茶树4-香豆酰CoA连接酶基因SSR分子标记引物及应用
阅读说明：本技术 茶树4-香豆酰CoA连接酶基因SSR分子标记引物及应用 (SSR molecular marker primer of tea tree 4-coumaroyl CoA ligase gene and application ) 是由 彭靖茹 温立香 檀业维 黄寿辉 张芬 甘志勇 冯春梅 陈家献 袁冬寅 赵媛 于 2020-06-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了发明人利用分子标记技术研究开发了茶树4-香豆酰CoA连接酶基因SSR分子标记(SSR14 4CL和SSR15 4CL)及其引物。研究表明,本发明依据具体特定的基因,在茶树全基因组上开发其SSR引物方法可行,所得引物多态性高、重复性好,具有较好的可行性、针对性。据此,发明人开展了茶树种质资源遗传多态性的研究。综上,本发明的研究方法、SSR分子标记及其引物,可广泛应用于茶树品种鉴定、遗传结构和资源多样性分析、遗传图谱构建,功能基因定位及QTL定位、分子标记辅助选育种研究中,便于进一步研究茶树酚类物质合成以及茶树遗传多态性,促进深入开发茶树资源。(The invention discloses SSR molecular markers (SSR 144 CL and SSR 154 CL) of tea tree 4-coumaroyl CoA ligase genes and primers thereof, which are researched and developed by an inventor by utilizing a molecular marker technology. Research shows that the method for developing the SSR primer on the whole genome of the tea trees is feasible according to specific genes, and the obtained primer has high polymorphism, good repeatability, and good feasibility and pertinence. Accordingly, the inventors have conducted studies on genetic polymorphisms of tea plant germplasm resources. In conclusion, the research method, SSR molecular marker and primers thereof can be widely applied to variety identification of tea trees, analysis of genetic structure and resource diversity, construction of genetic maps, functional gene positioning and QTL positioning, and molecular marker-assisted breeding selection research, are convenient for further research on synthesis of phenolic substances of tea trees and genetic polymorphism of tea trees, and promote deep development of tea tree resources.)
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，尤其涉及茶树4-香豆酰CoA连接酶基因SSR分子标记引物及应用。
背景技术
茶树是中国重要的木本经济作物，茶是世界上最古老、最受欢迎的含咖啡因饮料。茶鲜叶中多酚类的含量一般在18％-36％之间，是茶树的主要次级代谢产物，对茶叶品质的形成影响很大。鲜叶中多酚类化合物的组成、含量和比例，以及在制茶过程中的转化程度、形式不同，对茶叶品质风格的形成起着决定性的作用，直接影响茶叶的色、香、味。
在茶树酚类合成途径中，4-香豆酸乙酰连接酶(4-coumaroyl CoA ligase，4CL)是关键酶之一，在苯丙烷途径中主要催化4-香豆酸生成香豆酰辅酶A，香豆酰辅酶A在查儿酮合成酶催化下生成查尔酮，而查尔酮是茶树类黄酮途径起始底物，影响着茶树儿茶素等多酚类物质、花青素等合成。同时，4-香豆酰酸乙酰连接酶(4CL)也是其它作物中木质素、白藜芦醇等合成关键酶，在植物生长发育和抗逆防御反应中发挥着重要作用。茶树、桦树、非洲菊、山葡萄等的4CL基因已经开展克隆及表达、生物信息学分析等。但是，针对茶树4CL基因开展SSR分子标记的开发及应用研究未见报道。
茶树形态多样，传统的种质资源的鉴定，主要建立在表型基础之上的，容易受环境影响。由于分子标记不受环境影响，其变异只源于等位基因DNA序列的差异，因此分子标记对于茶树的遗传多样性研究和优质品种资源的鉴定等都有重要作用及意义。目前分子标记方法主要有RAPD、RFLP、AFLP、ISSR、SSR、EST-SSR、SRAP、SCoT等，这些分子标记方法原理不同，标记的引物和体系也不相同，扩增的条带、聚类分析上也会存在一定的差异。其中，简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)是一种重要的分子标记，共显性遗传，可以运用于品种鉴定、遗传图谱构建，功能基因定位及QTL定位品种鉴定、遗传结构和资源多样性分析、分子标记辅助选育种研究等许多方面。
2017年高立志完成了茶树阿萨姆种‘云抗10号’大叶茶核基因组的测序及组装，成功绘制了茶树高质量基因组图谱，其研究显示茶树整个基因组中80.9％是重复序列，含量非常高，表明具有大量的SSR分子标记。利用这已完成测序的茶树基因组信息，深度挖掘茶树酚类物质合成途径关键酶基因SSR分子标记，并获得多态性引物开发及应用，可为以后研究茶叶生物化学、茶树基因方向的科研工作者提供一个参考的依据。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供茶树4-香豆酰CoA连接酶基因SSR分子标记引物及应用，以便于进一步研究茶树酚类物质合成以及茶树遗传多态性。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
茶树4-香豆酰CoA连接酶基因SSR分子标记，具有序列表SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.2的碱基序列，标记编号为SSR14 4CL或SSR15 4CL。
扩增上述茶树4-香豆酰CoA连接酶基因SSR分子标记的引物，分子标记SSR14 4CL的引物包括具有序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4的碱基序列，分子标记SSR15 4CL的引物包括具有序列表SEQ.ID.No.5和SEQ.ID.No.6的碱基序列。
上述SSR分子标记的制备方法，利用特定引物对茶树总DNA进行PCR扩增，得到简单重复序列；引物包括具有序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4的碱基序列，或者序列表SEQ.ID.No.5和SEQ.ID.No.6的碱基序列。
上述SSR分子标记的制备方法，包括以下操作步骤：
<1>提取DNA
采用试剂盒提取茶树的基因组DNA作为模板；
<2>PCR反应
反应体系：反应总体积为20μL，其中2×PCR Mix 10μL，茶树DNA模板1μL，ddH2O 8μL，正向引物和反向引物各1μL；
反应程序：94℃预变性5min，接着每个循环94℃高温变性45s，55～60℃退火时间45s，72℃延伸45s，35个循环后，72℃延伸7min，4℃永久保存；
<3>电泳显色
取5μL PCR产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上恒电压200v电泳60min；电泳结束后，凝胶用硝酸银进行染色显影。
正向引物为序列表SEQ.ID.No.3或SEQ.ID.No.5的引物，反向引物为序列表SEQ.ID.No.4或SEQ.ID.No.6的引物。
茶树DNA模板为1～50ng，正向引物或反向引物的浓度为10μmol/L。
上述SSR分子标记在茶树或含酚类物质的植物种质资源的鉴定、遗传多样性的研究、遗传图谱的构建、种子纯度鉴定、种群的亲缘关系及演化或遗传育种方面的应用。
上述SSR分子标记的引物在茶树或含酚类物质的植物种质资源的鉴定、遗传多样性的研究、遗传图谱的构建、种子纯度鉴定、种群的亲缘关系及演化或遗传育种方面的应用。
针对目前茶树的酚类物质合成途径关键酶研究尚少的问题，发明人在‘云抗10号’大叶茶树全基因组公开报道的基础上，利用分子标记技术研究开发了茶树4-香豆酰CoA连接酶基因SSR分子标记(SSR14 4CL和SSR15 4CL)引物及其应用。研究表明，本发明依据具体特定的基因，在茶树全基因组上开发其SSR引物方法可行，所得引物多态性高、重复性好，具有较好的可行性、针对性。据此，发明人开展了茶树种质资源遗传多态性的研究。综上，本发明的研究方法、SSR分子标记及其引物，可广泛应用于茶树品种鉴定、遗传结构和资源多样性分析、遗传图谱构建，功能基因定位及QTL定位、种子纯度鉴定、分子标记辅助选育种研究中，便于进一步研究茶树酚类物质合成以及茶树遗传多态性，促进深入开发茶树资源。
附图说明
图1是茶树4CL SSR 6对引物扩增片段的聚丙烯酰胺胶电泳图，图中：M：2000bpDNA Marker；各泳道对应茶种质为：1，6，12，18，24，30是湘波绿；2，7，13，19，25，31是黄观音；3，8，14，20，26，32是碧香早；4，9，15，21，27，33是福鼎大毫；5，10，16，22，28，34是黄金芽；11，17，23，29，35是罗香2号；各泳道对应引物扩增片段为：1～5为4CL-12SSR引物扩增片段；6～11为4CL-13SSR引物扩增片段；12～17为4CL-14SSR引物扩增片片段；18～23为4CL-15SSR引物扩增片段；24～29为4CL-2SSR引物扩增片段；30～35为4CL-6SSR引物扩增片片段。
图2是茶树4CL-14SSR引物聚丙烯酰胺胶电泳图，图中：M：2000bp DNA Marker；各泳道对应茶种质见表1。
图3是茶树4CL-15SSR引物聚丙烯酰胺胶电泳图，图中：M：2000bp DNA Marker；各泳道对应茶种质见表1。
具体实施方式
茶树茶多酚合成途径关键酶4-香豆酰CoA连接酶(4CL)SSR分子标记研究
(1)从NCBI上下载茶树茶多酚合成途径关键酶4-香豆酰CoA连接酶(4CL)基因(GenBank:DQ194356)mRNA序列。
(2)下载茶树‘云抗10号’全基因组序列(下载地址：http://www.plantkingdomgdb.com/tea_tree/dat)。在茶树全基因组中运用SSR search软件寻找其SSR标记，提取SSR序列及其上下游特定长度(默认100bp)的序列。运用primer3进行引物设计，获得引物序列、SSR重复基元和重复长度、预扩增片段长度等。据此合成制备4CL基因相关的17对SSR分子标记引物序列。
(3)采用天根生物有限责任公司生产的试剂盒HYQspin TM CT Plant DNA Kit提取72个茶树种质资源(表1)的基因组DNA。
表1 72份茶叶样品名称
泳道
样品编号及名称
泳道
样品编号及名称
泳道
样品编号及名称
泳道
样品编号及名称
1
A27-1
19
湘波绿
37
罗香12
55
三江1号
2
A27-2
20
梅占
38
罗香17
56
4号地紫芽
3
罗香19
21
紫鹃
39
板唐F5号
57
三江2号
4
罗香21
22
黄观音
40
板唐P号
58
板唐S号
5
A91
23
A33
41
风相平10号
59
加尤2号
6
A90
24
A54
42
黄金茶
60
加尤黄叶
7
A87
25
A51
43
A53
61
加尤5号
8
A20
26
A48
44
白叶一号
62
风相平21号
9
A73
27
A14
45
罗香20-1
63
四联红叶6号
10
A63
28
金观音
46
板唐F号
64
刘三姐1号
11
梅占
29
碧香早
47
罗香10-1
65
板唐J号
12
A71
30
福鼎大毫
48
王丰新茶园
66
桂红2号
13
A85
31
黄玫瑰
49
风相平1号
67
加尤4号
14
A76
32
黄金芽
50
风相平5号
68
四联红叶4号
15
A64
33
金牡丹
51
凌云红叶3号
69
加尤7号
16
金萱
34
玉麒麟
52
11号地48号
70
隆林42
17
A53
35
桂绿1号-2
53
罗香4
71
罗香10-2
18
桂绿1号-1
36
罗香2
54
罗香9
72
罗香27
(4)从步骤(2)中获得的17对SSR引物中，对获得的分子标记引物进行了位置、类型等进行了分析，随机挑选位于基因间区的11对引物中的2对引物4CL-2和4CL-6，及其2对位于5’上游非翻译区的引物4CL-12和4CL-13，2对位于内含子区的引物4CL-14和4CL-15共6对引物(表2)，以步骤(3)提取72份茶树种质资源中的黄观音、紫鹃、金牡丹、桂绿1号、黄金芽和碧香早总共6个茶树种质资源基因组DNA为模板开展SSR-PCR反应，并利用聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳及快速银染法检测PCR扩增产物。
PCR反应体系：反应总体积为20μL，其中2×PCR Mix 10μL，茶树DNA模板(1～50ng)1μL，ddH2O 8μL，正向引物(10μmol/L)和反向引物(10μmol/L)各1μL。
PCR反应程序：94℃预变性5min，接着每个循环94℃高温变性45s，55～60℃退火时间45s，72℃延伸45s，35个循环后，72℃延伸7min，4℃永久保存。
电泳显色：取5μL PCR产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上恒电压200v电泳60min。电泳结束后，凝胶用硝酸银进行染色显影。凝胶先用ddH2O洗3次，每次洗1min，然后加入0.5～1.5％的硝酸银染色10～15min；再用ddH2O洗3次，每次洗1min。凝胶在显影液中轻摇至显带清晰后放入ddH2O终止显影。引物筛选的电泳结果如图1所示。
PCR扩增电泳染色结果如图1所示，6对SSR引物中，只有位于内含子区域的4CL-14和4CL-15两对SSR引物扩增的片段有差异性，其多态性好、主带清晰。
表2 4-香豆酰CoA连接酶(4CL)基因SSR引物
(5)以4CL-14和4CL-15为SSR引物，以步骤(4)中提取的72份茶树基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应开展茶树种质资源遗传多态性的研究，获得多态性图谱特征如图2和图3(条带数11和16)。
序列表
<110> 广西壮族自治区亚热带作物研究所（广西亚热带农产品加工研究所）
<120> 茶树4-香豆酰CoA连接酶基因SSR分子标记引物及应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 148
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
attttgcact gatttggcaa gagtgtttaa ttttagcatg aattttgatt ttgtttgggt 60
tgggttgggt tgggttgggt tgggtattgt gagtataggg atatgggatg acagaggcag 120
ggccagtatt atcaatgtgc ctggcgtt 148
<210> 2
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atccgtggtc ctcaaattat gaaaggtact actgctgctg ctgctgctgc tgctgctttc 60
tcttttaata attcattccc tctgctcatc aagttgctca attgtcatca tgcccaacaa 120
atgcaaaaac tattc 135
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
attttgcact gatttggcaa gagt 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aacgccaggc acattgataa tact 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atccgtggtc ctcaaattat gaaa 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaatagtttt tgcatttgtt gggc 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acgaccattg caattacttc aggt 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caccaagcct tgtccttaga tcat 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccaattttac gaacacccta tcaa 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgggttcaaa cctattcaat tcat 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
attgccaatt tggttagacg gtta 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gagaatggaa gaggagagga gagc 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tccctctcta tcccctctct gtct 24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccacggacaa cattgttacc ctat 24
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