用于预测和筛选青少年特发性脊柱侧凸的试剂盒及应用

文档序号：1961419 发布日期：2021-12-14 浏览：3次 >En<

阅读说明：本技术 用于预测和筛选青少年特发性脊柱侧凸的试剂盒及应用 (Kit for predicting and screening adolescent idiopathic scoliosis and application ) 是由纪志盛马彦明高育京张国威林宏生于 2021-11-17 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种用于预测和筛选青少年特发性脊柱侧凸的试剂盒,包括检测TTN基因突变和/或表达水平的试剂。通过检测TTN基因的突变情况,来对人群罹患AIS疾病情况进行预测及筛选,以提前进行相关预防,显著降低疾病对人体健康的损害,同时也有助于对已患病患者进行预后评估,为治疗及康复提供合理有效的指导作用；由于AIS疾病存在明显的家族遗传相关性,因而可利用TTN基因检测结果为受试者及其家庭提供优生优育指导和遗传质询,减少相关患儿的出生；除此以外,还可以为人类攻克AIS提供一个新的药物治疗靶点,从而为后续的药物研发、临床治疗等提供了一个新的方向。(The invention provides a kit for predicting and screening adolescent idiopathic scoliosis, which comprises a reagent for detecting TTN gene mutation and/or expression level. The AIS disease condition of a human population is predicted and screened by detecting the mutation condition of the TTN gene so as to carry out related prevention in advance, obviously reduce the damage of the disease to the health of the human body, and simultaneously contribute to carrying out prognosis evaluation on a patient with the disease, thereby providing reasonable and effective guidance for treatment and rehabilitation; due to the obvious family genetic correlation of the AIS disease, TTN gene detection results can be utilized to provide bearing and rearing instructions and genetic challenges for a subject and a family thereof, and the birth of related children is reduced; in addition, a new drug treatment target point can be provided for human beings to overcome AIS, so that a new direction is provided for subsequent drug development, clinical treatment and the like.)

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及用于预测和筛选青少年特发性脊柱侧凸的试剂盒及其应用。

背景技术

青少年特发性脊柱侧凸（Adolescent Idiopathic Scoliosis，AIS）是指在青少年期间出现的脊柱的一个或多个节段在冠状面上偏离身体中线向侧方弯曲而形成的一个带弧度的脊柱畸形，通常伴有脊柱的侧凸和矢状面上的前突或后突的增加或减少，在10-18岁的青少年中其发病率约为1%-3%，女孩较男孩更常见，是青少年最常见的脊柱畸形之一。

青少年特发性脊柱侧凸是特发性脊柱侧弯最常见的类型，占脊柱侧弯的0.47-5.2%，占特发性脊柱侧弯90%。AIS的病因尚不明确,可能与家族基因遗传、褪黑素水平、血小板的结构和功能等因素相关。目前认为AIS的病因可能是多因素导致的。目前，流行病学表明AIS有家族聚集性。Andersen研究双胞胎特发性脊柱侧弯发病率发现：同卵双胞胎的一致率在73%-92%，异卵双胞胎的一致率在36%-63%，并且认为基因遗传是AIS的发病之一。分子生物学技术的发展，全外显子测序辅助临床诊断成为可能。因此有学者利用基因筛查及候选基因的方法从发病患者中找到发病基因。Kris通过大样本(共202个家族1198人)利用基因筛查的方法也发现染色体19p13存在异常，然而并没有实质性进展。

目前的研究对于AIS发病机制还不是十分清楚。遗传因素在AIS的发病中发挥着不可忽视的作用。一些以双胞胎和AIS家系为基础的研究表明遗传因素对AIS的发生和发展起着重要的影响。2003年，Justice等人的研究提出了AIS的常染色体显性遗传模式。尽管目前已经有一些研究证实遗传的基因突变对AIS发病和发展的影响，但是仍不能完整的解释AIS的遗传机制并指导治疗。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中所存在的青少年特发性脊柱侧凸发病因素不明确、难以进行提前预防的技术问题，从而提供了一种用于预测和筛选青少年特发性脊柱侧凸的试剂盒。通过选择TTN作为标志物，能够用于对青少年特发性脊柱侧凸进行有效预测，从而筛选出AIS的高发病人群，以进行合理的提前预防，显著降低疾病发生的概率及严重程度，减少对人体健康的损害。

为了解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案得以实现的。

本发明第一方面提供了一种用于预测和/或筛选青少年特发性脊柱侧凸的试剂盒，包括检测TTN基因突变和/或表达水平的试剂。

作为优选地，所述TTN基因突变的位点选自以下位点中的一种或多种：c.G178T、c.T455C、c.G4322C、c.G22498T、c.G31864A、c.G36508A、c.C51482T、c.G76343A、c.C91276T、c.A98164T、c.G100579A、c.G102833T、c.C105782T、c.T107267C。最优选地，所述TTN基因突变的位点选自c.G4322、c.C91276T、c.G102833T中的一种或多种。

作为优选地，所述试剂选自基因特异性引物、基因组测序试剂、基因表达产物的特异性抗体中的一种或多种。

作为优选地，所述基因特异性引物选自下列引物对中的至少一对：

（1）引物对1：正向引物序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物序列如SEQ ID NO:2所示；

（2）引物对2：正向引物序列如SEQ ID NO:3所示，反向引物序列如SEQ ID NO:4所示；

（3）引物对3：正向引物序列如SEQ ID NO:5所示，反向引物序列如SEQ ID NO:6所示；

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（7）引物对7：正向引物序列如SEQ ID NO:13所示，反向引物序列如SEQ ID NO:14所示；

（8）引物对8：正向引物序列如SEQ ID NO:15所示，反向引物序列如SEQ ID NO:16所示；

（9）引物对9：正向引物序列如SEQ ID NO:17所示，反向引物序列如SEQ ID NO:18所示；

（10）引物对10：正向引物序列如SEQ ID NO:19所示，反向引物序列如SEQ ID NO:20所示；

（11）引物对11：正向引物序列如SEQ ID NO:21所示，反向引物序列如SEQ ID NO:22所示；

（12）引物对12：正向引物序列如SEQ ID NO:23所示，反向引物序列如SEQ ID NO:24所示；

（13）引物对13：正向引物序列如SEQ ID NO:25所示，反向引物序列如SEQ ID NO:26所示。

作为优选地，所述基因表达产物的特异性抗体选自TTN单克隆抗体和/或TTN多克隆抗体。

作为优选地，所述TTN蛋白含量检测试剂选自TTN单克隆抗体M06（品牌为Abnova，产品货号：H00007273-M06）、Anti-Titin antibody（品牌为Abcam，产品货号：ab284860）中的一种或多种。

作为优选地，所述试剂盒还包括PCR酶、PCR缓冲液、dNTPs、荧光底物中的一种或多种。

作为优选地，所述荧光底物选自Syber Green或荧光标记的探针。

本发明第二方面提供了一种组合物在制备用于预测和/或筛选青少年特发性脊柱侧凸的试剂盒中的应用，所述组合物包括检测TTN基因突变和/或表达水平的试剂。

作为优选地，所述试剂选自基因特异性引物、基因组测序试剂、基因表达产物的特异性抗体中的一种或多种。

作为优选地，所述基因特异性引物选自下列引物对中的至少一对：

（1）引物对1：正向引物序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物序列如SEQ ID NO:2所示；

（2）引物对2：正向引物序列如SEQ ID NO:3所示，反向引物序列如SEQ ID NO:4所示；

（3）引物对3：正向引物序列如SEQ ID NO:5所示，反向引物序列如SEQ ID NO:6所示；

（4）引物对4：正向引物序列如SEQ ID NO:7所示，反向引物序列如SEQ ID NO:8所示；

（5）引物对5：正向引物序列如SEQ ID NO:9所示，反向引物序列如SEQ ID NO:10所示；

（6）引物对6：正向引物序列如SEQ ID NO:11所示，反向引物序列如SEQ ID NO:12所示；

（7）引物对7：正向引物序列如SEQ ID NO:13所示，反向引物序列如SEQ ID NO:14所示；

（8）引物对8：正向引物序列如SEQ ID NO:15所示，反向引物序列如SEQ ID NO:16所示；

（9）引物对9：正向引物序列如SEQ ID NO:17所示，反向引物序列如SEQ ID NO:18所示；

（10）引物对10：正向引物序列如SEQ ID NO:19所示，反向引物序列如SEQ ID NO:20所示；

（11）引物对11：正向引物序列如SEQ ID NO:21所示，反向引物序列如SEQ ID NO:22所示；

（12）引物对12：正向引物序列如SEQ ID NO:23所示，反向引物序列如SEQ ID NO:24所示；

（13）引物对13：正向引物序列如SEQ ID NO:25所示，反向引物序列如SEQ ID NO:26所示。

作为优选地，所述基因表达产物的特异性抗体选自TTN单克隆抗体和/或TTN多克隆抗体。

作为优选地，所述试剂盒还包括PCR酶、PCR缓冲液、dNTPs、荧光底物中的一种或多种。

作为优选地，所述荧光底物选自Syber Green或荧光标记的探针。

本发明第三方面提供了一种检测TTN基因突变和/或表达水平的试剂在制备用于预测和/或筛选青少年特发性脊柱侧凸的组合物中的应用。

作为优选地，所述试剂选自基因特异性引物、基因组测序试剂、基因表达产物的特异性抗体中的一种或多种。

作为优选地，所述基因特异性引物选自下列引物对中的至少一对：

（1）引物对1：正向引物序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物序列如SEQ ID NO:2所示；

（2）引物对2：正向引物序列如SEQ ID NO:3所示，反向引物序列如SEQ ID NO:4所示；

（3）引物对3：正向引物序列如SEQ ID NO:5所示，反向引物序列如SEQ ID NO:6所示；

（4）引物对4：正向引物序列如SEQ ID NO:7所示，反向引物序列如SEQ ID NO:8所示；

（5）引物对5：正向引物序列如SEQ ID NO:9所示，反向引物序列如SEQ ID NO:10所示；

（6）引物对6：正向引物序列如SEQ ID NO:11所示，反向引物序列如SEQ ID NO:12所示；

（7）引物对7：正向引物序列如SEQ ID NO:13所示，反向引物序列如SEQ ID NO:14所示；

（8）引物对8：正向引物序列如SEQ ID NO:15所示，反向引物序列如SEQ ID NO:16所示；

（9）引物对9：正向引物序列如SEQ ID NO:17所示，反向引物序列如SEQ ID NO:18所示；

（10）引物对10：正向引物序列如SEQ ID NO:19所示，反向引物序列如SEQ ID NO:20所示；

（11）引物对11：正向引物序列如SEQ ID NO:21所示，反向引物序列如SEQ ID NO:22所示；

（12）引物对12：正向引物序列如SEQ ID NO:23所示，反向引物序列如SEQ ID NO:24所示；

（13）引物对13：正向引物序列如SEQ ID NO:25所示，反向引物序列如SEQ ID NO:26所示。

作为优选地，所述基因表达产物的特异性抗体选自TTN单克隆抗体和/或TTN多克隆抗体。

作为优选地，所述试剂盒还包括PCR酶、PCR缓冲液、dNTPs、荧光底物中的一种或多种。

作为优选地，所述荧光底物选自Syber Green或荧光标记的探针。

本发明第四方面提供了一种检测TTN基因突变和/或表达水平的试剂在制备用于青少年特发性脊柱侧凸预后评估的组合物中的应用。

作为优选地，所述试剂选自基因特异性引物、基因组测序试剂、基因表达产物的特异性抗体中的一种或多种。

作为优选地，所述基因特异性引物选自下列引物对中的至少一对：

（1）引物对1：正向引物序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物序列如SEQ ID NO:2所示；

（2）引物对2：正向引物序列如SEQ ID NO:3所示，反向引物序列如SEQ ID NO:4所示；

（3）引物对3：正向引物序列如SEQ ID NO:5所示，反向引物序列如SEQ ID NO:6所示；

（4）引物对4：正向引物序列如SEQ ID NO:7所示，反向引物序列如SEQ ID NO:8所示；

（5）引物对5：正向引物序列如SEQ ID NO:9所示，反向引物序列如SEQ ID NO:10所示；

（6）引物对6：正向引物序列如SEQ ID NO:11所示，反向引物序列如SEQ ID NO:12所示；

（7）引物对7：正向引物序列如SEQ ID NO:13所示，反向引物序列如SEQ ID NO:14所示；

（8）引物对8：正向引物序列如SEQ ID NO:15所示，反向引物序列如SEQ ID NO:16所示；

（9）引物对9：正向引物序列如SEQ ID NO:17所示，反向引物序列如SEQ ID NO:18所示；

（10）引物对10：正向引物序列如SEQ ID NO:19所示，反向引物序列如SEQ ID NO:20所示；

（11）引物对11：正向引物序列如SEQ ID NO:21所示，反向引物序列如SEQ ID NO:22所示；

（12）引物对12：正向引物序列如SEQ ID NO:23所示，反向引物序列如SEQ ID NO:24所示；

（13）引物对13：正向引物序列如SEQ ID NO:25所示，反向引物序列如SEQ ID NO:26所示。

作为优选地，所述基因表达产物的特异性抗体选自TTN单克隆抗体和/或TTN多克隆抗体。

作为优选地，所述试剂盒还包括PCR酶、PCR缓冲液、dNTPs、荧光底物中的一种或多种。

作为优选地，所述荧光底物选自Syber Green或荧光标记的探针。

在没有特别说明的情况下，在本发明上下文中，所述引物和/或引物对组是指用于在PCR中合成TTN基因cDNA链的PCR引物，从而用于检测TTN基因的表达水平。

TTN基因编码的蛋白质Titin是目前已知的最大的蛋白质，同时也是脊椎动物肌肉中含量第三的蛋白，它横跨从M线到Z盘的整个半肌节。Titin在横纹肌中扮演着许多重要的角色，包括维持肌节完整性，被动产生力量以及肌原纤维的组装。由于其大小和重复序列，TTN基因表现出高度的变异性。多数与疾病相关的TTN基因变异都是对肌动蛋白表达有很大影响，包括插入/缺失突变、剪接突变等。有研究表明TTN基因的突变与某些肌肉疾病相关，这其中可能包括AIS。Titin转录后和翻译后的修饰的不同机制，以及信号功能的多样性和复杂性，导致了该蛋白在引起肌肉疾病的机制的研究方面尚不清楚。

本发明发明人通过大量临床及实验室研究发现，在许多AIS病例中，通常一家族三代均有特发性脊柱侧弯病例，从而推断该疾病的发生可能与某些特定基因具有高度关联性。进一步地，通过体外实验结合全外显子组测序及分子生物学结果发现，在AIS患者中，均发现TTN有不同程度的突变。从而认定TTN基因突变与AIS的发病存在明显相关性，因而可以作为AIS发生的新的生物标记物。本发明发现基因TTN的突变与AIS密切相关，提供一个指标预测AIS的遗传倾向，有利于AIS的提前预防。

本发明相对于现有技术具有如下技术效果：

（1）本发明对青少年特发性脊柱侧凸的发病机制进行了深入研究，发现基因TTN基因的突变是与AIS致病高度关联的因素；因而，通过对受试者TTN基因进行检测，判断其是否发生突变，从而可以有效对青少年特发性脊柱侧凸患者进行检测和筛选，即TTN基因的变异可以作为临床辅助诊断清筛年特发性脊柱侧凸疾病的生物标志物。

（2）通过对受试者是否携带TTN变异基因，可以早期筛查出该变异的携带者，从而为预防该疾病做提前准备工作，防止疾病的迅速发展和恶化对患者造成不可以的健康损害，也可对患者的预后进行合理评估，为治疗及康复提供合理有效的指导作用；同时还可利用TTN基因检测结果为受试者及其家庭提供优生优育指导和遗传质询，减少相关患儿的出生。

（3）本发明通过揭示TTN基因突变于青少年特发性脊柱侧凸的关联性，为人类攻克AIS提供了一个新的药物治疗靶点，从而为后续的药物研发、临床治疗等提供了一个新的方向。

附图说明

图1为全外显子测序、检测和过滤的流程示意图。

图2为AIS家族遗传谱系图。

图3为AIS家族成员单核苷酸多态性位点分析结果示意图。

图4为正常人与AIS患者单碱基变异位点比较的韦恩图。

图5为AIS患者单碱基变异位点情况示意图。

图6为AIS相关SNP的86个基因的GO分类结果示意图。

图7为对AIS共享基因通路分析结果示意图。

图8为对相同的基因进行ClueGO和CluePedia分析结果示意图。

图9为AIS相关基因的碱基突变数分析示意图。

图10为TTN的14个非同义突变在TTN蛋白中的分布示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在无特别说明的情况下，本发明上下文中所使用的试剂中，均通过市售获得。对于临床标本的使用，均与患者签署了知情同意书，相关程序及方法符合医学伦理学要求以及药物临床试验质量管理规范。本发明所使用的实验方法，例如DNA提取、全基因组测序、引物设计、GO分类与通道分析等均为本领域的常规方法和技术。

生物学实验重复中选择具有代表性的结果呈现在上下文附图中，数据按照图示中规定的以mean±SD和mean±SEM展示。所有实验至少重复三次。数据采用GraphPad Prism5.0或SPSS 22.0软件进行分析。采用t检验、卡方检验、方差分析等常规医学统计学方法比较两组或两组以上的平均值差异。p＜0.05被认为是一个显著的差异。

实施例1 AIS致病基因分析

对AIS患者及其家族中另外3名AIS患者进行血样采集，提取DNA片段，具体步骤如下：

（1）取静脉血400μL,加入1mL的RCL于血样中，颠倒混匀几次，室温放置5分钟；

（2）10000×g 离心3分钟，去上清，留白细胞沉淀；

（3）加入200μL B3和2μl Proteinase K，立即涡旋混匀，65℃放置10分钟，期间混匀数次，溶液应变为清亮；

（4）加入200μL异丙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现丝状或簇状基因组DNA；

（5）10000×g离心5分钟，去上清；

（6）加入200 μl 70%的乙醇，涡旋振荡5秒钟，10000×g离心5分钟，去上清，重复一次；

（7）干燥DNA沉淀直到所有的液体挥发干净。加入200uEB.低速涡旋5秒，65℃放置10分钟至1小时溶解DNA，其间轻弹数次助溶。

随后，对根据上述步骤提取获得的DNA进行全外显子测序，以筛选AIS的致病基因，并对其进行检测和过滤。

结果如图1-3所示。其中图1为本实施例全外显子测序、检测和过滤的流程示意图。结果显示，在AIS患者家族里通常会存在多名AIS病例，其遗传谱系图如图2所示，显示AIS为常染色体显性遗传。对基因的检测结果发现，每个家族成员检测到超过90000个单碱基变异（Single Nucleotide Variants，SNV）（参见图3）。

通过韦恩图对AIS患者家族成员进行分析，在所有受影响个体中共发现了732个重叠的SNVs（参见图4）。在这732个单核苷酸多态性（Single Nucleotide polymorphism，SNP）中，506个SNP被注释为功能未知，112个SNP为同义突变，114个SNP为非同义突变（参见图5）。

实施例2 AIS相关突变基因与肌肉组织形态发生关系分析

根据上述实施例1可知，在AIS患者中存在114个非同义突变SNP。而由于非同义突变可能改变所表达的氨基酸，进而可能影响蛋白质的功能，因此进一步选择了86个AIS患者共享基因的114个非同义突变进行深入分析。

通过对86个AIS患者共享基因进行GO分类与通道分析发现，这些基因在生物过程中最丰富的类别是细胞过程，细胞、细胞部分以及细胞器代表了细胞成分的主要比例，结合占分子功能的很大一部分（参见图6）。通路分析显示，共享基因主要富集在10条通路中，包括炎症信号通路、Rho GTPase对细胞骨架的调控和整合素信号通路（参见图7）。同时还发现，肌肉组织形态发生是最重要的生物过程，包括TTN等在内的基因参与了这一过程（参见图8）。

实施例3 TTN突变与AIS发病关系分析

对实施例1中患者AIS共享基因的碱基突变个数进行分析，结果如图9-10所示。结果显示，大多数AIS相关突变基因只有1个SNP，但TTN有14个非同义SNPs（参见图9）。这14个突变体在TTN蛋白中分布情况如图10所示。由于TTN基因编码肌联蛋白，其为已知最大的蛋白，与肌肉发育密切相关，从而使其成为了AIS的极好候选基因。

随后，为了明确TTN突变与AIS发病之间是否存在相关性，进一步扩大了试验样本量，对140名AIS患者以及121名正常人进行TTN测序。首先根据TTN的突变位点设计了13对引物，其中第一对引物包含两个突变位点，其余各引物对均包含1个突变位点。各引物对序列及所针对的突变位点如下表1所示。

表1 各引物对序列

随后，提取受试者血清中的DNA，通过设计的引物进行PCR，将所获得的PCR产物进行测序，通过Sanger测序在TTN基因中测试了所有14个变异分析在AIS患者及正常人体内TTN突变情况。结果如下表2所示：

表2 AIS患者及正常人体内TTN突变情况

	未患病	患病	总计
				TTN野生型	110	44	154
TTN突变型	11	96	107
				总计	121	140	261

其中，在携带有TTN突变型的AIS患者体内，总共确认了7个变异，分别为c.G4322、c.C91276T、c.G102833T、c.G36508A、c.A98164T、c.C105782T、c.T107267C。在96名TTN突变型AIS患者中，TTN基因至少存在上述7种位点突变中的一种。

对上述结果进行卡方检验分析，结果如下表3所示：

表3 AIS患者及正常人体内TTN突变情况卡方检验结果

注释：a：0个单元格 (0.0%) 具有的预期计数少于 5。最小预期计数为49.61。b：仅为 2×2 表格计算。

进一步地，利用PolyPhen-2和SIFT计算分数用于对上述7个TTN内非同义变体进行有害性预测，其中，c.G4322、c.C91276T和c.G102833T的变体满足条件（SIFT平分小于0.05，PolyPhen-2评分大于0.95，图中未示出）。

由上述结果可知，在AIS确诊患者体内，TTN基因发生变异的百分比高达68.7%，TTN基因为野生型的百分比仅为31.4%。因而可以明确，体内TTN基因存在c.G4322、c.C91276T、c.G102833T、c.G36508A、c.A98164T、c.C105782T等7种SNP位点突变，尤其是c.G4322、c.C91276T和c.G102833T三个SNP位点突变的人群，相较于TTN为野生型的人群来说，其AIS发病率明显升高，该差异具有统计学意义（p＜0.001），即TTN基因突变与AIS发病存在明显的相关性。因而可以通过检测TTN基因的突变情况，来对人群罹患AIS疾病情况进行预测及筛选，以提前进行相关预防，显著降低疾病对人体健康的损害，同时也有助于对已患病患者进行预后评估，为治疗及康复提供合理有效的指导作用；根据上述分析发现，AIS疾病存在明显的家族遗传相关性，因而可利用TTN基因检测结果为受试者及其家庭提供优生优育指导和遗传质询，减少相关患儿的出生；除此以外，还可以为人类攻克AIS提供一个新的药物治疗靶点，从而为后续的药物研发、临床治疗等提供了一个新的方向。

以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 暨南大学

<120> 用于预测和筛选青少年特发性脊柱侧凸的试剂盒及应用

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA