属，该病毒一般只在叙利亚仓鼠间传染。叙利亚仓鼠是使用最广泛的啮齿动物物种之一，为肿瘤学、免疫学、生理学和生殖生物学提供实验模型，而仓鼠多瘤病毒通常在叙利亚仓鼠之间自然发生并高度传播，其他品种感染该的可能性非常低。该病毒在叙利亚仓鼠体内从感染到病发其潜伏期可长达4-30周，幼鼠通过接触携带病毒的成年鼠的尿液、粪便、唾液、皮屑等即可被感染，该病毒极易被传播。当HaPV感染非允许细胞时，会发生基因组整合或附加扩增以及晚期编码区的非随机缺失，导致细胞病毒转化为肿瘤。叙利亚仓鼠感染HaPV后，可诱发起源于肠系膜并转移到肝、肾等组织器官淋巴瘤，淋巴细胞感染该病毒会导致淋巴肿瘤进而导致叙利亚仓鼠死亡。目前针对该病毒在叙利亚仓鼠之间的传播尚未有有效的治疗方法。
编码p53蛋白的Tp53肿瘤抑制基因是人类癌症中最常见的突变基因，在人类癌症中发生中约占50％以上，继承突变Tp53等位基因的人类会患利弗劳梅尼综合征(Li-Fraumeni Syndrome，LFS)，其特征是一系列早发性癌症，包括绝经前乳腺癌、软组织和骨肉瘤、肺癌、胰腺癌、皮肤癌等。目前研究者通过建立p53基因缺陷的仓鼠模型进而研究有关Tp53缺乏症导致人类癌症的发病机制。p53基因敲除叙利亚仓鼠常表现为盲肠粘连于左腹壁，右睾丸粘连于空肠，肠系膜淋巴结明显肿大，腹部多处粘连，肺、肝、肾、胃、十二指肠、盲肠、睾丸多组织表现淋巴瘤。而感染HaPV的叙利亚仓鼠同样会表现出淋巴瘤，这就阻碍了研究者判断小鼠模型是因为p53基因敲除还是因为病毒感染导致的淋巴瘤，影响研究进程。目前，叙利亚仓鼠也是研究2019新型冠状病毒感染的常用小动物模型，野生叙利亚仓鼠被感染新冠病毒后可能出现一般轻微症状，免疫缺陷叙利亚仓鼠被感染新冠病毒后则会出现严重症状，而HaPV感染存在影响叙利亚仓鼠作为研究新冠病毒小鼠模型的实验结果的真实性和导致动物死亡。HaPV病毒同时也影响大规模饲养繁殖叙利亚仓鼠的产量。目前尚未有检测叙利亚仓鼠多瘤病毒的PCR检测试剂盒，基于以上背景，开发一种操作简便、准确高效、检测周期短的叙利亚仓鼠多瘤病毒检测试剂盒及其检测方法是十分重要的。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供一种操作简便、准确高效、检测周期短的叙利亚仓鼠多瘤病毒检测试剂盒及其检测方法。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一方面，本发明提供了一种检测叙利亚仓鼠多瘤病毒检测试剂，所述检测试剂包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶，所述检测试剂还包括三对引物，分别为第一引物对HaPV1-F、HaPV1-R；第二引物对HaPV2-F、HaPV2-R；第三引物对HaPV3-F、HaPV3-R；上述引物分别具有以下碱基序列：
HaPV1-F：5’-CTCCCCTGTTTCTATTTCC-3’SEQ ID NO：1
HaPV1-R：5’-CATCACATTTAGCCACACAG-3’SEQ ID NO：2
HaPV2-F：5’-CTGTGACGAGGAATACCCA-3’SEQ ID NO：3
HaPV2-R：5’-CAGGAAGCTAACGGTACAAA-3’SEQ ID NO：4
HaPV3-F：5’-ACTTCAACAGCACGGAGGAG-3’SEQ ID NO：5
HaPV3-R：5’-GCGTGAGAAAGAAACCCCCT-3’SEQ ID NO：6
优选地，所述PCR缓冲液中加入MgCl2获得浓度为25mM。
优选地，所述DNA聚合酶为Tap酶，最佳的是热启动Tap酶。
优选地，所述三对引物中各引物的浓度均为45-55μM，最佳浓度为50μM。
另一方面，本发明还提供了一种检测叙利亚仓鼠多瘤病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述多留仓鼠病毒检测试剂、阳性对照和阴性对照；所述试剂盒还包括病毒保存液；所述病毒保存液为Hank's平衡盐或PBS缓冲液中的一种。
优选地，所述阳性对照包括含有针对叙利亚仓鼠多瘤病毒特征序列的人工合成DNA片段，该人工序列可以为但不限于如SEQ ID NO：7所示；所述阳性对照中的叙利亚仓鼠多瘤病毒序列可以被第一引物对或第二引物对通过聚合酶链式反应PCR法检测出，也可以被第三引物对通过荧光定量PCR反应法检测出。
优选地，所述阴性对照中可以含或不含有其他DNA病毒得到的序列，包括但不限于疱疹病毒DNA序列。
又一方面，本发明还提供了一种检测仓鼠多瘤病毒的试剂盒的检测方法，所述方法包括病毒核酸提取、核酸进行PCR反应扩增、结果判定。
优选地，所述结果判定可采用琼脂糖凝胶电泳检测聚合酶链式反应PCR扩增产物，若扩增产物分别在641bp和544bp出现条带，则样品中含有HaPV。
优选地，所述结果判定还可以采用荧光定量PCR进行检测，具体方法为根据核酸扩增步骤得到的扩增曲线上的指数扩增阶段设定阈值(threshold)，得到对应的Ct值，阳性对照Ct值为PTC。若样品扩增曲线图Ct值≤PTC+6，并有明显指数增长，则样品中含有HaPV。
优选地，利用本发明的仓鼠多瘤病毒试剂盒通过琼脂糖凝胶电泳进行检测时，PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸30sec，循环35次；最后72℃延伸2min。
优选地，利用本发明的仓鼠多瘤病毒试剂盒通过荧光定量PCR进行检测时，PCR反应条件为：50℃2min；95℃预变性12min；95℃变性15sec，64℃延伸1min，循环5次；95℃变性15sec，58℃延伸1min，循环40次。
(三)有益效果
本发明提供了一种检测叙利亚仓鼠多瘤病毒的试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括叙利亚仓鼠多瘤病毒检测试剂、阳性对照和阴性对照；所述叙利亚仓鼠多瘤病毒检测试剂中包括HaPV1-F/R、HaPV2-F/R、HaPV3-F/R三对引物，在引物的设计过程中，本发明尽量避免发卡结构、引物内部二聚体、引物间二聚体以及错配的形成，通过对NCBI Blast在线数据库对上述设计的特异性引物序列进行比对分析，避免与其他病毒和叙利亚仓鼠基因发生非特异结合，针对叙利亚仓鼠多瘤病毒核酸序列特点，设计不同靶点引物，上述引物对分别应用聚合酶链式反应引物组和荧光定量PCR反应引物组，提高检测的准确性和可靠性，防止漏检上述。本发明试剂盒对叙利亚仓鼠多瘤病毒检测准确度高，可有效避免检测结果呈假阳性或假阴性。另外，本发明采用的检测体系的特异性更好，不受其他病原体及影响，灵敏度更高，可实现叙利亚仓鼠多瘤病毒低拷贝样本的检测。
附图说明
图1为本发明所述试剂盒操作流程图；
图2为使用叙利亚仓鼠多瘤病毒特异性引物对HaPV1和HaPV2的PCR扩增子的琼脂糖凝胶电泳图。
图3为本发明所述HaPV病毒检测阳性结果和阴性示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种检测叙利亚仓鼠多瘤病毒的试剂盒
1.合成引物
在引物的设计过程中，本发明尽量避免发卡结构、引物内部二聚体、引物间二聚体以及错配的形成，通过对NCBI Blast在线数据库对设计的特异性引物序列进行比对分析避免与其他病毒和叙利亚仓鼠基因发生非特异结合。针对叙利亚仓鼠多瘤病毒核酸序列特点，设计不同靶点引物，分别应用聚合酶链式反应引物组和荧光定量PCR反应引物组，提高检测的准确性和可靠性，防止漏检上述。具体引物对序列如下所示：
第一引物对序列：
HaPV1-F上游引物：5’-CTCCCCTGTTTCTATTTCC-3’(SEQ ID NO：1)
HaPV1-R下游引物：5’-CATCACATTTAGCCACACAG-3’(SEQ ID NO：2)
第二引物对序列：
HaPV2-F上游引物：5’-CTGTGACGAGGAATACCCA-3’(SEQ ID NO：3)
HaPV2-R下游引物：5’-CAGGAAGCTAACGGTACAAA-3’(SEQ ID NO：4)
第三引物对序列：
HaPV3-F上游引物：5’-ACTTCAACAGCACGGAGGAG-3’(SEQ ID NO：5)
HaPV3-R下游引物：5’-GCGTGAGAAAGAAACCCCCT-3’(SEQ ID NO：6)
上述序列合成后于三对引物分别于无菌超纯水中储存。
2.合成阳性对照序列：
阳性对照包括含有针对叙利亚仓鼠多瘤病毒特征序列的人工合成DNA片段；所述阳性对照中的叙利亚仓鼠多瘤病毒序列可以被第一引物对和第二引物对通过聚合酶链式反应PCR法检测出，也可以被第三引物对通过荧光定量PCR反应法检测出。本实施例合成的叙利亚仓鼠多瘤病毒的阳性对照序列如SEQ ID NO：7所示。
将上述DNA序列置于无菌超纯水中储存得到一种阳性对照液。
3.制备阴性对照
不包含任何病毒的无菌超纯水作为阴性对照液。
4.制备试剂盒
a、按照如下组分及用量制备PCR反应液：
MgCl2(25mM)96μL/盒(2μL/管)；dNTPs 96μL/盒(2μL/管)；各条引物(SEQ ID NOs：1-6)(50μM)各9.6μL/盒(各0.2μL/管)；加灭菌超纯水至384μL/盒(各8μL/管)；
本实施例中的的检测试剂盒中每盒包括6支PCR反应八联管，因此共48支PCR反应管，将各组分混合后装入一个EP管中，上述括号中的用量为进行PCR检测时每支PCR反应管中的用量；
b.取14.4μL Hot Start Taq酶(5U/μL)，在检测时，每支PCR管中含有0.3μL HotStart Taq酶；
c.将上述PCR反应液、混合酶液、阳性对照液及阴性对照液组装成试剂盒，其中每只试剂盒中阳性对照液及阴性对照液均为20μL；
既得本发明所述检测叙利亚仓鼠多瘤病毒的试剂盒。
实施例2
利用实施例1所制试剂盒进行叙利亚仓鼠多瘤病毒检测。
取10份叙利亚仓鼠HaPV病毒样本，提取DNA，然后将其分成4组，分别为：
第一组：6份样本，将其中每份样本分别加入人工合成的仓鼠HaPV病毒阳性对照片段，其序列如SEQ ID NO：7所示；
第二组：4份样本，不加入外源DNA片段；
第三组：0份样本，加入人工合成的仓鼠HaPV病毒阳性对照片段，其序列如SEQ IDNO：7所示；
第四组：0份样本，不加入外源DNA片段。
同时制备10份实施例1步骤3所制备的阴性对照液，利用实施例1所制试剂盒进行检测，结果如表1所示。
表1叙利亚仓鼠多瘤病毒检测结果
扩增结果
结果说明
第一引物对(+)，第二引物对(+)，第三引物对(+)
第一组检测出仓鼠HaPV核酸
第一引物对(+)，第二引物对(+)，第三引物对(+)
第二组检测出仓鼠HaPV核酸
第一引物对(+)，第二引物对(+)，第三引物对(+)
第三组检测出仓鼠HaPV核酸
第一引物对(-)，第二引物对(-)，第三引物对(-)
第四组未检测出仓鼠HaPV核酸
上述检测结果与实际情况相符，第一组、第二组、第三组为仓鼠HaPV核酸阳性，第四组为仓鼠HaPV核酸阴性。
实施例3
本实施例利用实施例所制试剂盒对待测样本中是否含有叙利亚仓鼠HaPV病毒进行测定，操作流程如图1所示，具体操作步骤如下所示：
1.提取样本DNA
取10份P53基因敲除叙利亚仓鼠肿瘤组织，利用病毒DNA提取试剂盒提取DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。
2.将实施例1所述的PCR反应液(15.0μL)、混合酶液、阳性对照液、阴性对照液在八联管的每个PCR管中混合。
3.取5μL步骤1中获得的待测样本DNA，加入步骤2中的PCR管中，混合，上机检测。
4.PCR反应条件
a、通过琼脂糖凝胶电泳进行检测时，PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸30sec，循环35次，最后72℃延伸2min。
b、通过荧光定量PCR进行检测时，PCR反应条件为：50℃2min；95℃预变性12min；95℃变性15sec，64℃延伸1min，循环5次；95℃变性15sec，58℃延伸1min，循环40次。
5.结果判断
a、琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，阳性样本的扩增产物分别在641bp和544bp出现条带，则样品中含有HaPV；阴性样本的扩增产物分别在641bp和544bp没有出现条带，则样品中不含有HaPV，如图2所示。
b、采用荧光定量PCR进行检测，具体方法为根据核酸扩增步骤得到的扩增曲线上的指数扩增阶段设定阈值(threshold)，得到对应的Ct值，阳性样本扩增曲线图Ct值≤PTC+6，并有明显指数增长，则样品中含有HaPV；阴性样本扩增曲线图Ct值＞PTC+6或无Ct值，则样品中不含有HaPV，如图3所示。
6检测结果
本实施例共有10份样本，检测结果判定，其中6例检测出仓鼠HaPV。
编号
Ct值
比较PTC<sup>a</sup>+6大小
阳性或阴性
1
26.23
＜
阳性
2
31.44
＞
阴性
3
27.83
＜
阳性
4
28.74
＜
阳性
5
29.06
＜
阳性
6
22.31
＜
阳性
7
34.33
＞
阴性
8
32.64
＞
阴性
9
24.62
＜
阳性
10
35.43
＞
阴性
注：a为PTC 24，PTC+6＝30
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 河南中医药大学
<120> 一种检测叙利亚仓鼠多瘤病毒的试剂盒及其检测方法
<130> 2021.8.31
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
ctcccctgtt tctatttcc 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 2
catcacattt agccacacag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 3
ctgtgacgag gaataccca 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 4
caggaagcta acggtacaaa 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 5
acttcaacag cacggaggag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 6
gcgtgagaaa gaaaccccct 20
<210> 7
<211> 656
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 7
cccccctccc ctgtttctat ttccagtgac agctccagtt cctcctgtga cgaggaatac 60
ccaagaaact caagcagaaa gagaaaacga gtacatgcca atggctcccc aaatacacct 120
atacagccaa ataagagagc ccacacacca ggaggaggaa gaaccacaat acgaggagat 180
accgatatac ctagaactcc tgccagagaa tcccaatcaa catttggctc ttacttcaac 240
agcacggagg agcttgagga ggaaatatca caaacacaac agtcacatca taacacaacg 300
ccaaagaaac cgcctccgac ggttagtcct gatgattttc ctactatcct tagggggttt 360
ctttctcacg ctattttttc taataaaacg caaaatgcat ttataatcta cagtactaag 420
gaaaaatgtg aagtacttta tgaacaaata gacaaatata atccagacta taaaggtatc 480
ttcattatga aacaaacaga agcatttgta atgtttatga ctcctggaaa acatagagta 540
gctgcagtta aaagttactg ttgtaaattt tgtaccgtta gcttcctgct atgcaaagct 600
gttacaaaac cgttagagtt gtataactgt gtggctaaat gtgatgactt tcaaat 656
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