铁死亡抑制剂Liproxstatin-1在制备减轻肾纤维化药物中的应用
阅读说明：本技术 铁死亡抑制剂Liproxstatin-1在制备减轻肾纤维化药物中的应用 (Application of iron death inhibitor Liproxstatin-1 in preparation of medicine for relieving renal fibrosis ) 是由 张波 周艳 陈湘 何垚 陈志� 李冰晟 甘宇 于 2021-09-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种铁死亡抑制剂Liproxstatin-1在制备治疗肾间质纤维化药物中的应用,属于生物医药技术领域。本发明系统阐明了小鼠单侧输尿管结扎所致的肾纤维模型中铁沉积的发生及铁死亡相关蛋白的表达；同时采用铁死亡抑制剂Liproxstatin-1腹腔给药,证明了Liproxstatin-1可以抑制肾小管上皮细胞铁死亡,从而抑制促纤维化因子TGF-β1、CTGF和PDGF的分泌及肌成纤维细胞的活化,最终减轻小鼠肾纤维化程度,为治疗肾纤维化提供潜在药物和新思路。(The invention discloses an application of an iron death inhibitor Liproxstatin-1 in preparing a medicament for treating renal interstitial fibrosis, belonging to the technical field of biological medicines. The system of the invention clarifies the generation of iron deposition and the expression of iron death related protein in a renal fiber model caused by unilateral ureteral ligation of a mouse; meanwhile, an iron death inhibitor, namely Liproxstatin-1, is administered in the abdominal cavity, so that the fact that Liproxstatin-1 can inhibit the iron death of renal tubular epithelial cells is proved, the secretion of fibrosis promoting factors TGF-beta 1, CTGF and PDGF and the activation of myofibroblasts are inhibited, the renal fibrosis degree of a mouse is finally relieved, and a potential medicament and a new idea are provided for treating renal fibrosis.)
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种铁死亡抑制剂Liproxstatin-1在制备减轻肾纤维化药物中的应用。
背景技术
肾纤维化是各种慢性肾脏病(CKD)进展到终末期的共同途径和主要病理过程，其特征是正常肾脏结构破坏，成纤维细胞增生，细胞外基质的过度沉积。肾纤维化可由一系列复杂的病因引起，如梗阻、炎症、免疫、代谢或其他全身性疾病。目前尚无有效的方法来减缓慢性肾病中肾功能的进行性损害或完全延缓肾纤维化的进展，终末期肾病患者的治疗选择仅限于透析和肾移植。尽管近年来对肾纤维化的发病机制的研究取得系列进展，但使用各种抗肾纤维化药物也未能有效改善其不良预后，临床上可用于抑制肾纤维化的药物非常少。因此，深入研究肾纤维化发生的细胞分子机制，探讨新的抗肾纤维化治疗途径是目前肾纤维化防治研究的活跃领域。
铁死亡(ferroptosis)是2012年由Dixon首次发现的一种程序性细胞死亡新形式，其主要特征为细胞死亡过程中伴随着铁离子依赖性的大量脂质过氧化物累积。铁死亡在细胞形态学、遗传学以及生物化学等方面与细胞凋亡，坏死和自噬等细胞死亡方式有明显的不同。细胞内铁过载、谷胱甘肽(glutathione,GSH)的耗竭以及脂质过氧化是引起铁死亡的三个关键因素。当细胞抗氧化能力降低，脂质活性氧堆积，就能引起细胞氧化性死亡，即铁死亡。虽然目前对铁死亡的形态学、生物学、机制通路有了部分了解，但是对整个“铁死亡”相关信号通路分子的研究仍然处于初期阶段，还有许多尚未被开发的蛮荒领域。近年来研究发现铁死亡在癌症、器官缺血再灌注损伤和神经退行性疾病等病理生理学过程中发挥着非常重要的作用。有研究表明铁死亡是急性肾损伤时肾小管上皮细胞重要的死亡方式，但慢性肾纤维化过程中是否发生铁死亡及肾小管上皮细胞的铁死亡在慢性肾纤维化中的作用尚未见报道。揭示肾小管上皮细胞铁死亡在肾纤维化发生中的作用及机理，将为肾纤维化防治的研究提供新的途径和治疗靶点。Liproxstatin-1(Lip-1)是一种有效的铁死亡抑制剂，可以阻断脂质过氧化作用，从而抑制与铁死亡相关的缺氧损伤。近年来，Liproxstatin-1由于表现出多种药理活性而受到研究人员的关注。现有研究表明：Liproxstatin-1可以通过降低电压依赖性阴离子选择性通道1水平和恢复GPX4水平来保护小鼠心肌免受缺血/再灌注损伤；Liproxstatin-1通过抑制脊髓细胞铁死亡减弱吗啡耐受；Liproxstatin-1可抑制RSL3诱导的人肾近端肾小管上皮细胞死亡和GPX4缺失诱导的急性肾功能衰竭。因此，Liproxstatin-1是一种有效的铁死亡抑制剂，但至今为止，铁死亡在肾纤维化中的作用及机制还不清楚，尚无Liproxstatin-1在肾纤维化治疗方面的报道。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出了一种铁死亡抑制剂Liproxstatin-1在制备减轻肾纤维化药物中的应用，其目的是提供一种为肾纤维化防治的研究提供新的途径和治疗靶点，采用以下技术方案：铁死亡抑制剂Liproxstatin-1在制备减轻肾纤维化药物中的应用。
作为优选，所述应用为抑制肾小管上皮细胞铁死亡。
作为优选，所述应用为抑制促纤维化因子TGF-β1、CTGF和PDGF的分泌。
作为优选，所述应用为抑制肌成纤维细胞的活化。
作为优选，所述应用能够预防肾功能的损害，保护肾脏。
作为优选，所述减轻肾纤维化药物的剂型为注射剂。
作为优选，所述减轻肾纤维化药物的使用方式为腹腔注射给药。
本发明的有益效果：
本发明通过大量研究发现肾小管上皮细胞铁死亡是导致肾纤维化的重要因素，而铁死亡抑制剂Liproxstatin-1可以较好抑制肾小管上皮细胞铁死亡，并发现了通过抑制肾小管上皮细胞铁死亡可以进一步抑制促纤维化因子TGF-β1、CTGF和PDGF的分泌，同时还可以抑制肌成纤维细胞的活化，具体揭示了肾小管上皮细胞铁死亡在肾纤维化发生中的作用及机理，将为肾纤维化防治的研究提供新的途径和具体治疗靶点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是Liproxstatin-1减轻UUO诱导的肾组织中肾小管上皮细胞的铁死亡实验结果。
图2是Liproxstatin-1减轻UUO模型中的形态学变化和肾功能损害实验结果。
图3是Liproxstatin-1减轻了UUO模型中肾脏胶原的沉积实验结果。
图4是Liproxstatin-1减轻了促纤维因子的释放和成纤维细胞的增殖与活化实验结果。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
本发明以下实施例中所涉及的分子生物学实验包括：
(1)肾脏功能分析
从眼动脉取血，用比色法测定血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)水平(BeckmanAU5800，美国)。
(2)普鲁士蓝染色
解剖肾组织，部分组织标本在4％多聚甲醛溶液中固定，石蜡组织切片包埋。组织在普鲁士蓝溶液中孵育1小时，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗。在0.5％联苯胺四盐酸盐中进行第二次孵育。冲洗后在光镜下观察。
(3)E-cadherin与TUNEL共染色
对于TUNEL阳性细胞的检测，根据生产厂家提供的说明书使用TUNEL凋亡检测试剂盒进行试验。为确定细胞死亡是否主要发生在肾小管上皮细胞，使用免疫荧光染色法检测肾组织中E-cadherin(上皮细胞标记物)与TUNEL共染色。(4)肾GSSG/GSH比值的测定
氧化谷胱甘肽(GSSG)与总谷胱甘肽(GSH，还原谷胱甘肽+GSSG)的比值由GSH和GSSG检测试剂盒根据厂家说明进行测定。用酶标仪测定412nm处的吸光度。
(5)免疫组化，免疫荧光和组织病理学
使用免疫组化，免疫荧光和组织病理学等方法检测GPX4，胶原I，TGF-β1，CTGF和PDGF，E-cadherin和α-SMA的表达，使用Masson染色，Sirius red染色反映胶原沉积。
(6)蛋白质免疫印迹分析
肾组织、HK2细胞和人肾成纤维细胞在RIPA裂解缓冲液中裂解。使用BCA试剂盒测定总蛋白浓度。经过电泳-转膜-封闭-孵育抗体-显影等步骤检测蛋白表达情况。
(7)测定超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平
SOD(A001-1)、MDA(A003-1)试剂盒购于中国南京建城生物工程研究所。按照厂家说明收集HK2细胞，检测SOD(羟胺法)和MDA(硫代巴比妥酸法)水平。
(8)铁含量分析
每组取肾组织切片10mg，用冷PBS冲洗，将待测样本混匀。根据说明书，使用铁检测试剂盒评估肾组织和HK2细胞裂解液中的相对铁浓度。
实施例1
动物处理
8周龄雄性C57BL/6小鼠。所有实验动物程序均经中南大学科学研究中心(中国长沙)伦理委员会批准。小鼠用戊巴比妥钠(80mg/kg；腹腔注射)麻醉，并尽一切努力使手术期间和手术后的动物痛苦最小化。
动物模型
构建单侧输尿管梗阻(UUO)模型。剪开小鼠背部中下部皮肤、筋膜及肌肉，显露出左侧肾脏，用玻璃分针沿肾下级轻轻分离，暴露左侧输尿管，用2根4-0丝线进行结扎，在2根结扎线之间离断输尿管以防止逆行性尿路感染。庆大霉素庆充分冲洗伤口后吸净，用4-0丝线连续缝合内部肌肉及筋膜，3-0丝线间断缝合皮肤。假手术组和Liproxstatin-1组仅分离出左侧输尿管但不结扎，其余操作与造模组完全相同。24只C57BL/6小鼠随机分为以下四组：(1)假手术组；(2)Liproxstatin-1组；(3)UUO组；(4)UUO+Liproxstatin-1组。Liproxstatin-1和UUO+Liproxstatin-1组小鼠术后连续14天腹腔注射200μLLiproxstatin-1(10mg/kg/d，溶于DMSO，然后用0.9％NaCl稀释)。假手术组和UUO组小鼠腹腔注射等体积的0.9％NaCl溶液。最后一次治疗后，所有动物用戊巴比妥钠麻醉并处死。通过眼眶后出血从眼动脉收集血液。左肾的一部分固定在4％多聚甲醛溶液中，其余部分在液氮中速冻并储存在-80℃以供进一步分析。
对四组小鼠进行上述分子生物学实验，实验结果见图1-4。
如图1所示，与假手术组相比，UUO小鼠的肾组织中铁浓度(图1A、图1B)、GSSG/GSH比值(图1C)、TUNEL阳性细胞的数量(图1D)、氧化应激水平均明显增高(图1E、图1F)，GPX4表达明显下调(图1G)。与UUO组相比，Liproxstatin-1治疗后以上指标明显改善。这些数据表明，在UUO诱导的肾纤维化过程中，肾小管上皮细胞发生了铁死亡，Liproxstatin-1能够抑制铁死亡的发生。
如图2A-图2C所示，UUO组肾重量/体重比(肾重量指数)，BUN和Scr水平明显高于假手术组，Liproxstatin-1治疗减轻了肾功能损害。HE染色发现Liproxstatin-1组的肾小球和肾小管结构正常，表明Liproxstatin-1治疗(10mg/kg/d)未对肾结构造成损伤。UUO组间质空间明显变宽，有炎性细胞和血管周渗出液浸润，肾小球毛细血管扩张。UUO+Liproxstatin-1组中，UUO诱导的形态学改变明显改善(图2D)。这些结果表明Liproxstatin-1能够在体内预防UUO引起的形态学改变和肾功能损害。
胶原沉积是肾纤维化的重要特征，如图3A所示，在假手术组或Liproxstatin-1组中没有观察到明显的胶原沉积，而UUO组胶原沉积非常明显；与UUO组相比，Liproxstatin-1处理的小鼠肾组织中的胶原沉积减少。此外，免疫组织化学染色及蛋白质印迹分析显示UUO组肾组织中I型胶原的表达显著增加，而UUO+Liproxstatin-1组中I型胶原的表达显著减少(图3A、图3B)。这些数据表明Liproxstatin-1减轻了UUO诱导的肾间质胶原沉积。
如图4A所示，UUO组大鼠肾组织中促纤维化因子TGF-β1、CTGF、PDGF表达较假手术组明显升高；与UUO组相比，Liproxstatin-1治疗显著降低了TGF-β1、CTGF和PDGF表达。免疫荧光染色和蛋白质印迹分析提示肌成纤维细胞的主要分子标志物α-SMA的表达在UUO组明显增多。与UUO组相比，Liproxstatin-1治疗降低了α-SMA表达(图4B、图4C)。这些结果表明，Liproxstatin-1能够减轻UUO诱导的肾组织中促纤维化因子的分泌和肌成纤维细胞的活化。
以上实验结果表明：肾纤维化过程中，肾小管上皮细胞发生了铁死亡，而铁死亡抑制剂Liproxstatin-1能够抑制铁死亡的发生。Liproxstatin-1抑制了肾小管上皮细胞铁死亡，从而能够在体内预防UUO引起的形态学改变和肾功能损害，减弱肾间质胶原沉积，能够抑制肾组织中促纤维化因子的分泌和肌成纤维细胞的活化，从而能达到减轻肾纤维化的作用。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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