分析奶粉中氧化多环芳烃和氯代多环芳烃的含量的方法
阅读说明：本技术 分析奶粉中氧化多环芳烃和氯代多环芳烃的含量的方法 (Method for analyzing content of oxidized polycyclic aromatic hydrocarbon and chlorinated polycyclic aromatic hydrocarbon in milk powder ) 是由 吴时敏 严凯 李玮 张立敏 于 2021-08-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种分析奶粉中氧化多环芳烃和氯代多环芳烃的含量的方法,包括以下步骤：A1：制定氧化多环芳烃和氯代多环芳烃的标准曲线；A2：利用超声辅助萃取法从奶粉溶液中萃取目标分析物；A3：采用SPE方法净化目标分析物；A4：净化后的样品经浓缩,经气相色谱-三重四级杆串联质谱检测,外标法定量,得到奶粉中氧化多环芳烃和氯代多环芳烃的含量；其中,所述的氧化多环芳烃包括蒽醌和9-芴酮,所述的氯代多环芳烃包括6-氯苯并芘和7-氯苯并蒽。本发明所建立的GC–QQQ–MS方法中,包括色谱柱的选择和升温条件的优化,在较短时间内实现了四种目标分析物9–芴酮、蒽醌、6–氯苯并芘和7–氯苯并蒽的良好分离和色谱响应,兼顾了定量分析的精确性和高效性。(The invention discloses a method for analyzing the content of oxidized polycyclic aromatic hydrocarbon and chlorinated polycyclic aromatic hydrocarbon in milk powder, which comprises the following steps: a1: preparing a standard curve of the oxidized polycyclic aromatic hydrocarbon and the chlorinated polycyclic aromatic hydrocarbon; a2: extracting a target analyte from a milk powder solution by using an ultrasonic-assisted extraction method; a3: purifying the target analyte by SPE method; a4: concentrating the purified sample, detecting by gas chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry, and quantifying by an external standard method to obtain the contents of oxidized polycyclic aromatic hydrocarbon and chlorinated polycyclic aromatic hydrocarbon in the milk powder; wherein, the oxidized polycyclic aromatic hydrocarbon comprises anthraquinone and 9-fluorenone, and the chlorinated polycyclic aromatic hydrocarbon comprises 6-chlorobenzpyrene and 7-chlorobenzanthracene. The GC-QQQ-MS method established by the invention comprises the selection of a chromatographic column and the optimization of a heating condition, realizes the good separation and chromatographic response of four target analytes, namely 9-fluorenone, anthraquinone, 6-chlorobenzpyrene and 7-chlorobenzanthracene, in a short time, and gives consideration to the accuracy and the high efficiency of quantitative analysis.)
技术领域
本发明涉及食品安全领域中分析多环芳烃衍生物的方法，尤其涉及一种分析奶粉中氧化多环芳烃和氯代多环芳烃的含量的方法。
背景技术
多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，简称PAHs)是指在结构上包含了两个或以上的稠合苯环的一类持久性有机污染物，具有亲脂性，易蓄积于脂肪组织中，并可通过食物链富集及放大作用，进一步危害人体健康。氧化多环芳烃(OPAHs)广泛存在于各种基质中，具有较其母体更强的氧化还原特性，更易蓄积于生物体中，诱发更强的致畸、致突变毒性效应。氯代多环芳烃(ClPAHs)也是一类具有致癌特性的多环芳烃衍生物，其可在有自来水消毒、燃烧等过程中通过光化学反应等产生，表现出与二噁英相似甚至更高的毒性当量。有文献报道表明，其具有比母体PAHs更强的毒性。
目前，国内外大量研究发现，OPAHs和ClPAHs具有很强的致癌性，且在环境样本中有大量残留，会随着大气迁移进入食物链，疏水性质使其在富脂食物中蓄积，进一步威胁食品安全。奶粉作为一种含脂食品，欧盟已规定婴儿奶粉中PAHs之一的苯并[a]芘不得超过1μg/kg。鉴于OPAHs和ClPAHs更高的毒性，其安全限量有可能会提上日程。因此，建立两种典型的OPAHs(9–芴酮和蒽醌)、两种典型的ClPAHs(6–氯苯并芘和7–氯苯并蒽)在奶粉中的同时定量检测方法，对奶粉的安全及质量保障非常重要。
目前，虽然PAHs的分析方法及残留风险已引起国内外广泛关注，然而对高毒性的PAHs衍生物ClPAHs(6–氯苯并芘和7–氯苯并蒽)和OPAHs(9–芴酮、蒽醌)的研究不多，对其在奶粉中的分析方法尚未见报道；而且，奶粉中丰富的脂肪、蛋白质等复杂基质使得痕量PAHs的精确测定极为困难。本技术的目的在于针对性解决上述两个难题。
发明内容
针对目前奶粉基质中9-芴酮、蒽醌、6-氯苯并芘和7-氯苯并蒽的残留水平及无法定量分析的难题，本发明提供一种分析奶粉中氧化多环芳烃和氯代多环芳烃的含量的方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种分析奶粉中氧化多环芳烃和氯代多环芳烃的含量的方法，包括以下步骤：
A1：制定氧化多环芳烃和氯代多环芳烃的标准曲线；
A2：利用超声辅助萃取法从奶粉溶液中萃取目标分析物；
A3：采用SPE方法净化目标分析物；
A4：净化后的样品经浓缩，经气相色谱-三重四级杆串联质谱检测，外标法定量，得到奶粉中氧化多环芳烃和氯代多环芳烃的含量；
其中，所述的氧化多环芳烃包括蒽醌和9-芴酮，所述的氯代多环芳烃包括6-氯苯并芘和7-氯苯并蒽。
制定氧化多环芳烃和氯代多环芳烃的标准曲线的具体方法如下：分别以二氯甲烷作为溶剂配置1、2、5、10、20、50、100μg/kg共七个水平的9-芴酮、蒽醌、6-氯苯并芘和7-氯苯并蒽的标准溶液，以标准溶液中氧化多环芳烃和氯代多环芳烃的浓度为横坐标，以经气相色谱-三重四级杆串联质谱检测的氧化多环芳烃和氯代多环芳烃的响应值为纵坐标，绘制标准曲线。
所述的气相色谱-三重四级杆串联质谱的检测条件如下：
色谱柱：安捷伦DB–EUPAH毛细管色谱柱，色谱柱的规格为20m×0.18mm×0.14μm；
升温程序：80℃保持1min，以20℃/min的速度升至220℃，接着以5℃/min的速度升至300℃，保持1min；
进样温度、传输线、离子源和四级杆的温度分别为320℃、320℃、300℃和150℃；
进样量：1μL；
载气：氦气(99.999％)；
载气流速：1mL/min，不分流；
电离方式：EI+，70eV；
扫描方式：全扫描，33–300amu，选择离子监测模式(SIM)。
从奶粉溶液中萃取目标分析物的具体操作：
A201：配置奶粉溶液，奶粉与蒸馏水的质量比为1:7；
A202：氮氮二甲基甲酞胺提取氧化多环芳烃和氯代多环芳烃：在第一离心管中准确称取奶粉溶液，加入正己烷、氮氮二甲基甲酞胺并充分混合，将第一离心管在涡流振荡器上涡流震荡，后进行超声离心，下层液为氮氮二甲基甲酞胺相，上层为正已烷相，氮氮二甲基甲酞胺相留取备用，将正已烷相继续用氮氮二甲基甲酞胺继续提取一次，将两次的氮氮二甲基甲酞胺相合并得到氮氮二甲基甲酞胺提取液；
其中，奶粉溶液、正已烷及氮氮二甲基甲酞胺的比例关系为5g：4mL：8mL；
A203：用正已烷提取氧化多环芳烃和氯代多环芳烃：向氮氮二甲基甲酞胺提取液加入质量分数4％的氯化钠溶液，混匀后，加入8mL正己烷，充分震荡混匀后静置，上层液为正已烷相，下层液为水相，将正已烷相留取备用，将水相继续正己烷提取一次，将两次的正已烷相合并得到正已烷相提取液；
其中，氮氮二甲基甲酞胺提取液、氯化钠溶液、正已烷的比例关系为16mL：50mL：8mL；
A204：干燥、浓缩：将正已烷相提取液移至玻璃管中，加入无水硫酸钠干燥，20℃条件下氮气浓缩至2mL。
采用SPE方法净化目标分析物的具体方法为：采用Supelclean Florisil固相萃取小柱进行净化，首先对固相萃取小柱进行活化平衡，然后上样，上样完毕后，将固相萃取小柱上的非目标分析物淋洗掉，然后用洗脱液将目标分析物洗脱下来，收集洗脱液减压浓缩至干，再用上机溶剂溶解。
对固相萃取小柱进行活化平衡是指用二氯甲烷进行活化，用正已烷平衡。
所述的淋洗液为体积比为95：5的正已烷与二氯甲烷混合液，所述的洗脱液为体积比为1：2的正已烷与二氯甲烷混合液，所述上机溶剂为二氯甲烷。
本发明由于采用以上技术方案，使其与现有技术相比具有以下的优点和积极效果：
目前对四种PAHs衍生物(6-氯苯并芘、7-氯苯并蒽和9-芴酮、蒽醌)的测定方法多见于大气和水这两种基质相对简单的样品，而本发明在奶粉中脂肪、蛋白质等复杂基质的干扰下，在较短时间内(25min)实现了四种目标分析物(9–芴酮、蒽醌、6–氯苯并芘和7–氯苯并蒽)的良好分离和色谱响应，兼顾了定量分析的精确性和高效性。本发明通过优化萃取过程中正已烷和氮氮二甲基甲酞胺的比例关系，从奶粉中成功提取四种PAHs衍生物。同时，在仪器参数方面，针对四种PAHs衍生物，对色谱条件(色谱柱规格和填料、进样口温度、升温程序等)进行对比、优化，获得了良好的分离度；进一步对质谱参数(监测离子碎片、离子源、四级杆温度等)进行优化，实现了不同性质PAHs衍生物的同时、高灵敏分析，在较短时间内(25min)实现了四种目标分析物(9–芴酮、蒽醌、6–氯苯并芘和7–氯苯并蒽)的良好分离和质谱响应，兼顾了定量分析的精确性和高效性。
采用本发明的分析方法分析了奶粉中9–芴酮、蒽醌、6–氯苯并芘和7–氯苯并蒽，在5μg/kg和10μg/kg两个添加水平下，各目标物的空白加标回收率在63.38-109.54％之间，相对标准偏差为3.82-12.81％，本方法的检出限在0.08-0.78μg/kg之间，灵敏度高、满足定量分析的要求，具有推广至其他OPAHs和ClPAHs的潜力。
附图说明
图1为9-芴酮、蒽醌、6-氯苯并芘和7-氯苯并蒽标准品的色谱图；
图2为9-芴酮、蒽醌、6-氯苯并芘和7-氯苯并蒽标准品的质谱图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明提出的一种分析奶粉中氧化多环芳烃和氯代多环芳烃的含量的方法作进一步详细说明。根据下面说明和权利要求书，本发明的优点和特征将更清楚。
以下实施例中，所有试剂均是HPLC级。
实施例1
一种分析奶粉中氧化多环芳烃和氯代多环芳烃的含量的方法，采用仪器与试剂：GC–QQQ–MS(7890B–7000D)；所用试剂均为HPLC级。
第一步，制定氧化多环芳烃和氯代多环芳烃的标准曲线，具体步骤包括：
1.1分别以二氯甲烷作为溶剂配置1、2、5、10、20、50、100μg/kg共七个水平的9-芴酮(9–FO)、蒽醌(ATQ)、6-氯苯并芘(6–BaP)和7-氯苯并蒽(7–BaA)的标准溶液，以标准溶液中氧化多环芳烃和氯代多环芳烃的浓度为横坐标，以经气相色谱-三重四级杆串联质谱检测的氧化多环芳烃和氯代多环芳烃的响应值为纵坐标，绘制标准曲线。以每种目标分析物响应值为噪音值3倍(S/N为3)时的浓度为方法检出限，S/N为10时的浓度为方法定量限。
1.2所述的气相色谱-三重四级杆串联质谱检测条件如下：
色谱柱：安捷伦DB–EUPAH毛细管色谱柱，色谱柱的规格为20m×0.18mm×0.14μm；
升温程序：80℃保持1min，以20℃/min的速度升至220℃，接着以5℃/min的速度升至300℃，保持1min；
进样温度、传输线、离子源和四级杆的温度分别为320℃、320℃、300℃和150℃；
进样量：1μL；
载气：氦气(99.999％)；
载气流速：1mL/min，不分流；
电离方式：EI+，70eV；
扫描方式：全扫描，33–300amu，选择离子监测模式(SIM)。
9–芴酮、蒽醌、6–氯苯并芘和7–氯苯并蒽的质谱参数、标准曲线线性相关性(R2)、检出限(LOD)和定量限(LOQ)见表1，9-芴酮、蒽醌、6-氯苯并芘和7-氯苯并蒽标准品的色谱、质谱图如图1、图2所示。可见，本实施例对于9-芴酮、蒽醌、6-氯苯并芘和7-氯苯并蒽的检出限为0.08-0.12μg/kg，定量限为0.28-0.41μg/kg，并且各物质的色谱分离度高，符合痕量物质的定性定量检测要求。
第二步，首先对奶粉中多环芳烃进行萃取，具体步骤包括：
1、配置奶粉溶液，奶粉与蒸馏水的质量比为1:7；
2、氮氮二甲基甲酞胺提取氧化多环芳烃和氯代多环芳烃：在离心管中准确称取5g奶粉溶液，加入4mL正己烷、8mL氮氮二甲基甲酞胺并充分混合，将第一离心管在涡流振荡器上涡流震荡，后进行超声离心，下层液为氮氮二甲基甲酞胺相，上层为正已烷相，氮氮二甲基甲酞胺相留取备用，将正已烷相继续用氮氮二甲基甲酞胺继续提取一次，将两次的氮氮二甲基甲酞胺相合并移取到分液漏斗中；
3、用正已烷提取氧化多环芳烃和氯代多环芳烃：向分液漏斗中的氮氮二甲基甲酞胺提取液加入50mL质量分数4％的氯化钠溶液，混匀后，加入8mL正己烷，充分震荡混匀后静置，上层液为正已烷相，下层液为水相，将正已烷相留取备用，将水相继续添加8mL正己烷提取一次，将两次的正已烷相合并得到正已烷相提取液；
3、干燥、浓缩：将正已烷相提取液移至玻璃管中，加入无水硫酸钠干燥，20℃条件下氮气浓缩至2mL。
第三步，采用SPE方法净化目标分析物
a)活化平衡，6mL二氯甲烷活化两次，6mL正己烷平衡两次；
b)上样，将2mL待净化溶液加入小柱，流出液弃去；
c)淋洗，先用5mL正己烷淋洗，再用5mL正己烷/二氯甲烷(95:5,v/v)淋洗小柱，淋洗液弃去；
d)洗脱，5mL正己烷：二氯甲烷(1:2,v/v)洗脱，收集洗脱液；
e)再溶解，将洗脱液减压浓缩至1mL，加500μL甲苯保持继续吹至20mg以内，用二氯甲烷定容至250μL进行GC–QQQ–MS检测分析。
第四步，GC–QQQ–MS检测分析
参考第一步制定标准曲线的质谱仪参数，利用仪器分析软件解析，得到奶粉中四种PAHs的含量。
方法验证：
在奶粉空白样品中，在5μg/kg和10μg/kg两个加标水平下，四种分析物的回收率(recovery)、日内精密度(aRSDr)、日间精密度(bRSDR)、检出限及定量限见表1。
表1 9-芴酮、蒽醌、6-氯苯并芘和7-氯苯并蒽的质谱参数及方法验证结果
注：aRSDr:重复性实验条件下相对标准偏差,n＝6；
bRSDR:中间精密度实验条件下相对标准偏差,n＝6.
上面结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式。即使对本发明做出各种变化，倘若这些变化属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则仍落入在本发明的保护范围之中。
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