使用普利多匹定治疗线粒体相关疾病和病症，包含其症状
阅读说明：本技术 使用普利多匹定治疗线粒体相关疾病和病症，包含其症状 (Treatment of mitochondrial-related diseases and disorders, including symptoms thereof, with pridopidine ) 是由 迈克尔·海登 米甲·杰瓦 安娜·克里斯蒂娜·卡瓦略雷戈 于 2020-03-15 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种用于治疗患有与线粒体功能障碍相关的疾病或病症的受试者的方法,所述方法包括向所述受试者施用包括普利多匹定或其药学上可接受的盐的组合物。(The present invention provides a method for treating a subject having a disease or disorder associated with mitochondrial dysfunction, the method comprising administering to the subject a composition comprising pridopidine or a pharmaceutically acceptable salt thereof.)
技术领域
本发明提供了一种用于治疗患有与线粒体功能障碍相关的疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括普利多匹定(pridopidine)或其药学上可接受的盐的组合物。
背景技术
线粒体是在大多数真核细胞中发现的并且执行许多代谢功能，包含通过氧化磷酸化(OXPHOS)进行的ATP合成的双膜细胞器。线粒体还涉及生物分子的合成、钙稳态的维持、活性氧类(ROS)的产生和细胞凋亡的激活。线粒体是结构复杂并且高度动态的运动细胞器。线粒体通过融合和裂变的连续循环过程经历不断的形态变化，这确定了其形态和大多数线粒体功能。
鉴于其在细胞稳态中的核心作用，线粒体功能障碍与许多年龄相关病症有关，包含线粒体疾病、癌症、代谢疾病和糖尿病、炎性病状、神经退行性病症、神经病和神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森氏病和亨廷顿病。普利多匹定(4-[3-(甲基磺酰基)苯基]-1-丙基-哌啶)(以前被称为ACR16，TV-7820)正在临床开发中用于治疗HD和ALS。据显示，普利多匹定在神经退行性疾病的动物和细胞模型(包含HD、PD、ALS和AD的模型)中发挥神经保护作用(Francardo、Veronica、Michal Geva、Francesco Bez、Quentin Denis、Lilach Steiner、Michael R.Hayden和M.Angela Cenci.2019.“普利多匹定通过σ-1受体在帕金森氏病小鼠模型中诱导功能性神经恢复(Pridopidine Induces FunctionalNeurorestoration Via the Sigma-1 Receptor in a Mouse Model of Parkinson'sDisease.)”《神经治疗学(Neurotherapeutics)》16(2):465–79；Ryskamp、Daniel A.、LiliWu、Jun Wu、Dabin Kim、Gerhard Rammes、Michal Geva、Michael Hayden和IlyaBezprozvanny.2019“普利多匹定通过作用于σ-1受体来稳定阿尔茨海默病小鼠模型中的蘑菇刺(Pridopidine Stabilizes Mushroom Spines in Mouse Models of Alzheimer'sDisease by Acting on the Sigma-1 Receptor.)”《疾病神经生物学(Neurobiology ofDisease)》,124,489-504；Ryskamp、Daniel、Jun Wu、Michal Geva、Rebecca Kusko、IrisGrossman、Michael Hayden和Ilya Bezprozvanny.2017.“σ-1受体介导普利多匹定在亨廷顿病小鼠模型中的有益作用(The Sigma-1 Receptor Mediates the Beneficial Effectsof Pridopidine in a Mouse Model of Huntington Disease.)”《疾病神经生物学》97(A部分):46–59；Ionescu、Ariel、Tal Gradus、Topaz Altman、Roy Maimon、Noi SarafAvraham、Michal Geva、Michael Hayden和Eran Perlson.2019.“通过普利多匹定靶向σ-1受体改善SOD1G93A模型中ALS病理学的核心特征(Targeting the Sigma-1 Receptor viaPridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93AModel.)”《细胞死亡和疾病(Cell Death&Disease)》10(3):210；Garcia-Miralles、Marta、Michal Geva、Jing Ying Tan、Nur Amirah Binte Mohammad Yusof、Yoonjeong Cha、Rebecca Kusko、Liang Juin Tan等人2017.“早期普利多匹定治疗改善YAC128亨廷顿病小鼠的行为和转录缺陷(Early Pridopidine Treatment Improves Behavioral andTranscriptional Deficits in YAC128 Huntington Disease Mice.)”《临床调查洞察杂志(JCI Insight.)》。线粒体功能障碍已在这些神经退行性疾病中的每种神经退行性疾病的病理学中被证明。
发明内容
在第一方面，本发明提供了一种用于治疗有需要的受试者的与线粒体功能障碍相关的疾病、病症或其任何症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括普利多匹定或其药学上可接受的盐的有效剂量的组合物，由此治疗所述受试者。
在另外的方面，本发明提供了一种包括普利多匹定或其药学上可接受的盐的组合物，所述组合物供用于治疗与线粒体功能障碍相关的疾病、病症或其任何症状的方法中使用。
在一些实施例中，所述与线粒体功能障碍相关的疾病、病症或其任何症状是与线粒体肌病相关的疾病、病症或任何症状。
在其它实施例中，所述线粒体肌病选自MELAS综合征、MERRF综合征、雷氏病(LeighDisease)、慢性进行性眼外肌麻痹(Chronic Progressive External Ophthalmoplegia，C/PEO)、糖尿病伴耳聋(MIDD或DAD)、卡恩斯-塞尔综合征(Kearns-Sayre syndrome，KSS)、阿尔珀斯氏综合征(Alpers Syndrome)、线粒体DNA耗竭综合征(Mitochondrial DNAdepletion syndrome，MDS)、线粒体神经胃肠型脑肌病(Mitochondrialneurogastrointestinal encephalomyopathy，MNGIE)、神经病、共济失调和色素性视网膜炎(Neuropathy,ataxia and retinitis pigmentosa，NARP)、皮尔逊综合征(Pearsonsyndrome)、雷伯氏遗传性视神经病变(Lebers Hereditary Optic Neuropathy，LHON)、显性视神经萎缩(Dominant Optic Atrophy，DOA)、色素性视网膜病(Pigmentaryretinopathy)、沃尔夫勒姆综合征(Wolfram Syndrome)、弗里德赖希氏共济失调(Friedrich's Ataxia，FRDA)、线粒体神经胃肠型脑肌病(MNGIE)以及其任何组合。
在另外的实施例中，所述与线粒体功能障碍相关的疾病、病症或其任何症状是与溶酶体贮积病相关的疾病、病症或任何症状。
在其它实施例中，所述溶酶体贮积病选自糖原累积病II型(Glycogenosis TypeII(庞贝氏病(Pompe Disease)))、多种硫酸酯酶缺乏症(Multiple SulphataseDeficiency，MSD)、粘多糖贮积病(Mucopolysaccharidoses，MPS)、粘脂贮积病(Mucolipidoses，ML)I型到III型、G(M1)-神经节苷脂累积病(G(M1)-Gangliosidosis)、法布里病(Fabry Disease)、法伯病(Farber Disease)、戈谢病(Gaucher Disease)、尼曼-皮克病(Niemann-Pick Disease)、粘脂贮积病(ML)IV型、胱氨酸病(Cystinosis)、神经元蜡样脂褐质沉积症(Neuronal Ceroid-Lipofuscinoses)以及其任何组合。
在一些实施例中，所述与线粒体功能障碍相关的疾病、病症或其任何症状是与神经退行性疾病相关的疾病、病症或任何症状。
在一些实施例中，所述神经退行性疾病选自帕金森氏病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默病、额颞痴呆(FTD)、腓骨肌萎缩症(CMT)以及其任何组合。
在一些实施例中，所述与线粒体功能障碍相关的疾病、病症或其任何症状是双相障碍(bipolar disorder)。
在一些实施例中，所述普利多匹定呈其中性/碱性形式。在一些实施例中，所述普利多匹定呈药学上可接受的盐的形式。在一些另外的实施例中，所述普利多匹定是盐酸普利多匹定。
在一些实施例中，包括普利多匹定的所述组合物是口服施用的。
在其它实施例中，包括普利多匹定的所述组合物以可吸入粉末、注射剂、液体、凝胶、固体、胶囊、滴眼剂或片剂的形式施用。
在一些实施例中，包括普利多匹定的所述组合物周期性地施用(即，所述普利多匹定以规律的预定时间间隔如每天、每小时、每周、每月施用，每个周期也任选地定义要施用的剂量和每时间段的施用次数)。在另外的实施例中，包括普利多匹定的所述组合物每天一次、每天两次或每天三次施用。在另外的实施例中，包括普利多匹定的所述组合物每天少于一次施用。在一些实施例中，包括普利多匹定的所述组合物以每天一剂、每天两剂或每天三剂施用。
在一些实施例中，普利多匹定以介于1mg/天与400mg/天之间的日剂量施用。在一些实施例中，普利多匹定以介于1mg/天与300mg/天之间的日剂量施用。在其它实施例中，普利多匹定以介于1mg/天与90mg/天之间的日剂量施用。在其它实施例中，普利多匹定以介于20mg/天与90mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于45mg/天与90mg/天之间的日剂量施用。在其它实施例中，普利多匹定以介于20mg/天与50mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于1mg/天与10mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于10mg/天与20mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于20mg/天与30mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于30mg/天与40mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于40mg/天与50mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于50mg/天与60mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于60mg/天与70mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于70mg/天与80mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于80mg/天与90mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于90mg/天与100mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于100mg/天与150mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于150mg/天与200mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于200mg/天与250mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于250mg/天与300mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于300mg/天与350mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于350mg/天与400mg/天之间的日剂量施用。
附图说明
本说明书的结论部分中特别指出并明确主张了被视为本发明的主题。然而，当与附图一起阅读时，可以通过参考以下详细描述好地理解本发明的组织和操作方法两方面连同其目的、特征和优点，在附图中：
图1A-1G显示普利多匹定拯救异常线粒体形态并且恢复Y128(YAC128，HD)神经元中的线粒体-ER接触。图1A：用Mitotracker染料染色的WT和Y128(HD)皮质/纹状体神经元中线粒体网络的视觉表示。图1B：在普利多匹定处理之前和之后，来自1A的定量-WT与Y128(HD)皮质/纹状体神经元之间的线粒体数量类似(n＝4)。图1C和1D：Y128 HD线粒体显示形态受损，其中圆形线粒体的百分比增加(1C)并且细长线粒体百分比降低(1D)。普利多匹定处理(1μM)将Y128形态校正到正常水平。(n＝4)。图1E：将WT和Y128神经元用线粒体标志物(1E中列)和ER标志物(1E右列)染色，并且对ER和线粒体的共定位进行分析(1E左列)(n＝约15个投影/病状)。图1F：1E的定量显示与WT相比，Y128神经元中的Mito-ER接触减少。普利多匹定(1μM)显著增加了Mito-ER接触。图1G：纵横比，线粒体轴之间的比率指示线粒体健康，(参见方法，第86段和结果，第103段)在HD神经元中降低。普利多匹定处理挽救了Y128神经元(1G)的纵横比。通过克鲁斯卡尔-沃利斯测试和邓恩多重比较测试，*p<0.05，***p<0.001。
图2A-2B显示普利多匹定改善了Y128 HD神经元中受损的线粒体动力学。图2A：在旋转圆盘共聚焦中跟踪MitoDSRed转染的线粒体，持续12分钟，并且使用波形记录器(n＝7-9个投影/病状)对速度和定向运输进行定量。WT—上图示出了逆行方向和顺行方向两者上的线粒体运动。Y128—中间图像显示，与WT相比，HD中的任一方向上都不存在线粒体运动。用1μM普利多匹定处理的Y128—下图显示普利多匹定处理恢复了逆行和顺行两者的线粒体运动，类似于WT。图2B：图2A的定量，运输的定向分析表明，Y128神经元中静止线粒体的百分比增加，而逆行和顺行运输两者均减少。普利多匹定处理将静止线粒体的百分比降低到WT水平，并且将逆行和顺行运输两者的百分比增加到WT水平。图2C：Y128神经元的总速度降低。普利多匹定处理增加总线粒体速度。通过2向ANOVA，然后通过Tukey的多重比较测试，*p<0.05，$p<0.05(对顺行Y128基础)。
图3A-3H显示普利多匹定挽救了HD细胞模型中受损的线粒体呼吸。图3A-3D：在用1和5μM普利多匹定持续24小时处理的WT和Y128皮质/纹状体神经元中评估耗氧量和ATP产生，其中两种剂量均显示出对基础呼吸和最大呼吸的挽救，以及ATP产生增加(n＝3)。图3E-3H：HD神经干细胞(NSC)的耗氧量和ATP产生减少。以1μM进行24小时的普利多匹定处理挽救了基础和最大呼吸以及ATP产生。通过克鲁斯卡尔-沃利斯测试和邓恩多重比较测试，*p<0.05，**p<0.01。
图4A-4C显示普利多匹定处理保护Y128神经元和HD淋巴母细胞免受诱导的线粒体功能障碍。用0.1或1μM普利多匹定处理的皮质(图4A-左和图4B)和纹状体(图4A-右和图4C)WT和Y128神经元在用寡霉素加FCCP(羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙，一种氧化磷酸化解偶联剂)去极化后评估其线粒体膜电位(MMP，ΔΨm)的变化(n＝7-10)。普利多匹定(0.1和1μM)增加了MMP，MMP在Y128神经元中降低，在皮质和纹状体神经元两者中恢复到与WT相当的水平。图4D-4E：使用H2O2在Y128皮质/纹状体共培养物中诱导氧化应激，导致MMP显著降低(图4E)和细胞活力降低(图4F)。普利多匹定处理(5μM)挽救了MMP(图4D)并增加了细胞存活率(图4E)，图4F：来自HD患者或健康对照的人淋巴母细胞用1、5或10μM普利多匹定和/或H2O2预处理。所有剂量的普利多匹定都增加了ΔΨm，其中用5μM实现了最显著的作用(n＝4)。通过克鲁斯卡尔-沃利斯测试和邓恩多重比较测试，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。“Pri”是指普利多匹定。
图5A-5E显示普利多匹定在Y128神经元和HD NSC和淋巴母细胞中恢复氧化激发诱导的活性氧类(ROS)产生。图5A-5C：图5A是用用于记录H2O2水平的MitoPY荧光探针处理的皮质/纹状体神经元培养物的代表性图像。如所指示的，添加线粒体复合物III抑制剂抗霉素A(AntA，2μM)以诱导线粒体功能障碍(左图-AntA处理前，中图-Ant A处理后未经处理的神经元，右图-AntA处理后经普利多匹定处理的神经元)。图5B：图5A在皮质神经元中的定量。图5C：图5A在纹状体神经元中的定量。用1μM普利多匹定处理的皮质和纹状体神经元显示在AntA后由MitoPY荧光探针所记录的线粒体H2O2水平降低，如所指示的(n＝4，考虑到纹状体神经元约20个细胞/病状和皮质神经元约10个细胞/病状)。比例尺＝30μM。图5D：用线粒体复合物II抑制剂粘噻唑(Myxo，3μM)处理人NSC，所述Myxo也诱导线粒体功能障碍并增加线粒体H2O2水平。用普利多匹定(1μM)处理持续24小时降低了线粒体H2O2水平(n＝4)。图5E：对照和HD淋巴母细胞用H2O2激发以诱导线粒体功能障碍，从而导致ROS水平增加(使用CellRox染色来确定ROS水平)。用5μM普利多匹定预处理持续24小时显著降低了ROS水平。(n＝4)。通过2向ANOVA，然后通过Tukey的多重比较测试，*p<0.05，**p<0.01，*＊＊*p<0.0001。在图5E中，通过克鲁斯卡尔-沃利斯测试和邓恩多重比较测试，*＊*p<0.001，*＊＊*p<0.0001。
图6A-6M显示普利多匹定处理延迟了Y128小鼠运动缺陷的发生，使线粒体复合物活性正常化并减少了分离的Y128纹状体线粒体中H2O2产生。图6A：体内实验设计的示意性图示：小鼠用媒剂或普利多匹定处理持续45天。在第0天(1.5个月龄)处理前和第44天(3个月龄)测量转棒行为测试(RR)；图6B：在1.5个月龄时，与WT相比，处理前Y128小鼠的运动能力没有损伤。图6C：在3个月龄时，在经媒剂处理的Y128小鼠中观察到显著损伤。在转棒运动测试中，与经媒剂处理的对照相比，普利多匹定处理显著增加了Y128小鼠跌落延迟时间。图6D-6H：使用海马XF测量耗氧率(OCR)评估来自经媒剂处理或经普利多匹定处理的野生型和Y128小鼠的纹状体线粒体中的电子流。顺序地注射线粒体复合物抑制剂和底物、2μM鱼藤酮、10mM琥珀酸盐、4μM抗霉素A和1mM抗坏血酸盐/100mM TMPD以分别计算线粒体复合物I、复合物II、复合物III和复合物IV的活性。复合物II、III和IV在Y128小鼠中显示OCR增加，表明存在早期补偿机制，并且普利多匹定挽救了这种效应。图6I-6K：抗霉素A(2μM)用于抑制线粒体复合物III。与WT小鼠相比，从Y128小鼠中分离出的线粒体中线粒体H2O2水平增加。普利多匹定降低了小鼠的线粒体H2O2水平。XY线示出了添加抗霉素A后荧光的时间依赖性变化。图6L-6M：来自经普利多匹定处理的Y128小鼠的线粒体中的钙吸收也被改善。细胞外钙水平响应于普利多匹定处理而降低(图6L)，这是线粒体钙调控增加的证据(图6M)，通过非参数克鲁斯卡尔-沃利斯测试，*p<0.05，**p<0.01。
图7A-7B显示普利多匹定降低mHtt诱导的ER应激。H2a-GFP与突变Htt96Q-mCherry(HD外显子1)(图7A)或Htt20Q-mCherry(WT)(图7B)在STHdhQ7/7细胞中瞬时共表达。H2a-GFP聚集是ER应激的标志物。对mCherry和GFP的聚集进行了评估，并且使用共聚焦显微镜获取了图像。与未经处理的细胞相比，Htt96Q增强了ER应激，并且用0.03μM、0.3μM和3μM进行的普利多匹定处理降低了这些细胞中的ER应激(图7A)。Htt20Q(wt)不会诱导ER应激(图7B)。出于比较的目的，100％表示表现出Htt96Q-mCherry聚集体的未经处理的细胞中的H2a-GFP相对强度，0％为不具有Htt96Q-cherry聚集体的未经处理的细胞中的H2a-GFP相对强度。曲线图是3个实验+-SE的平均值。与未经处理的细胞相比，*p<0.05并且**p<0.01。
图8显示普利多匹定降低在HD模型中升高的磷酸化eIF2α(eIF2α-P)水平(ER应激的度量)。在用突变Htt(Htt96Q，实线)或WT Htt(Htt20Q，虚线)转染的并用0.3和3μM普利多匹定处理持续24小时的HEK293细胞中测定eIF2α-P水平。eIF2α-P与总eIF2α的比率通过免疫印迹进行定量。与WT相比，突变Htt增加了磷酸化eIF2α水平，并且两种普利多匹定浓度都降低了eIF2α-P水平。(*p<0.05)
具体实施方式
在以下具体实施方式中，陈述了许多具体细节以便提供对本发明的透彻理解。然而，本领域的技术人员将理解的是，可以在不存在这些具体细节的情况下实践本发明。在其它情况下，并未详细描述众所周知的方法、程序和组分，以免模糊本发明。
在第一方面，本发明提供了一种用于治疗有需要的受试者的与线粒体功能障碍相关的疾病、病症或其任何症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括普利多匹定或其药学上可接受的盐的有效剂量的组合物，由此治疗所述受试者。
在另外的方面，本发明提供了一种包括普利多匹定或其药学上可接受的盐的组合物，所述组合物供用于治疗与线粒体功能障碍相关的疾病、病症或其任何症状的方法中使用。
当提及“与线粒体功能障碍相关的疾病、病症或其任何症状”时，应当理解为涵盖危及受试者健康的任何类型的病状，其中线粒体或其任何部分的功能受损起着直接或间接的作用。
在一些实施例中，所述与线粒体功能障碍相关的疾病、病症或其任何症状是与线粒体肌病相关的疾病、病症或任何症状。
在其它实施例中，所述线粒体肌病选自MELAS综合征、MERRF综合征、雷氏病、阿尔珀斯氏综合征、慢性进行性眼外肌麻痹(C/PEO)、糖尿病伴耳聋(MIDD或DAD)、卡恩斯-塞尔综合征(KSS)、线粒体DNA耗竭综合征(MDS)、线粒体神经胃肠型脑肌病(MNGIE)、神经病、共济失调和色素性视网膜炎(NARP)、皮尔逊综合征、雷伯氏遗传性视神经病变(LHON)、显性视神经萎缩(DOA)、色素性视网膜病、沃尔夫勒姆综合征、弗里德赖希氏共济失调(FRDA)、线粒体神经胃肠型脑肌病(MNGIE)以及其任何组合。
当提及“线粒体肌病”时，应当理解为涵盖由功能障碍的线粒体引起的任何疾病或病症或任何症状。线粒体疾病有时(约15％的时间)是由影响线粒体功能的线粒体DNA突变引起的。其它线粒体疾病是由核DNA的基因突变引起的，所述核DNA的基因产物被输入到线粒体(线粒体蛋白)以及获得性线粒体病状中。线粒体疾病具有独特的特性，这既是因为疾病的遗传方式，也是因为线粒体对细胞功能至关重要。具有神经肌肉疾病症状的这些疾病的子类通常被称为线粒体肌病。
线粒体肌病疾病和病症包含但不限于：
MELAS综合征(线粒体肌病、脑病、乳酸性酸中毒和中风)。由线粒体DNA突变引起的进行性神经退行性病症。由于对所述疾病知之甚少并且难以诊断，目前尚不知道全世界有多少人患有MELAS。所述综合征影响所有种族群体以及男性和女性两者。受影响的个体通常在介于4岁与40岁之间开始表现出症状。预后差；所述疾病常常是致命的。MELAS综合征无法治愈；医疗保健主要是支持性的。症状：由于患有MELAS综合征的患者的所有细胞中都存在有缺陷的线粒体，因此可能出现多种症状，往往使人衰弱。中风会导致脑损伤，导致癫痫发作、麻木或部分瘫痪。脑病(脑部疾病)会导致震颤、肌肉痉挛、失明、耳聋，并且可能导致痴呆。肌病(肌肉疾病)导致行走、运动、进食和说话困难。
MERRF综合征(或肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维)：开始于儿童时期，并且影响神经系统和骨骼肌以及其它身体系统的极其罕见的病症。MERRF的显著特征是肌阵挛，由突然、短暂、抽搐的痉挛组成，可以影响手臂和腿部或整个身体。另外，患有MERRF综合征的个体可能有肌肉无力(肌病)、协调运动能力受损(共济失调)、癫痫发作和智力功能缓慢退化(痴呆症)。身材矮小、视神经退化(视神经萎缩)、听力损失、心肌病和神经损伤引起的感觉异常(外周神经病)也是常见的症状。当用经过修饰的Gomori三色染色并在显微镜下观察时，存在异常的肌肉细胞并表现为破碎红纤维(RRF)。MERRF是由线粒体DNA(mtDNA)突变引起的。
出生时雷氏病的患病率估计为大约36000分之一。症状的典型发作发生在12个月龄之前，但在极少数情况下，所述疾病可能在青春期期间或甚至成年早期显现。运动里程碑的丧失、头部控制差的张力减退、反复呕吐和运动障碍是常见的初始症状。锥体束和锥体外系体征、眼球震颤、呼吸障碍、眼肌麻痹和外周神经病常常在后期被注意到。癫痫相对少见。针对雷氏病不存在特殊的治疗。
慢性进行性眼外肌麻痹(C/PEO)由眼外肌缓慢进行性麻痹表征。患者通常会经历双侧对称性进行性上睑下垂，然后数月到数年后出现眼肌麻痹。不涉及睫状肌和虹膜肌。CPEO是线粒体肌病最常见的表现。与线粒体DNA(mtDNA)突变相关的CPEO可能在不存在任何其它临床症状的情况下发生，但通常与骨骼肌无力相关。然而，具有类似临床呈现的个体可能有各种线粒体缺陷。
糖尿病伴耳聋(MIDD或DAD)：MIDD占患有糖尿病的人的1％。超过85％的携带线粒体DNA在位置3243处突变的人呈现糖尿病症状。通常诊断出患有MIDD的人的平均年龄为37岁，但也被认为其年龄介于11岁到68岁之间的范围。在携带位置3243处的线粒体DNA突变的这些糖尿病患者中，75％会经历感音神经性听力损失。在这些情况下，听力损失通常出现在糖尿病发作之前，并且以高音调频率感知下降为标志。与糖尿病相关的听力损失在男性中通常比女性更常见，并且下降得更快。
卡恩斯-塞尔综合征(KSS)发作：20岁之前。卡恩斯-塞尔综合征的患病率为大约每100,000个体中1到3个。罕见的神经肌肉障碍。重要的临床症状特征是存在单侧或双侧上睑下垂(眼睑部分闭合)。这种疾病的主要由三个主要发现表征：某些眼部肌肉进行性麻痹(慢性进行性眼外肌麻痹[CPEO])；有色(色素)物质在眼睛内衬的富含神经的膜上异常积聚(非典型色素性视网膜炎)，导致慢性炎症、进行性退化和某些眼睛结构的磨损(视网膜色素变性)；以及心脏疾病(心肌病)，如心脏传导阻滞。其它发现可以包含肌肉无力、身材矮小、听力丧失和/或由于影响大脑的一部分(小脑)的问题而丧失协调随意运动的能力(共济失调)。在一些情况下，KSS可能与其它病症和/或病状相关。
阿尔珀斯氏综合征(阿尔珀斯-胡滕洛赫尔综合征(Alpers-HuttenlocherSyndrome))：发作：出生后数周到数年。症状：精神运动退化(痴呆)、癫痫和肝脏疾病。严重且持续的癫痫发作会在生命的前十年内导致死亡。
线粒体DNA耗竭综合征(MDS)发作：婴儿期症状：这种病症通常会导致肌肉无力和/或肝脏衰竭，并且更罕见的是会导致大脑异常。“松软”、喂养困难和发育迟缓是常见症状；PEO和癫痫发作较少见。
线粒体神经胃肠型脑肌病(MNGIE)发作：通常20岁之前。症状：这种病症会导致PEO、上睑下垂(眼睑下垂)、四肢无力和胃肠道(消化)问题，包含慢性腹泻和腹痛。另一种常见症状是外周神经病(可以导致感觉损伤和肌肉无力的神经功能障碍)。
神经病、共济失调和色素性视网膜炎(NARP)发作：婴儿期到成年。症状：NARP会导致神经病(可以导致感觉损伤和肌肉无力的神经功能障碍)、共济失调和色素性视网膜炎(眼睛视网膜退化，其中导致视力丧失)。NARP还可能导致发育迟缓、癫痫和痴呆。
皮尔逊综合征发作：婴儿期。症状：这种综合征会导致严重的贫血和胰腺功能障碍。在疾病中幸存下来的儿童通常会发展为卡恩斯-塞尔综合征。
雷伯氏遗传性视神经病变(LHON)由在数天带数月的时间段内，双眼以连续方式出现急性和无痛中心视力丧失表征，LHON是第一个与线粒体DNA点突变相关的母系遗传性眼科病症。LHON在英国和欧洲其它地区的公认疾病患病率估计为25,000分之一。线粒体呼吸链复合物I亚基基因中的三个mtDNA点突变(ND4中的G11778A、ND1中的G3460A和ND6中的T14484C)共同导致95％的LHON病例。其它致病性mtDNA突变在继续被鉴定，特别是在非高加索族群中，如最近所鉴定的ND5中的mtDNA T12338C突变似乎在汉族中很常见。
显性视神经萎缩(DOA)：DOA是主要影响视网膜神经节细胞(RGC)和视网膜神经纤维层的遗传性疾病。在北欧，DOA的患病率估计为每35,000个体中就有1个。视敏度通常在生命的前二十年内下降到平均20/80到20/120。神经视网膜边缘变薄似乎是DOA的普遍发现，其中偶见发现包含椎间盘“碟状化”、杯盘比超过0.5和视盘周围萎缩。早期视神经外观通常由视神经扇形苍白表征。
色素性视网膜病变和其它眼科问题：色素性视网膜病变是一种非特异性发现，可能在若干种线粒体疾病中发现。可以看到色素性视网膜病变的最详细的原发性mtDNA疾病是神经源性虚弱、共济失调和色素性视网膜炎(NARP)，这是由线粒体复合物V亚基基因ATPase 6中的T8993C mtDNA突变引起的。
沃尔夫勒姆综合征：一种遗传性病状，通常与儿童期发作的胰岛素依赖型糖尿病和进行性视神经萎缩相关。另外，患有沃尔夫勒姆综合征的许多人还会发展为尿崩症和感音神经性听力丧失。所述综合征的旧名称是DIDMOAD，指的是尿崩症、糖尿病、视神经萎缩和耳聋。一些人在导致沃尔夫勒姆综合征的同一基因中发生突变，但其没有获得所述综合征的所有特征，因此据说其患有WFS1相关疾病。沃尔夫勒姆综合征的主要症状(糖尿病、视神经萎缩、尿崩症和听力丧失)可以在不同年龄出现并以不同速度发生变化。
弗里德赖希氏共济失调(FRDA)：遗传性进行性神经退行性运动障碍，其中典型的发作年龄介于10到15岁之间。最初的症状可以包含姿势不稳、频繁跌落和由于协调随意运动的能力受损(共济失调)而逐渐难以行走。受影响的个体通常会发展为言语不清(构音障碍)、特征性足部畸形和脊柱不规则弯曲(脊柱侧弯)。FRDA常常与心肌病相关，心肌病是一种心肌疾病，可能导致心力衰竭或心脏节律不规则(心律失常)。约三分之一患有FRDA的人会发展为糖尿病。与FRDA相关的症状和临床发现主要是由于感觉神经纤维在其进入被称为背根神经节的结构中的脊髓的点处发生退行性变化。这会导致脊髓中神经纤维的继发性退化，从而导致小脑缺乏感觉信号，小脑是大脑中有助于协调随意运动的部分。
线粒体神经胃肠型脑肌病(MNGIE)：由胸苷磷酸化酶(TP)酶缺乏引起的进行性代谢障碍。TP的缺乏导致脱氧核糖核苷胸苷(dThd)和脱氧尿苷(dUrd)的全身性积聚。在这些患者中，临床特征包含精神退化、眼肌麻痹和致命的胃肠道并发症。核苷的积聚也会导致线粒体DNA(mtDNA)脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)的不平衡，这可能在mtDNA耗竭/缺失异常中发挥直接或间接的作用，尽管确切的潜在机制仍然未知。
在另外的实施例中，所述与线粒体功能障碍相关的疾病、病症或其任何症状是与溶酶体贮积病相关的疾病、病症或任何症状。
在其它实施例中，所述溶酶体贮积病选自糖原累积病II型(庞贝氏病)、多种硫酸酯酶缺乏症(MSD)、粘多糖贮积病(MPS)、粘脂贮积病(ML)I型到III型、G(M1)-神经节苷脂累积病、法布里病、法伯病、戈谢病、尼曼-皮克病、粘脂贮积病(ML)IV型、胱氨酸病、神经元蜡样脂褐质沉积症以及其任何组合。
当提及“溶酶体贮积病(LSD)”时，应当理解为涵盖由未消化的大分子在溶酶体中逐渐积聚表征的任何疾病、病症或症状。物质的大量积聚会影响溶酶体的功能并损害自噬通量，这可能会影响如线粒体等细胞器的细胞质量控制。LSD表现出线粒体功能障碍的迹象，所述迹象包含线粒体形态变化、线粒体膜电位(ΔΨm)降低、ATP产生减少和活性氧类(ROS)产生增加。此外，自噬通量的减少可能导致线粒体功能障碍的持续存在。溶酶体贮积病的实例包含但不限于：糖原累积病II型(庞贝氏病)、多种硫酸酯酶缺乏症(MSD)、粘多糖贮积病(MPS)、粘脂贮积病(ML)I-III型、G(M1)-神经节苷脂累积病、法布里病、法伯病、戈谢病、尼曼-皮克病、粘脂贮积病(ML)IV型、胱氨酸病、神经元蜡样脂褐质沉积症。
在一些实施例中，所述与线粒体功能障碍相关的疾病、病症或其任何症状是与神经退行性疾病相关的疾病、病症或任何症状。
神经退行性疾病与神经系统的任何类型的致残疾病、病症或症状有关，由神经元亚型的相对选择性死亡表征。线粒体功能受损是这些疾病发展的关键，如线粒体动力学受损(形状、大小、裂变融合、分布、运动等)、线粒体膜电位异常、耗氧率、ROS水平。
在如帕金森氏病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化、额颞叶痴呆(FTD)、腓骨肌萎缩症(CMT)和阿尔茨海默病等神经退行性疾病中，线粒体功能受损。
在一些实施例中，所述神经退行性疾病选自帕金森氏病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化、额颞痴呆(FTD)、腓骨肌萎缩症(CMT)、阿尔茨海默病以及其任何组合。
在一些实施例中，所述与线粒体功能障碍相关的疾病、病症或其任何症状是白质消失(VWM)病。白质消失性疾病(VWM)是影响大脑的白质或髓磷脂的统称为脑白质营养不良的超过50种病状之一。VWM，也被称为伴有中枢神经系统髓鞘形成减退(CACH)的儿童共济失调，是会破坏髓鞘、大脑的白质或髓鞘的极为罕见的神经系统病状。在这样做时，VWM会永久性地影响大脑信号向身体其余部位的传输。在VWM病下鉴定的临床病状包含但不限于：伴有弥漫性CNS髓鞘形成减退(CACH)的儿童共济失调、白质消失脑白质营养不良(VWM)、克里白质脑病、白质消失脑白质营养不良伴卵巢功能衰竭，以及其任何组合。
在另外的实施例中，本发明提供了一种用于治疗有需要的受试者的与线粒体功能障碍相关的疾病、病症或其任何症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括普利多匹定或其药学上可接受的盐的组合物，其中所述线粒体功能障碍是双相障碍。
双相障碍：一种主要的精神障碍，表现出躁狂和抑郁发作，常伴有精神病症状。线粒体DNA突变和线粒体功能障碍占患有所述病症的患者的子集。
在另外的实施例中，本发明提供了一种用于治疗有需要的受试者的与线粒体功能障碍相关的疾病、病症或其任何症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括普利多匹定或其药学上可接受的盐的组合物，其中所述与线粒体功能障碍相关的疾病或病症的症状包含以下中的任何一种或多种：发育不良、肌肉协调性丧失、肌肉无力、神经功能缺损、癫痫、自闭症、自闭症谱系、自闭症样特征、学习障碍、心脏疾病、肝脏疾病、肾脏疾病、胃肠道疾病、严重便秘、糖尿病、感染风险增加、甲状腺功能障碍、肾上腺功能障碍、自主神经功能障碍、意识模糊、定向障碍、记忆丧失、生长不良、发育停滞、协调不良、感觉(视力、听力)问题、精神功能下降、器官疾病、痴呆、呼吸系统问题、低血糖症、呼吸暂停、乳酸酸中毒、癫痫发作、吞咽困难、发育迟缓、运动障碍(肌张力障碍、肌肉痉挛、震颤、舞蹈病)、中风和脑萎缩。
在一些实施例中，所述普利多匹定呈其中性/碱性形式。在其它实施例中，所述普利多匹定呈药学上可接受的盐的形式。在一些实施例中，所述普利多匹定是盐酸普利多匹定。
对于本文所公开的方法和用途，施用途径可以是例如口服。施用途径也可以通过作用是局部的(例如，局部施用)还是全身的(例如，肠内或肠胃外施用)来分类。如本文所用,“局部施用”应意指将化合物或组合物直接施用于需要其作用的部位，并且特别排除全身施用。如本文所用，化合物或组合物的“局部施用”应意指将化合物或组合物施用于身体表面，如皮肤或粘膜，如眼睛。如本文所用，“眼部施用”应意指将化合物或组合物施加于受试者的眼睛或眼睛周围的皮肤(眼周皮肤)或眼睛周围的粘膜，特别是受试者的结膜，即局部施用。本发明的一定量的普利多匹定和药物组合物可以通过口服施用、局部施用、全身施用、局部施用或眼部施用来施用。
在一些实施例中，所述普利多匹定口服施用。
在另外的实施例中，以可吸入粉末、可注射剂、液体、凝胶、固体、滴眼剂、眼药膏、胶囊或片剂的形式施用所述普利多匹定。
如本文所用，“普利多匹定”意指普利多匹定碱、其药学上可接受的盐、其衍生物、其类似物或普利多匹定和其类似物的组合。
普利多匹定衍生物的实例是富含氘的普利多匹定和盐。富含氘的普利多匹定和盐以及其制备方法的实例可以在美国申请公开第2013-0197031号、第2016-0166559号和第2016-0095847号中找到，所述美国申请公开中的每个申请公开的全部内容通过引用并入本文。
“富含氘”意指化合物的任何相关位点处的氘的丰度大于所述位点处天然存在的一定量的化合物中的氘的丰度。氘的天然存在分布为约0.0156％。因此，在“富含氘”的化合物中，氘相关位点中的任何相关位点处的氘的丰度都超过0.0156％，并且可以在超过0.0156％到100％的范围内。可以通过将氢与氘交换或用富含氘的起始材料合成所述化合物来获得富含氘的化合物。
本发明还包含普利多匹定的任何盐，包含任何药学上可接受的盐，其中普利多匹定具有净电荷(正电荷或负电荷)并且向其添加至少一个抗衡离子(具有抗衡负电荷或正电荷)以形成所述盐。如本文所用，短语“药学上可接受的盐”意指本发明的化合物的对于哺乳动物的药学用途是安全且有效的并且具有期望的生物活性的那些盐。药学上可接受的盐包含本发明的化合物中存在的酸性或碱性基团的盐。药学上可接受的酸加成盐包含但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即，1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。本发明的某些化合物可以与各种氨基酸形成药学上可接受的盐。合适的碱盐包含但不限于铝盐、钙盐、锂盐、镁盐、钾盐、钠盐、锌盐和二乙醇胺盐。关于药学上可接受的盐的综述参见BERGE等人,66《药物科学杂志(J.PHARM.SCI.)》1-19(1977)，所述文献通过引用并入本文。在另一个实施例中，本发明的普利多匹定盐是盐酸盐。
在一些实施例中，本发明的方法利用普利多匹定或其药学上可接受的盐与其类似物或其药学上可接受的盐中的一种或多种类似物或药学上可接受的盐的组合。
在一个实施例中，普利多匹定的类似物由以下结构表示：
在其它实施例中，本发明的方法利用普利多匹定或其药学上可接受的盐和化合物(1)的类似物或其药学上可接受的盐的组合。
在其它实施例中，本发明的方法利用普利多匹定或其药学上可接受的盐、化合物(1)的类似物和化合物(4)的类似物或其药学上可接受的盐的组合。
因此，本发明还涉及药物组合物，其包括本发明的与药学上可接受的助剂和任选地其它治疗剂混合的药剂。在与组合物的其它成分相容并且对其接受者无害的意义上来讲，助剂必须是“可接受的”。
药物组合物包含适合于口服、直肠、鼻、局部(包含透皮、口腔和舌下)、阴道或肠胃外(包含皮下、肌内、静脉内和皮内)施用或通过植入物施用的那些药物组合物。组合物可以通过药学领域公知的任何方法制备。
药物组合物包含适合于口服、直肠、鼻、局部(包含透皮、口腔和舌下)、阴道或肠胃外(包含皮下、肌内、静脉内和皮内)施用或通过植入物施用的那些药物组合物。组合物可以通过药学领域公知的任何方法制备。
此类方法包含将用于本发明的缔合化合物或其组合与任何助剂引入的步骤。助剂，也被称为辅助成分，包含本领域常规的那些，如载体、填充剂、粘合剂、稀释剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、调味剂、抗氧化剂和润湿剂。
适合于口服施用的药物组合物可以作为离散的剂量单位如丸剂、片剂、糖衣丸或胶囊，或者作为粉末或颗粒，或者作为溶液或悬浮液呈现。活性成分还可以以团注或糊剂的形式呈现。组合物可以进一步加工成栓剂或灌肠剂用于直肠施用。
本发明进一步包含与包装材料组合的如上文所描述的药物组合物，包含用于上文所描述的用途的组合物的使用说明。
对于肠胃外施用，合适的组合物包含水性和非水性无菌注射剂。所述组合物可以在单位剂量或多剂量容器中呈现，例如密封的小瓶和安瓿瓶，并且可以在仅需要在使用前添加无菌液体载体(例如水)的冷冻干燥(冻干)条件下储存。对于透皮施用，可以考虑例如凝胶、贴剂或喷雾剂。适合于肺部施用的组合物或调配物例如通过鼻吸入包含细粉尘或薄雾，其可以通过计量剂量加压气雾剂、喷雾器或吹入器产生。
组合物的施用的确切剂量和方案将必然取决于要达到的治疗或营养作用，并且可以随配方、施用途径以及组合物要向其施用的个体受试者的年龄和病状而变化。
如本文所用，术语“治疗”是指施用治疗量的本发明组合物，其可有效改善不期望的疾病、病症，包含与疾病或病症相关的症状，以预防此类疾病、病症的表现，包含与疾病或病症发生前相关的症状，以减缓疾病的进展，减缓症状的恶化，促进缓解期的开始，减缓在疾病的进行性慢性阶段造成的不可逆损害，延迟所述进行性阶段的发作，减轻严重性或治愈疾病，提高存活率或更快速恢复，或预防疾病形式的发生或上述中的两种或多种的组合。用于本文所公开目的的“有效量”由本领域已知的此类考虑因素确定。所述量必须能有效实现如上文所描述的期望的治疗作用，尤其取决于要治疗的疾病的类型和严重性以及治疗方案。在一些实施例中，包括普利多匹定或其药学上可接受的盐的组合物介于1与400mg之间，每天，每天两次，每天三次或每天少于一次。通常众所周知，有效量取决于多种因素，包含配体对受体的亲和力、其在体内的分布轮廓、多种药理学参数如体内半衰期、不期望的副作用，如果有的话，关于年龄和性别等因素。
在一些实施例中，普利多匹定以介于1mg/天与400mg/天之间的日剂量施用。在一些实施例中，普利多匹定以介于1mg/天与300mg/天之间的日剂量施用。在其它实施例中，普利多匹定以介于1mg/天与90mg/天之间的日剂量施用。在其它实施例中，普利多匹定以介于20mg/天与90mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于45mg/天与90mg/天之间的日剂量施用。在其它实施例中，普利多匹定以介于20mg/天与50mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于1mg/天与10mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于10mg/天与20mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于20mg/天与30mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于30mg/天与40mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于40mg/天与50mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于50mg/天与60mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于60mg/天与70mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于70mg/天与80mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于80mg/天与90mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于90mg/天与100mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于100mg/天与150mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于150mg/天与200mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于200mg/天与250mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于250mg/天与300mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于300mg/天与350mg/天之间的日剂量施用。在另外的实施例中，普利多匹定以介于350mg/天与400mg/天之间的日剂量施用。
实验部分
材料与方法
将半合子YAC128(Y128)[系HD53；mHTT高表达子]的集落和具有FVB/N背景的WT小鼠在受控温度(22-23℃)条件和12小时光照/12小时黑暗循环下圈养。可随意获得食物和水。所有小鼠实验均根据机构动物护理和使用委员会的指导方针和欧洲共同体指令(2010/63/EU)以及当地动物护理委员会批准的协议进行。进行所有的努力都是为了最小化动物的痛苦并减少所使用的动物数量。
原代神经元培养物：原代皮质、纹状体和皮质-纹状体共培养物是由野生型(WT)小鼠(用作对照)或半合子Y128小鼠[系HD53]雄性与来自相同基因背景的WT雌性(FVB/N)之间的杂交后代产生的。在妊娠的第E15.5天-第16.5天收集定时怀孕雌性的胚胎。对于皮质-纹状体共培养物，对皮质和纹状体进行显微解剖，然后切块并合并每个基因型。然后将组织解离并研磨。将细胞接种在富集的neurobasal培养基中的聚-D-赖氨酸涂覆的板上。每五天用1/3新鲜培养基喂养细胞。
为了获得纯皮质和纹状体神经元，对组织进行显微解剖和机械消化。神经元在富集的Neurobasal培养基中培养，并且以130×103个细胞/cm2(高密度)或85×103(低密度)的密度铺板在聚-D-赖氨酸(0.1mg/ml)涂覆的板上。培养物在95/5％空气/CO2培养箱中保持在37℃。在体外第3天(DIV3)，添加5μM 5-氟-2'-脱氧尿苷(5-FdU)以减少分裂的非神经元细胞。在DIV7处添加新鲜培养基，并且在DIV12处使用细胞。
神经元转染：纹状体神经元用pDsRed2-Mito载体在8DIV处使用磷酸钙沉淀方法进行转染。然后将经转染的神经元用neurobasal培养基洗涤，并转移回其含有条件培养基的原始培养皿中，直至DIV12。
淋巴母细胞培养和转染：来自从科里尔研究所(Coriell Institute)获得的健康对照(GM02174)和HD患者(NA04724)的淋巴母细胞在补充的RPMI培养基中生长。淋巴母细胞每5-6天以1:3传代。
人神经干细胞培养：神经干细胞(NSC)是从杂合的人诱导多能干细胞(iPSC)HD4-iPSC(具有正常(19个CAG重复)和扩增的等位基因(72个CAG重复))和对照AMS4-iPSC分化的。IPSC保持在(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Sci.)，目录号：A1413202)涂覆的6孔板中，直到其达到90％汇合，此时应用神经诱导方案。神经分化基于SB431542(左撇子/激活素/转化生长因子β-TGFβ抑制剂)、多沙芬(dorsomorphin)(骨形态发生蛋白-BMP抑制剂)和XAV-939(β-连环蛋白转录抑制剂和轴蛋白稳定剂)的双重SMAD抑制。神经诱导发生在第0天与第12天到第15天之间。从第0天到第5天，将细胞维持在不含FGF2的iPSC培养基中，并与5μM多沙芬和10μM SB431542一起温育。每隔一天更换一次培养基。从第5天到第12天，培养基逐渐被N2培养基百分比增加的培养基替代。在第12天和第15天之间，充满玫瑰花结的区域在形态上变得清晰可见。为了分化，将细胞重新接种在涂覆的12孔板中。在每个分化过程时通过免疫细胞化学证实了神经谱系标记蛋白巢蛋白和SOX2的表达。
普利多匹定温育：除非另有说明，否则在所有所使用的细胞模型中都进行了普利多匹定温育，持续24小时。图和图例中描述了最终浓度。
线粒体网络和ER共定位：将皮质-纹状体共培养物用Mitotracker深红FM(Mitotracker Deep Red FM)染料标记，持续30分钟。在室温下用冰冷的甲醇固定持续15分钟之前洗涤经染色的细胞。
MitoDsRed转染的纹状体神经元用4％多聚甲醛固定、透化并封闭，然后与IP3R3抗体(1:1000，默克密理博(EMD Millipore)，目录号AB9076)一起温育。对于细胞核检测，神经元与Hoechst 33342一起温育，并且然后安装。
使用具有LSM 710软件的蔡司共聚焦显微镜的63倍镜头获得呈沿z轴分开0.46μm的堆叠的形式的共聚焦图像。FIJI软件用于图像分析。Z堆叠图像针对背景进行了标准化，使用Find Foci鉴定了表示线粒体特异性荧光的峰值强度区域(Herbert、Alex D.、AntonyM.Carr和Eva Hoffmann.2014.“FindFoci：一种与人工分配紧密匹配，减少人工不一致并提高分析速度的具有自动参数训练的焦点检测算法(FindFoci:A Focus DetectionAlgorithm with Automated Parameter Training That Closely Matches HumanAssignments,Reduces Human Inconsistencies and Increases Speed of Analysis.)”由Michael Lichten编辑.《美国科学公共图书馆·综合(PLoS ONE)》9(12))，并且通过滤波器应用得到最佳解决。使用分析颗粒追踪线粒体轮廓。纵横比(线粒体的长轴与短轴之间的比率)用作线粒体长度的指标。对于IP3R3荧光，阈值的设置与上文所描述的类似，并在所关注的线粒体区域(ROI)内计算积分密度，以获得与线粒体的ER共定位。
线粒体运动分析：将MitoDsRed转染的纹状体神经元洗涤并在Na+培养基中温养，并在37℃下进行线粒体运动研究。使用旋转圆盘蔡司倒置共聚焦的63倍物镜对神经元投影每5秒成像一次，总共145帧。使用斐济的Kymograph Macro进行线粒体运动分析。ROI使用分割线指定，遵循跨投影的线粒体轨迹。在x-y维度(距离对时间)中产生的波形记录器用于获得斜率以计算线粒体速度。
海马氧气呼吸测量法：使用海马XFe-24/96通量分析仪(海马生物科学公司(Seahorse Bioscience))测量WT和半合子Y128皮质/纹状体共培养物和NSC中的耗氧率(OCR)。在海马XF96 V3细胞培养微孔板中以20,000个细胞/孔的密度培养皮质-纹状体原代神经元。NSC以30,000个细胞/孔接种到涂覆有的XF24细胞培养微孔板上，并且允许在37℃下粘附持续24小时。当在曲线图中所指示时，在实验前24小时添加普利多匹定(0.1、1和/或5μM)。传感器盒板与浸入式传感器一起在37℃下的非CO2培养箱中温育约16小时。在顺序注射线粒体复合物V抑制剂寡霉素(1mM)、质子载体FCCP(碳酰氰-4-(三氟甲氧基)苯腙，氧化磷酸化解偶联剂)(神经元0.5mM，NSC 0.3mM)和抗霉素A(神经元0.5mM，NSC 1μM)加鱼藤酮(神经元0.5μM和NSC 1μM)以完全抑制线粒体呼吸之前，对OCR的三个基线测量进行采样。因此，通过海马软件自动计算和记录线粒体基础呼吸、最大呼吸和ATP产生。数据针对蛋白质水平进行标准化。
线粒体膜电位：在淬灭条件下使用带正电的荧光探针四甲基罗丹明甲酯(TMRM+)在皮质和纹状体神经元中评估线粒体膜电位(MMP，Δψm)，并在用寡霉素加线粒体呼吸解偶联剂FCCP进行线粒体去极化后评估其在线粒体中的积聚。在皮质/纹状体共培养物和淋巴母细胞中，MMP使用等效探针(四甲基罗丹明乙酯(TMRE+)荧光探针)进行评估，其在线粒体中的积聚直接通过流式细胞术评估。当指示时，先前用普利多匹定(0.1和1μM；24小时)处理的皮质和纹状体神经元与150nM TMRM(淬灭条件)在Na+培养基中在37℃下温育30分钟。在这些条件下，研究了线粒体对TMRM的保留，以估计MMP/Δψ的变化。记录基础荧光(503nm激发和525nm发射)，持续4分钟，然后添加2.5μM FCCP和2.5μg/mL寡霉素以实现最大程度的线粒体去极化和线粒体探针释放。根据加入寡霉素/FCCP之前和之后，基于荧光的差异来计算TMRM释放。
原代神经元或淋巴母细胞在6孔板上培养。根据实验条件用/不用普利多匹定和过氧化氢(H2O2)预处理细胞，然后用25nM TMRE甲酯在37℃下温育15分钟。TMRE温育后，收集细胞用于FACS分析。
线粒体H2O2水平的测量：皮质和纹状体神经元用普利多匹定(0.1和1μM)预处理持续24小时，并且与线粒体过氧黄1(MitoPY1)探针(8μM)在Na+培养基中在37℃下温育30分钟。MitoPY1被洗掉，并且使用具有Zen Black 2012软件的蔡司倒置共聚焦旋转圆盘显微镜的63倍镜头对相同实验培养基中的神经元每1分钟成像一次，持续30分钟。通过503nm激发和528nm增强发射记录荧光(Dickinson、Bryan C、Vivian S Lin和Christopher JChang.2013.“MitoPY1的制备和用于活细胞线粒体中过氧化氢的成像(Preparation andUse of MitoPY1 for Imaging Hydrogen Peroxide in Mitochondria of Live Cells.)”《自然实验手册(Nature Protocols)》8(6))。基础读数10分钟后，用抗霉素A(2μM)刺激神经元。通过将细胞与MitoTracker深红(300nM)共温育证实了线粒体中的特异性MitoPY1荧光。在斐济使用时间序列分析仪插件(v 3.0)分析每个时间点的荧光强度。
NSC以30,000个/孔铺板在涂覆有的96孔测定板中，在37℃下持续24小时。之后，将NSC与1μM普利多匹定再温育24小时。在获取之前，洗涤细胞并在37℃和5％CO2下用10μM MitoPY1温育20分钟。测量MitoPY1荧光的基础水平持续10-15分钟，然后暴露于粘噻唑(3μM线粒体复合物III抑制剂)并测量持续另外30分钟。结果计算为每30,000个细胞的相对荧光单位(RFU)。在分离的线粒体中，通过将5μg分离的线粒体重新悬浮在含有辣根过氧化物酶(0.5单位/mL)的Amplex红试剂中，并在570nm激发和585nm发射下测量荧光来测量H2O2水平。基础读数10分钟后，用抗霉素A(2μM)激发线粒体并再测量另外10分钟。结果被分析为荧光的时间依赖性变化。
活性氧类(ROS)测定：与PDL涂覆的板附连的原代神经元和淋巴母细胞用H2O2(0-1mM)处理至多6小时。在完全培养基中用5μM CellRox红试剂处理细胞，然后温育30分钟。洗涤后，氧化应激通过在蔡司倒置显微镜上使用40倍物镜对所有样品使用相同的曝光设置进行成像来测量。对八个随机场进行采样，并使用ImageJ软件测量荧光强度。
体内研究设计：1.5个月大的WT和半合子Y128小鼠(等比例的雄性和雌性)被分为四组。小鼠在连续45天内通过口服强饲法接受普利多匹定(30mg/kg，100μL/25g)或等体积的无菌水，直至4个月大。在富含玉米壳筑巢材料和纸卷的笼中圈养小鼠，每笼中4只动物，每个笼子表示一个单独的实验，每组总共9只动物。每周给动物称重并相应地调整处理体积。在处理前即刻和处理结束前一天在转棒中对小鼠进行行为测试。测试是在白天的固定时间盲目进行的。最后一次强饲法后24小时，处死小鼠，并从纹状体中分离线粒体。
转棒分析：运动学习和协调，并在旋转设备上进行评估。在此测试中，小鼠必须学习在被放置在恒定旋转棒上时奔跑，以防止其跌落。一旦学习了任务，加速转棒可以用于评估运动协调和平衡。允许小鼠适应行为室2小时。针对所有受试者的程序一致并且测试都是在最低噪音水平下进行的。训练由每天四条轨迹(每条轨迹120秒)组成，间隔1小时，固定速度为14rpm。测试阶段在第二天在4到40rpm的加速转棒中在5分钟内进行，由3次试验组成，间隔2小时。转棒得分是3次试验的平均值。对基因型和处理进行盲实验。训练后测量运动协调得分，并在5分钟内以5到40rpm的加速转棒对跌落延迟时间进行定量。
功能线粒体的分离：从在线粒体分离缓冲液中所洗涤的小鼠大脑中解剖纹状体。在匀浆后使用不连续的珀可密度梯度离心分离纹状体线粒体。分离的线粒体的蛋白质含量通过Bio-Rad测定进行定量。
线粒体复合物活性：通过使用海马XF方法(安捷伦(Agilent))测量耗氧率(OCR)来评估复合物活性。将在线粒体测定溶液中稀释的5μg分离线粒体接种在450μL的聚(乙烯亚胺)涂覆的XF24海马板中，并且允许板在37℃的无CO2加湿培养箱中平衡10-12分钟。在顺序注射鱼藤酮(2μM；复合物I抑制剂)、琥珀酸盐(10mM；复合物II底物)、抗霉素A(4μM；复合物III抑制剂)和抗坏血酸盐/TMPD(10mM/100μM；细胞色素C/复合物IV的电子供体)后，通过OCR测量评估通过电子传输链的顺序电子流。
线粒体钙调控：使用钙(Ca2+)敏感探针Calcium Green-5N测量分离线粒体对Ca2+的摄取。简言之，将5μg线粒体与1μM寡霉素和150nM Calcium Green-5N一起温育，并且在荧光分光光度计酶标仪中测量荧光(激发506nm，发射523nm)。在2分钟的基线后，以4分钟的间隔向线粒体添加10μM CaCl2的脉冲。线粒体Ca2+调控通过CaCl2脉冲后的曲线下面积计算，这表明线粒体吸收的线粒体外Ca2+的量。
ER应激测量：可以使用H2a-GFP作为ER应激早期阶段的蛋白质指标来测量ER应激水平。H2a-GFP是响应于ER应激而积聚的错误折叠的分泌蛋白。STHdhQ7/7是来自含有具有7个多聚谷氨酰胺重复的纯合人源化亨廷顿基因(HTT)的敲入转基因小鼠(野生型)的纹状体衍生的细胞系。STHdhQ7/7细胞用Htt96Q-mCherry(突变体模拟HD患者中Htt的典型致病性表达)构建体或Htt20Q-mCherry(WT)构建体进行转染。当与荧光mCherry蛋白融合的polyQ扩展的Htt蛋白(96Q)外显子1表达时，可以使用荧光显微镜监测单独细胞中蛋白质的水平和聚集。
细胞裂解和免疫印迹：对细胞进行裂解并将磷酸酶抑制剂混合物2和3以及10mMβ-甘油磷酸添加到裂解缓冲液中以抑制磷酸酶以检测磷酸化蛋白质。在SDS-PAGE和转移到硝酸纤维素膜后，膜被封闭并在4℃下用第一抗体进行免疫印迹过夜，然后用第二抗体洗涤并进行印迹。洗涤后，进行增强型化学发光测定，并且暴露膜并进行定量。
统计分析：结果表示为图例中所指示的独立实验或动物的数量的平均值±SEM(平均值的标准误差)。使用克鲁斯卡尔-沃利斯测试通过非参数单向方差分析(ANOVA)进行多个组之间的比较。多重比较的校正通过双向ANOVA和Tukey事后测试完成。两组之间的比较通过非参数曼-惠特尼测试或参数学生t测试进行。进行F测试以分析交互项。在p<0.05处接受显著性。所有分析均使用Prism软件(GraphPad8.0版)进行。使用从Y128 HD小鼠胚胎、人HD淋巴母细胞和神经干细胞(NSC)中分离的原代神经元在体外评估线粒体参数。从用普利多匹定或媒剂处理的Y128小鼠中分离的纹状体线粒体用作离体模型。
结果—
通过研究形态和运输可以获取对线粒体功能的见解。由于线粒体质量控制需要裂变和融合事件，因此滋养突触末梢高能量需求所必需的线粒体纵横比(相当于线粒体的椭圆长轴与短轴之间的比率)和线粒体运输均是线粒体功能的度量。从HD模型YAC128(Y128)和野生型(WT)小鼠采集的皮质纹状体原代神经元用MitoTracker(图1A)和线粒体数量(图1B)和形态(图1C和1D)进行染色评估。HD神经元显示线粒体形态受损：观察到与年龄匹配的野生型神经元相比，圆形线粒体数量显著增加(图1C)和细长线粒体减少(p<0.05)(图1D)。在这些条件下，尽管线粒体质量没有变化(图1B)，但有利于线粒体断裂(裂变)，表明线粒体功能下降。普利多匹定(1μM)处理挽救了圆形和细长线粒体两者的数量(p<0.05)。
在用mitoDsRed(线粒体侧)转染并用抗IP3R(ER侧)抗体染色的纹状体神经元中观察到，与WT相比，Y128 HD神经元中线粒体与ER的用于使两个细胞群可视化的共定位不良(图1E)。普利多匹定(1μM)在Y128纹状体神经元中高度增加线粒体-ER共定位(图1E和1F，p<0.001)。此结果可以解释ATP生产以及线粒体运输和速度增加(在图2A-2B中观察到)。来自Y128纹状体神经元的MitoDsRed标记的线粒体也显示纵横比降低(p<0.05)(图1G)，由此证实了先前的结果(图1A-D)。用普利多匹定(1μM)处理减少了片段化线粒体的数量(p<0.05)(图1E、1G)。
HD神经元中的线粒体顺行运输也大大减少，其中Y128纹状体神经元中大约90％的线粒体出现静止(p<0.05)。普利多匹定减少静止线粒体的百分比，增加顺行和逆行运输两者(p<0.05)。(图2A、2B—定量)。与野生型神经元相比，Y128神经元的线粒体运输速度也降低了，在一半速度下移动(p<0.05)。在普利多匹定处理(1μM)后，这种降低被改善(p<0.05)(图2A、2C)。
Y128神经元显示基础和最大呼吸减少以及ATP产生受损(图3A-3H)。呼吸减少可能是HD神经元中证明的线粒体动力学和形态受损的结果(图1A-1G和2A-2B)。用1μM和5μM剂量下的普利多匹定处理挽救了HD Y128皮质纹状体神经元中的基础和最大呼吸(p<0.01)，以及ATP产生(p<0.05)(图3B(基础)、3C(最大)3D(ATP产生))。普利多匹定1μM还增加了基础(p<0.001)和最大(p<0.05)线粒体呼吸，以及来自杂合HD患者(HD-iPSC)的人iPSC衍生神经干细胞(NSC)的ATP产生(图3E、3F(基础)、3G(最大)、3H(ATP产生))。
线粒体膜电位(MMP,ΔΨm)直接影响ATP产生，并且受线粒体Ca2+信号传导影响。与野生型皮质神经元相比，Y128皮质和纹状体神经元表现出较低的ΔΨm，这是由于寡霉素和FCCP诱导的线粒体功能障碍(p<0.05)，这表明TMRM的线粒体保留较低(图4A、4B)。普利多匹定(0.1和1μM)增加了Y128皮质和纹状体神经元中的ΔΨm(皮质神经元p<0.05；纹状体神经元中0.1μM普利多匹定p<0.05，1μM普利多匹定p<0.01)(图4A-4C)。
过氧化氢(H2O2)被用作更有效的氧化刺激来评估ΔΨm。响应于0.1mM H2O2处理，在Y128神经元中观察到ΔΨm明显降低(p<0.0001)。用普利多匹定(5μM)处理，并且然后暴露于0.1mM H2O2持续6小时的Y128皮质/纹状体神经元显示由H2O2诱导的ΔΨm损失完全恢复(p<0.001)(图4D)，以及恢复的细胞活力(p<0.01)(图4E)。在源自HD患者的淋巴母细胞中，0.1mM H2O2处理导致ΔΨm降低50％。在0.1mM H2O2处理后，普利多匹定剂量1μM普利多匹定、5μM普利多匹定和10μM普利多匹定全都增加了ΔΨm，其中5μM剂量显示出最大保护作用(p<0.01)(图4F)。
来自Y128神经元和HD淋巴母细胞的线粒体对H2O2的更高敏感性表明这些细胞表现出增加的氧化应激。为了测试这一点，用荧光探针MitoPY1测量了局部H2O2通量。诱导活性氧类(ROS)的产生的复合物III抑制剂抗霉素A(AntA)刺激了皮层(p<0.01)和纹状体(p＝0.0001)Y128神经元的线粒体功能障碍，以显示与WT神经元相比，线粒体驱动的H2O2水平显著增加2倍。在皮质神经元和纹状体神经元两者中，1μM普利多匹定逆转了AntA引起的mito-H2O2水平增加(皮质神经元中，p<0.0001，在纹状体神经元中，对于0.1μM，p<0.01，对于1μM，p<0.0001)(图5A-5C)。
在用另一种线粒体复合物III抑制剂粘噻唑(Myxo，3μM)处理的HD-NSC中，细胞显示mito-H2O2水平大大增加(p<0.0001)。普利多匹定(1μM)挽救了由复合物III抑制引起的H2O2水平的异常增加(p<0.01)(图5D)。在基础条件下，当与对照淋巴母细胞相比时，HD淋巴母细胞显示ROS产生增加；当用H2O2激发时，普利多匹定处理降低了基础条件和H2O2激发条件两者下的ROS水平(p<0.001)(图5E)。因此，普利多匹定降低了三种HD细胞模型中的ROS水平。
普利多匹定的神经保护作用在体内重现。1.5个月龄的WT和Y128小鼠(症状前，雄性和雌性比例相等)在连续45天内用普利多匹定30mg/kg或水处理。Y128小鼠在3个月大时在转棒性能测试中表现出运动缺陷，因此在处理之前和之后应用此测试以测试普利多匹定在运动水平上的功效。在1.5个月(预处理)时，Y128小鼠表现出与野生型小鼠相同的运动协调性(图6A、6B)。在3个月大时，与经媒剂处理的野生型小鼠相比，经媒剂处理的Y128小鼠表现出运动缺陷，如在加速转棒测试期间跌落延迟时间减少所观察到的(p<0.05)(图6C)。相反，与经媒剂处理的HD小鼠相比，用普利多匹定处理的HD小鼠在加速转棒中表现出显著的运动性能改善(p<0.05)(图6C)。行为分析后，从所有小鼠组的纹状体中分离出功能性线粒体，并且通过在连续注射分别诱导线粒体复合物I、II、III和IV的个体刺激或抑制的鱼藤酮、琥珀酸盐、抗霉素A和抗坏血酸盐/TMPD(N,N,N′,N′-四甲基对苯二胺)之后测量OCR，通过评估通过电子运输链的顺序电子流来评估线粒体复合物的活性，由此允许计算其活性(图6D)。与经媒剂处理的野生型小鼠相比，来自经媒剂处理的Y128小鼠的纹状体线粒体显示出复合物I、II、III和IV的更高的活性(p<0.01)，表明存在早期补偿机制(图6D、6F)。有趣的是，在用AntA抑制复合物III之前和之后，Y128 HD小鼠纹状体中复合物活性的增加伴随着线粒体H2O2产生的增加(p<0.05)(图6D、6G)。这些结果表明，异常复合物活性可能是通过增加电子泄漏导致线粒体ROS产生的基础，从而导致ATP产生受损。Y128小鼠体内普利多匹定处理使线粒体复合物活性标准化，将H2O2水平标准化为WT媒剂处理小鼠的水平(p<0.05)(图6I-6K)并增加线粒体Ca2+缓冲能力(图6L、6M)。
线粒体和内质网(ER)在功能上和物理上两者都有联系。线粒体与ER之间的物理接触发生在线粒体相关膜(MAM)的位点处，这是富含S1R的高度特化结构。MAM充当蛋白质、脂质、信号传导分子以及重要的是Ca2+交换的管道。因此，ER应激和线粒体功能障碍密切相关(Morris、Gerwyn、Basant K.Puri、Ken Walder、Michael Berk、Brendon Stubbs、MichaelMaes和AndréF.Carvalho.“神经进行性疾病中的内质网应激应答：新兴的病理生理作用和转化意义(The Endoplasmic Reticulum Stress Response in NeuroprogressiveDiseases:Emerging Pathophysiological Role and Translational Implications.)”《分子神经生物学(Molecular Neurobiology)》,(2018)55:8765-8787)。
普利多匹定降低mHtt诱导的ER应激：在用突变Htt96Q-mCherry(扩展的)构建体转染的STHdhQ7/7细胞中，可以观察到可见的Htt96Q-mCherry聚集体(通常每细胞一个大聚集体)连同指示ER应激的高水平的积聚的H2a-GFP。表达Htt20Q-mCherry(正常)或Htt96Q-mCherry而没有可见聚集体的STHdhQ7/7细胞显示出低水平的H2a-GFP(无ER应激)。普利多匹定以剂量依赖性方式显著减少mHtt聚集体阳性细胞中的H2a-GFP积聚(图7A)，并且不改变没有聚集体的细胞或表达Htt20Q-mCherry的细胞中的H2a-GFP水平(图7B)。因此，普利多匹定以剂量依赖性方式减少Htt诱导的ER应激。
eIF2α的磷酸化是ER应激的标志。表达Htt96Q-mCherry的STHdhQ7/7细胞中的eIF2α-磷酸化(eIF2α-p)水平为表达Htt20Q-mCherry的细胞中的eIF2α-p水平的3.5倍。普利多匹定处理导致eIF2α-P显著降低(通过eIF2α-P与总eIF2α的比率测量)，表明细胞ER应激降低(图8)。
综上所述，临床前结果表明，在体外和体内/离体HD模型中，线粒体功能障碍是HD的标志，排除了针对氧化刺激的有效抗氧化应答。这种功能障碍可能会影响突触完整性和细胞存活率。普利多匹定证明了HD模型中线粒体功能的不同方面的拯救，包含HD人和小鼠模型中ROS水平的降低和线粒体速度的增加以及细长线粒体的百分比，所有这些都表明线粒体功能障碍。因此，普利多匹定可有效修复线粒体功能障碍。普利多匹定的施用还延迟了Y128小鼠首次运动症状的出现，增加了细胞活力并挽救了受损的氧化磷酸化。另外地，在体外HD模型系统中，普利多匹定减轻了与线粒体功能障碍密切相关的ER应激，因为S1R定位于ER膜的MAM(线粒体相关膜)位点。这些高度特化位点在线粒体功能中具有关键作用，包含线粒体裂变、Ca2+穿梭和氧化应激。