稻瘟病抗性基因Pik-zh的功能特异性分子标记与应用
阅读说明：本技术 稻瘟病抗性基因Pik-zh的功能特异性分子标记与应用 (Functional specific molecular marker of rice blast resistance gene Pik-zh and application ) 是由 杨德卫 何旎清 郑向华 黄凤凰 程朝平 叶宁 于 2021-09-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开稻瘟病抗性基因Pik-zh的功能特异性分子标记与应用,稻瘟病抗性基因Pik-zh功能特异性分子标记为Pik-zh-InDel,通过引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2从携带有稻瘟病抗性基因Pik-zh的水稻品种的基因组DNA中扩增出来与稻瘟病抗性基因Pik-zh呈特异性带型的分子标记；其中,SEQ ID NO.1为5’-AGCAGTGGGACGAGTGGGA-3’；SEQ ID NO.2为5’-GGTAGGACACCTGCCATCA-3’；本发明获得的稻瘟病抗病基因Pik-zh的功能特异性分子能够应用于鉴别水稻品种中稻瘟病抗性基因。(The invention discloses a functional specificity molecular marker of a rice blast resistance gene Pik-zh and application thereof, wherein the functional specificity molecular marker of the rice blast resistance gene Pik-zh is Pik-zh-InDel, and a molecular marker which is in a specific banding pattern with the rice blast resistance gene Pik-zh is amplified from a genome DNA of a rice variety carrying the rice blast resistance gene Pik-zh through a primer pair SEQ ID NO.1 and SEQ ID NO. 2; wherein SEQ ID NO.1 is 5'-AGCAGTGGGACGAGTGGGA-3'; 5'-GGTAGGACACCTGCCATCA-3' for SEQ ID NO. 2; the functional specificity molecule of the rice blast disease-resistant gene Pik-zh obtained by the invention can be applied to identifying the rice blast disease-resistant gene in rice varieties.)
技术领域
本发明属于生物分子标记技术领域，具体涉及稻瘟病抗性基因Pik-zh的功能特异性分子与应用。
背景技术
水稻是世界上主要的粮食作物之一，由稻瘟病菌引起的稻瘟病是一种世界性病害，近年来呈现不断上升的趋势。稻瘟病不仅引起水稻大幅减产(10％-35％)，严重时甚至颗粒无收，还会影响稻米品质。从粮食安全和水稻抗病育种的角度来看，培育抗病品种是防治稻瘟病最经济有效的方法之一。但由于传统的抗病育种策略存在工作量大，周期长等特点。因此，迫切需要改变传统抗病育种的策略。
DNA分子标记是以生物大分子的多态性为基础而发展起来的一种遗传标记，目前已经应用于基因组作图、基因定位、遗传多样性评价、功能基因组学研究、转基因植物鉴定与分子标记辅助选择育种等方面。基因功能特异性分子标记是利用目标基因内部DNA序列特异性、差异性而开发出来的分子标记。基因特性分子标记是从目标功能基因序列中功能性SNP位点或InDels开发的功能分子标记，能准确跟踪、定位功能等位基因，在作物表型性状的鉴定中更具准确性，能高效率地筛选出育种所需的有利基因。
20世纪60年代，日本率先开展了水稻品种抗稻瘟病基因分析的研究工作，鉴定了最初8个抗性位点上的14个基因，并建立了一套抗稻瘟病基因分析用的鉴别体系，近几十年来，随着分子遗传学和生物技术的快速发展，我们国家逐渐开展了水稻稻瘟病抗性遗传的系统性研究，很多稻瘟病抗性基因得以被定位或克隆，大大促进了水稻抗病聚合育种的发展。然而，一些抗病基因位于同一位点，这些复等位基因之间、功能型序列与非功能型序列之间高度同源，传统的方法很难区分。因此，通过分析目标基因与等位基因之间特异性序列差异，并开发其功能特异性分子标记来对目标基因进行选择，不仅选择可靠性高，还会大大加快育种步伐。
由于位于第11染色体长臂端上的Pik位点含有5个以上具有不同抗谱以及小种特异性的等位基因Pik-m、Pik、Pik-p、Pik-h以及Pik-s等，因此该位点一直是稻瘟病抗性的研究热门，其中，Pik-m、Pik、Pik-p、Pik-h以及Pik-s均已被成功地鉴定并克隆，关于上述等位基因的相关功能特异性分子标记也已逐渐被开发和应用。
稻瘟病抗性基因Pik-zh是申请人从水稻品种ZH11(中花11)中鉴定出的一个与Pik等位的新的主效抗病基因，利用图位克隆的方法，获得其CDs全长为3438bp，详细核酸序列如SEQ ID NO.4所示，通过对稻瘟病抗性基因Pik-zh进一步分析发现，Pik-zh序列与目前该位点上已克隆的Pik、Pik-s、Pik-h、Pik-p部分序列均存在特异性的差异，Pik-zh基因对于中国的菌株D527和KJ201能够表现出较强的抗病反应。因此，为了能更准确、更有效地将稻瘟病广谱抗性基因Pik-zh应用到水稻抗性育种工作中，亟需开发真实反映目标基因、方便易用的Pik-zh特异性分子标记。
发明内容
本发明提供稻瘟病抗性基因Pik-zh的功能特异性分子标记与应用，创造性地发现能够真实反映稻瘟病广谱抗性基因Pik-zh，同时制备方便易用且具有较高准确性和稳定性的Pik-zh特异性分子标记，使得稻瘟病广谱抗性基因Pik-zh更好的应用到水稻抗性育种中。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明的目的之一在于提供稻瘟病抗性基因Pik-zh的功能特异性分子标记，稻瘟病抗性基因Pik-zh功能特异性分子标记为Pik-zh-InDel，通过引物对SEQ ID NO.1和SEQID NO.2从携带有稻瘟病抗性基因Pik-zh的水稻品种的基因组DNA中扩增出来与稻瘟病抗性基因Pik-zh呈特异性带型的分子标记；其中，所述引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的核苷酸序列如下所示：
SEQ ID NO.1：5’-ACGAGTGGGATCGATACTG-3’；
SEQ ID NO.2：5’-GGTAGGACACCTGCCATCA-3’；
所述携带有稻瘟病抗性基因Pik-zh的水稻品种为水稻抗病品种中花11。
进一步的，所述稻瘟病抗性基因Pik-zh包括部分编码NBS-LRR类蛋白的基因片段SEQ ID NO.3。
本发明的目的之一还在于提供稻瘟病抗性基因Pik-zh的功能特异性分子标记的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)针对稻瘟病抗性基因Pik-zh位点进行序列比对，筛查Pik-zh特异的、能区别于该位点其他稻瘟病等位抗性基因的插入/缺失InDel位点；
(2)利用步骤(1)获得的InDel位点信息，在所述InDel位点处设计基因特异性引物；
(3)以携带有稻瘟病抗性基因Pik-zh的稻瘟病抗性品种的总DNA为模板，进行PCR扩增，所获得的PCR产物即为稻瘟病抗性基因Pik-zh基因特异性分子标记Pik-zh-InDel。
本发明的目的之一还在于将稻瘟病抗性基因Pik-zh的功能特异性分子标记应用在鉴别水稻品种稻瘟病抗性基因。
本发明还提供一种用于鉴别水稻品种稻瘟病抗性的试剂盒，包括核酸序列如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对。
本发明的有益效果：
1、本发明是针对与Pik等位的新的主效抗病基因Pik-zh研制的功能特异性分子标记，Pik-zh的功能特异性分子标记在实际应用中，具有成本低、效率高、准确率高等优点；Pik-zh功能特异性分子标记为Pik-zh-InDel能够利用电泳检测的方法成功地将Pik-zh与在该位点上的其他非Pik-zh基因区分开，检测效率高；同时本发明所提供的Pik-zh特异性分子标记Pik-zh-InDel是一个显性标记，存在于Pik-zh基因内部，对Pik-zh的筛选能力理论值可达100％
2、本发明提供的Pik-zh功能特异性分子标记为Pik-zh-InDel只需PCR结合琼脂糖凝胶电泳或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，成本低、准确率高、通量高，再加上特异性高，特别适用于农业生产实践以及任何遗传背景下的Pik-zh的种质资源筛选，转基因育种，基因聚合以及基于MAS技术的抗性育种，大大提高了育种效率和准确性。
附图说明
图1是利用SEQ ID NO.1所示的引物F1和SEQ ID NO.2所示的引物R1，以6个选择出的代表性品种的总DNA为模板进行的扩增情况。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，实施例只用于解释本发明，并不会对本发明构成任何限定。
实施例1
稻瘟病抗性基因Pik-zh的功能特异性分子标记的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)Pik-zh插入/缺失(insertion-deletion，InDel)位点的分析：
从公共数据库中下载得到Pik位点不同等位基因和不同水稻品种对应位点的基因组序列：Pik-m(GenBank：GU811860.1)、Pi1(GenBank：HQ606329.1)、Pik(GenBank：AB616658.1)、Pik-h(GenBank：HQ662330.1)、Pik-s(GenBank：HQ662329.1)、Pik-p(GenBank：HM035360.1)、蜀恢498(GenBank：CP018167.1)、日本晴(Locus：LOC_Os11g42010)，然后在水稻数据库中针对稻瘟病抗性基因Pik-zh位点进行序列比对，根据功能区差异位点进行特异性标记的设计，测序水稻供体品种日本晴、蜀恢498和Pik等位基因均无完整对应区域的基因组序列，其中，比对结果中缺失和具有差异的碱基部分即为鉴定到的InDel位点，比对结果如下：Pik-zh：
Shuhui498：
Pik-m：
Pi1：
Pik：
Pik-h：
Pik-s：
Pik-p：
日本晴:对应序列去缺失
其中，加方框为比对后检测到的具有差异的Pik-zh基因单碱基部分，空格为比对后检测到的缺失的Pik-zh基因单碱基部分，进一步分析发现，Pik-zh基因中有一段序列极其特异，与Pik-m、Pi1、Pik、Pik-h、Pik-s、Pik-p、蜀恢498对应序列相比，均有9bp的差异，而与日本晴对应序列相比，日本晴对应的部分序列完全缺失。
(2)利用步骤(1)获得的InDel位点信息，在所述InDel位点处设计基因特异性引物：
根据InDel标记的设计原理，在所述InDel差异位点处进行引物设计，引物对碱基序列如下所示：SEQ ID NO.1(F1)：5’-ACGAGTGGGATCGATACTG-3’；
SEQ ID NO.2(R1)：5’-GGTAGGACACCTGCCATCA-3’；
(3)以携带有稻瘟病抗性基因Pik-zh的稻瘟病抗性品种的总DNA为模板，进行PCR扩增：
本实施例中选择6个代表性水稻品种，依次为：中花11、蜀恢498、CO39、日本晴、丽江新团黑谷和特特普；
利用上述引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以上述6个水稻品种的总DNA为模板，进行常规PCR扩增后所获得的PCR产物即为稻瘟病抗性基因Pik-zh基因特异性分子标记Pik-zh-InDel；
其中，PCR扩增反应体系如下：
2x Reaction Mix:16μL；
引物SEQ ID NO.1(F1)(10μΜ)：1μL；
引物SEQ ID NO.1(F1)(10μΜ)：1μL；
DNA模板(20-50ng/μL):2μL；
ddH2O：补足至25μL；
PCR温度循环条件如下：94℃5分钟；94℃30秒；55℃30秒；72℃30秒；35个循环；72℃7分钟；10℃保存；
PCR反应结束后，为了检测目的基因片段大小，取10-20ulPCR样品产物在3％的琼脂糖上进行电泳检测，电泳条件为110V，40分钟，电泳结束后，利用凝胶成像系统进行拍照观察电泳结果，含有预期目标大小片段的即为阳性，不含有或者不是目标大小片段的为阴性。
实施例2
稻瘟病抗病基因Pik-zh的功能特异性分子标记在鉴别水稻品种稻瘟病抗性基因的应用，首先利用SEQ ID NO.1所示的引物F1和SEQ ID NO.2所示的引物R1对待检测的6个水稻品种的基因组进行PCR扩增；其次，利用琼脂糖电泳检测，若检测到PCR产物中分子量大小为108bp的核苷酸片段，则待检测的水稻品种携带有稻瘟病抗性基因Pik-zh；若没有检测到分子量大小为108bp的核苷酸片段，则待检测的水稻品种不携带稻瘟病抗性基因Pik-zh。
参见附图1是利用实施例1中提供的SEQ ID NO.1所示的引物F1和SEQ ID NO.2所示的引物R1，以6个选择出的代表性品种的总DNA为模板进行的扩增情况；参见图1，泳道1为DNA ladder，泳道2为Pik-zh供体品种水稻品种中花11基因组为模板PCR得到的片段，为稻瘟病抗性基因Pik-zh特异性带型，即泳道2为Pik-zh基因特异性分子标记Pik-zh-InDel，其片段大小为108bp；泳道3-7的DNA模板依次为蜀恢498、CO39、日本晴、丽江新团黑谷和特特普；如附图1所示，凡是携带有Pik-zh基因的水稻品种，其PCR扩增产物的电泳检测条带以108bp呈现，中花11和特特普均含有Pik-zh基因，而不含有该位点的功能基因，电泳检测不到108bp条带，蜀恢498、CO39、日本晴、丽江新团黑谷均不含有Pik-zh基因。
如附图1说明，试验结果与设计分析的相吻合，说明抗性基因Pik-zh功能特异性分子标记可鉴别稻瘟病抗性基因Pik-zh，适用于农业生产实践以及任何遗传背景下的Pik-zh的种质资源筛选，转基因育种，基因聚合以及基于MAS技术的抗性育种，大大提高了育种效率和准确性。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 福建省农业科学院水稻研究所
<120> 稻瘟病抗性基因Pik-zh的功能特异性分子标记与应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtgggacga gtgggatcg 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtaggacac ctgccatca 19
<210> 3
<211> 173
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggagcagtg aaaacattgc gggcagcagt gggacgagtg ggatcgatac tgagcctgca 60
caggcacagc atgataatct ccctgctgtt cgagatgact acaagggaaa agggattctt 120
cttgatggca ggtgtcctac ctgcggccga gcgactaaaa ttgaagagga aac 173
<210> 4
<211> 6359
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggaggcgg ctgccatggc cgtaaccgca gccacggggg ccttggcgcc cgtgctagtg 60
aagctggccg ctttgctgga cgacggggag tgcaatcttc tggaggggag ccggagcgac 120
gcagagttca tcagatccga gctggaggcc gttcattctc tcctcacccc aaatatcttg 180
gggaggatgg gggatgacga tgcggcgtgc aaggatggct tgattgcgga ggtccgggag 240
ctgtcctacg acctggatga tgccgtcgac gacttcttgg agctcaattt cgagcagcga 300
agaagcgcaa gccctttcgg tgagctcaag gcaagagttg aggagcatgt ctccaatcgc 360
ttctctgact ggaagctacc ggcggcgagc cttccgccgt cgtcggtaca ccgccgagct 420
ggcttgccgc caccagatgc agagctggtg gggatggaca aacgtatgga agagctcacc 480
aaattgctgg aacaagggag caatgatgct tcacgatggc gcaagcgaaa accgcatttc 540
ccgctcagaa aaacagggct aaaggtacgg ttggatctcg attcttcaca aatatagctt 600
cctccgatag cagtgccaac gaatttgttt acttctctct tgattcttta atttggaagt 660
actgtataac aaacatggag ggatcgtcat ttaacttaat tttttttgtt gcagcaaaaa 720
atcgtgatca aggttgccat ggagggcaac aattgccgtt caaaagcaat ggctttagtt 780
gcgagcactg gaggagtgga ctcggttgcg ctcgcaggtg atctaagaga caagatagag 840
gtggtcggtt atggcattga ccccatcaag ctgatctccg cgctccggaa gaaggtgggc 900
catgcggagt tgctgcaggt cagccaagca aaaaaagatg tgaaggagac gacgccgatg 960
cttgcgccgg tgaaatccat atgtgaattt cacaaggtca aaacagtttg catccttgga 1020
ttgccaggtg gaggcaaaac aacggttgcc agagaattat atgacgcctt gggaacgcac 1080
ttcccatgcc gggttttcgt gtcagtctct ccaagttcta gtcccagtcc caatctcaca 1140
aagactcttg cagacatttt cgctcaagca caactaggag taactgatac acttagcaca 1200
ccatatggtg ggagtgggac cgggagagct cttcaacaac atctcatcga caacatatca 1260
gctttcctcc tcaacaaaaa gtaagcaata acttatatct cttatctagc ttgtccttaa 1320
tccggcttcc caaattaaag tgaacaggct atatgtccat ataatgttgg gttttttttt 1380
tctgtcctcg atgaggtata tatcaagata tgccaaactt tttttaatta gcgttacttt 1440
attctaccta gtaaatagat acataaatgg ggcaggcccc tcctttgtga caggccaatg 1500
gttttatgat gtggaaacaa ctcccttatc actgaagctc ttgctattac tcgtgatggt 1560
actgatcttg caaaggcttg cagtatttgt aaatccacag ggagtggtca tctttttttt 1620
ttaagataat gaatagaaat ctggcctcta tatagaaagc caaaggttac acaagtgcat 1680
acactccaaa tctcaaagct gagaaacaca aaaaacaaac gaccaaaaag aaaagacgat 1740
aagattaagt ttcaagcttt tcctccttgc ttcaaaaaac agggaaatgc agagctagcc 1800
cgctcttccc ttgccatgcc ctctcactgc cattgcaact accacaaaag ctcccctgtt 1860
tcgccgtgag cgaagggagg ggatggaact agtctgccgc tttgttgtcg ccaagcactg 1920
gtttcatgct gcccaaacaa cctatgcccc gctagcgata acgagtctgt tgccgccatg 1980
ctgttgtcgc tggagagcac cacttgtcgc tgctcagcta tgtgttaagt aagctactaa 2040
caatctctcc attctcttgt agactgctta taaaagattg tacttcaact tttgattaat 2100
gaaatagagt tcctgcctta caacaacaag aacgagagag agagagagag ccaatatcac 2160
gagttagcac tgtgaagact tcctgactgt tatgtcttca agaacagtat aaaagcattt 2220
gccactataa aaatatgata gccctcaaga tcattaaaaa tatgtcatgt tcttttacct 2280
tcataacaac cagtatcaca aatatgaaaa catttaaagg aaaatcagta tttgccattt 2340
atgtaaagaa aaactagact agaactctgg gcttttattt tagtgcacac tgtatacatg 2400
tgtgttcttt gacgtatata cttgatatgt tttcaaaaac ttttgggggc atatctgtaa 2460
cccatgcccc atgcatccaa agtagtagtg agacaacttt cgtatcaatg gacatgtggc 2520
attaaattta atcccaatat ttgttctctc gaagtcctga acatataatt ggacaaaatt 2580
atataattta attaggccaa ttgagccata tatacacaca ctataagaaa cttctacaaa 2640
acaaacattc gctcctttta ggttttgacc agtctataca tgaaccagcc aacggtgtgc 2700
tggtctgact ataaatgttt ttttagagag taaaggcacc ttcaagtacc tctctcgagg 2760
acagtaaaaa cacccatgct ttaaggttat gaacaacaaa gcatagaaca accacaagaa 2820
aaaaaaacaa ctagaacaag ttctggaact agttagggat tcgggaagcc attgcttgct 2880
ggcttgggac aagctatgcc tgccattgga ctatggtgga gactgggcat aaaggatctc 2940
aatctcttgg agattggcct atgtcctagg tggccatggc tgactgcaag gagatatatt 3000
tcttgcaacg gaaattttca ttgcaaaagc tgaaaatcgt tgcgatatgt acctattgtg 3060
acataattga atccattggg agccgtagca ataaatcccg tggtaatagg ctattgcaat 3120
gattttccga tggttgcata aaaaggtgct attacaatgg ttttgcattg ctattgcaac 3180
aacttgatat gtcataggta tttattgcaa cagtttgtac catgctgcaa taagatttcg 3240
caacacagac ctattcatta aatagcctat ttccacacat tcatttttgt ggcaataatt 3300
cagtgcgaca agcatgttct atagctataa cctgatgcaa cgggttagac ttgttgcagt 3360
aacttattag cacatttaat tttttactaa atttatattg attcaactat ttcaacatca 3420
ttcaatacag taaatactgg aaaatgcaag caatctccaa aaattcacca ataagagaaa 3480
cgaattaaat catatacaca attatttcac accgtacagt gcacttaagt gtaggaaata 3540
taatgctata tacatttcca atcctcaata caggttctgt aaataatgaa aagaaacgtc 3600
aatttgattt cttgaccggt ccctctgaga cacacagtgc tttcctcagc aacatcgttg 3660
ccgatctatg taacttgtaa actccttgtg cttaataaat tctggccagg gttacttcag 3720
cctgcatggc gaaaaaaaag aacttgttag ggagatcgca aacaaatgtt agctgcccca 3780
tttcttctct actgaccata aaagctctag gatcaggtca tgaaaacaat gccgtcagac 3840
cggaaatact caagattcag aacacgactc ctaggaactg caagtttaaa tttcaacaaa 3900
agcaaaatac aaccagatga caaactaata tatatcagct gactgttcat ctcaagtgga 3960
ctcacatctg tgaaattgtt agttctatgc atatatgcta atgtaatact aatatgctat 4020
tgaggcttat tactcttctc gacttttata ggtatctcat tgtaatcgat gacatttggc 4080
attgggaaga atgggaagtc atcagaaagt ccattcccaa gaatgatctg ggtggtagaa 4140
taatcatgac tactcgtctt aattcaatag ctgagaagtg ccacactgat gacaatgatg 4200
tttttgtcta cgaagttggg gatctagata ataatgatgc tttgtcgttg tcttggggga 4260
tagcaacaaa gtctggggca ggcaacagga tcggaactgg agaggataat ccatgctatg 4320
atattgtgaa catgtgttat ggtatgcctt tagcacttat ttggctgtcg tcagcattgg 4380
ttggagagat agaagaatta ggtggtgctg aagtgaaaaa atgtagggat ttgagacaca 4440
tagaggatgg tattttggac atcccatcct tacaaccatt ggcggagagt ttatgccttg 4500
gttataacca tcttcctctt tatctgagga ctttgttgtt gtactgtagt gcataccatt 4560
ggtctaacag aatcgaaagg ggtcgtctgg tcaggaggtg gattgcggaa ggatttgtgt 4620
cggaagagaa agaagcagaa ggttactttg gcgagcttat tgacagagga tggattacgc 4680
agcacggaga caacaacagt tataattact atgagatcca ccccgtgatg ctggccttcc 4740
tgagatgcaa gtccaaggag tacaattttt taacatgctt gggtctggga tctgatacta 4800
gtactagtgc atcctcccca aggttgattc gccggctgtc tcttcagggg gggtatccag 4860
tggactgctt gtcaagcatg agtatggatg tgtcacacac ttgcagcctt gtcgtccttg 4920
gtgacgtggc gcgatccaag ggaatcccct tctatatgtt taagcgcttg cgagtgttgg 4980
accttgaaga taataaggat atacaggatt ctcatctgca gggcatatgt gaacagttaa 5040
gcctcagagt gaggtacctt ggtctcaagg gaacgcggat ccgaaagctc cctcaggaga 5100
tgaggaagct gaagcatttg gagattttgt atgtggggag cactcggatc agtgaacttc 5160
cgcaagagat tggagagctg aagcatctgc ggattctgga cgtgagaaac acggacatca 5220
ctgagctccc actgcagata cgggagctgc agcatctgca cactctggac gtgaggaaca 5280
cgccaatcag tgagctcccg ccgcaggttg gcaagctgca gaatctcaag attatgtgcg 5340
tgaggagcac tggggttagg gagctcccaa aggagattgg ggagctgaat catctacaga 5400
ctctggacgt gagaaacacg agggtgagag agctgccatg gcaagctggc cagatctccc 5460
aatcgttgcg cgtgcttgcc ggtgacagtg gcgatggcgt gcggttgccc gaaggcgtct 5520
gcgaagctct gatcaacggt attccagggg ctacgcgtgc aaaatgcagg gaggttctgt 5580
ccatcgcgat catcgatcgt ttcggacctc cccttgttgg gatattcaaa gttcccggca 5640
gtcatatgcg tatcccgaag atgatcaaag accacttccg cgttctttct tgcctagaca 5700
tcaggctctg ccacaagctt gaggatgatg accaaaagtt cctcgccgag atgcccaacc 5760
tgcagacgct cgtgctgagg ttcgaggccc taccaagaca acccataacc atcaacggca 5820
caggcttcca gatgctggag agcttccgtg tcgacagccg ggtgccaagg atagccttcc 5880
atgaagacgc catgcccaac ctcaagcttc tcgagttcaa gttctacgcc ggcccagcaa 5940
gcaacgatcc catcggcatc accaacctga agagcctcca aaaggtggtc tttcggtgct 6000
cgccatggta caagagcgac gcccctggca tcagcgccac cattgacgtc gtgaagaaag 6060
aagccgagga gcatcccaac cggccgatca ccctcctcat caatgctggg tataaggaga 6120
tatcaattga gtcacatggg agcagtgaaa acattgcggg cagcagtggg acgagtggga 6180
tcgatactga gcctgcacag gcacagcatg ataatctccc tgctgttcga gatgactaca 6240
agggaaaagg gattcttctt gatggcaggt gtcctacctg cggccgagcg actaaaattg 6300
aagaggaaac ccaagatcga gtagcagata ttgaaattca aacagaaact actagctag 6359