具体实施方式

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本文主题所属领域通常技术人员通常理解的相同的含义。如在说明书和所附权利要求书中使用的，除非有相反的说明，以下术语具有所指示的含义以便于理解本发明。

在说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”及“所述(the)”包括多形式，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一种组合物”包括两种或更多种此类组合物的混合物，提及“一种抑制剂”包括两种或更多种此类抑制剂的混合物等等。

除非另有说明，否则术语“约”是指由术语“约”所修饰的特定值的10％内(例如，5％、2％或1％内)。

过渡用语“包含(comprising)”，其为与“包括(including)”、“含有(containing)”或“特征在于(characterized by)”同义，为含括性或开放性且不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。相对而言，过渡短语“由……组成(consisting of)”排除权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。过渡短语“基本上由……组成(consisting essentially of)”将权利要求的范围限制为“对要求保护的发明的基本和新颖特征没有实质性影响”的特定材料或步骤。

关于本发明的化合物，并且在以下术语在本文中用于进一步描述它们的范围内，以下定义适用。

如使用于本文，用语"烷基(alkyl)"意指饱和线状或支链单价烃基。一具体例中，烷基为C1-C18基。其他具体例中，烷基为C0-C6、C0-C5、C0-C3、C1-C12、C1-C8、C1-C6、C1-C5、C1-C4或C1-C3基(其中C0烷基意指键)。烷基的实例包括甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、i-丙基、1-丁基、2-甲基-1-丙基、2-丁基、2-甲基-2-丙基、1-戊基、n-戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基、3,3-二甲基-2-丁基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一基及十二基。一些具体例中，烷基为C1-C3烷基。

如使用于本文，用语“伸烷基(alkylene)”意指直链或支链二价烃链连接分子的其余部分至基团，由碳及氢所组成，不含有不饱和性且具有1至12的碳原子，举例而言，亚甲基、伸乙基、伸丙基、伸正丁基等。伸烷基连可经由单键附接至分子的其余部分及经由单键附接至基团。一些具体例中，伸烷基含有1至8个碳原子(C1-C8伸烷基)。其他具体例中伸烷基含有1至5个碳原子(C1-C5伸烷基)。其他具体例中，伸烷基含有1至4个碳原子(C1-C4伸烷基)。其他具体例中，伸烷基含有1至3个碳原子(C1-C3伸烷基)。其他具体例中，伸烷基含有1至2个碳原子(C1-C2伸烷基)。其他具体例中，伸烷基含有1个碳原子(C1伸烷基)。

如使用于本文，用语"烯基(alkenyl)"意指具有至少一个碳-碳双键的线状或支链单价烃基团。烯机包括具有"顺(cis)"及"反(trans)"定向，或替代地，"E"及"Z"定向的基团。一实例中，烯基基团为C2-C18基。其他具体例中烯基基团为C2-C12、C2-C10、C2-C8、C2-C6或C2-C3基。实例包括乙烯基(ethenyl或vinyl)、丙-1-烯基、丙-2-烯基、2-甲基丙-1-烯基、丁-1-烯基、丁-2-烯基、丁-3-烯基、丁-1,3-二烯基、2-甲基丁-1,3-二烯、己-1-烯基、己-2-烯基、己-3-烯基、己-4-烯基及己-1,3-二烯基。

用语“烷氧基(alkoxyl)”或“烷氧基(alkoxy)”如使用于本文意指如上所述的烷基而具有氧基团附接至其，其为对较大分子的附接点。代表性烷氧基包括groups包括甲氧基、乙氧基、丙基氧基、第三-丁氧基等。“醚”为二个烃基通过氧共价连接。因此，赋予烷基为醚或类似于烷氧基的烷基的取代基，例如可表示为-O-烷基、-O-烯基、及-O-炔基。

如使用于本文，用语“亚烷基(alkoxylene)”意指通式(-O-C_nH_2n-)其中n代表整数(如，1、2、3、4、5、6或7)的饱和单价脂族基团且为涵括直链及支链基团二者。亚烷基链可经由单键附接至分子的其余部分且经由单键附接至基团。一些具体例中，亚烷基含有1至3碳原子(-O-C₁-C₃亚烷基)。其他具体例中，亚烷基含有1至5个碳原子(-O-C₁-C₅亚烷基)。

如使用于本文，用语“环状基(cyclic group)”概括地意指单独使用或使用作为较大分子的一部份的任何基团，含有饱和、部分饱和或芳香环系统，如碳环(环烷基、环烯基)、杂环(杂环烷基、杂环烯基)、芳基及杂芳基。环状基可聚有一或多个(如，稠合的)环系统。因此，例如，环状基可含有一或多个碳环、杂环、芳基或杂芳基。

如使用于本文，用语“碳环(carbocyclic)”(也为"碳环基(carbocyclyl)")意指基团为单独使用或作为较大分子的一部分，含有包合、部分不饱和或芳族环(如，苯基)系统，具有3至20个碳原子，其为般独或较大分子的一部分(如，烷碳环基)。用语碳环基包括单-、二-、三-、稠合的、桥接的、及螺环系统，与其组合。一具体例中，碳环基包括3至15个碳原子(C₃-C₁₅)。一具体例中，碳环基包括3至12个碳原子(C₃-C₁₂)。另一具体例中，碳环基包括C₃-C₈、C₃-C₁₀或C₅-C₁₀.另一具体例中，碳环基，作为单环，包括C₃-C₈、C₃-C₆或C₅-C₆。一些具体例中，碳环基，做为双环，包括C₇-C₁₂。另一具体例中，碳环基，作为螺系统，包括C₅-C₁₂。单环碳环基的代表性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、全氘环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环己二烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、环十一基、苯基及环十二基；双环具有7至12个环原子的双环碳环基包括[4,3]、[4,4]、[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]环系统，如举例而言，双环[2.2.1]庚烷、双环[2.2.2]辛烷、萘及双环[3.2.2]壬烷。螺碳环基的代表性实例包括螺[2.2]戊烷、螺[2.3]己烷、螺[2.4]庚烷、螺[2.5]辛烷及螺[4.5]癸烷。用语碳环基包括如本文所定义的芳环系统。用语碳环也包括环烷基环(如，饱和或部分不饱和的单-、双-或螺-碳环)。用语碳环状基也包括稠合至一或多个(如，1,2或3)不同环状基(如，芳基或杂环状环)的碳环状基，其中基团或附接点位于碳环状环。

因此，用语碳环也涵盖碳环基烷基，其如本文所用是指式-R^c-碳环基的基团，其中R^c为亚烷基链。用语碳环也涵盖碳环基烷氧基，如本文所用，其是指经由式-O--R^c-碳环基的氧原子键结的基团，其中R^c为亚烷基链。

如使用于本文，用语"杂环(heterocyclyl)"意指其单独使用或作为较大分子的一部分的"碳环基(carbocyclyl)"，其含有饱和、部分不饱和或芳族环系统，是指单独使用或作为较大部分的一部分使用的“碳环基”，其包含饱和、部分不饱和或芳香环系统，其中一个或多个(例如，1、2、3或4个)碳原子已被杂原子(例如，O、N、N(O)、S、S(O)或S(O)₂)取代。用语杂环基包括单-、双-、三-、稠合、桥连和螺环系统，及其组合。一些具体例中，杂环基是指3至15员杂环基环系统。一些具体例中，杂环基是指3至12员杂环基环系统。一些具体例中，杂环基是指饱和环系统，例如3至12员饱和杂环基环系统。一些具体例中，杂环基是指杂芳环系统，例如5至14员杂芳环系统。术语杂环基还包括C₃-C₈杂环烷基，其为饱和或部分不饱和的单-、双-或螺环系统，含有3至8个碳及一个或多个(1、2、3或4)个杂原子。

一些具体例中，杂环基包括3至12个环原子并且包括单环、双环、三环和螺环系统，其中环原子是碳，并且1至5个环原子是杂原子，例如氮、硫或氧。一些具体例中，杂环基包括具有一个或多个选自氮、硫或氧的杂原子的3-至7-员单环。一些具体例中，杂环基包括具有一个或多个选自氮、硫或氧的杂原子的4-至6-员单环。一些具体例中，杂环基包括3-员单环。一些具体例中，杂环基包括4-员单环。一些具体例中，杂环基包括5至6-员单环。一些具体例中，杂环基包括0至3个双键。任何前述具体例中，杂环基包括1、2、3或4个杂原子。任何氮或硫杂原子可以任选地被氧化(例如，NO、SO、SO₂)，并且任何氮杂原子可以任选地被四级铵化(例如，[NR₄]⁺Cl^-、[NR₄]⁺OH^-)。杂环基的代表性实例包括环氧乙烷基、氮丙啶基、硫杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、1,2-二硫杂环丁烷基、1,3-二硫杂环丁烷基、吡咯烷基、二氢-1H-吡咯基、二氢呋喃基、四氢哌喃基、二氢噻吩基、四氢噻吩基、咪唑啶基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫吗啉基、1,1-二氧代-硫吗啉基、二氢吡喃基、四氢吡喃基、六氢噻喃基、六氢嘧啶基、恶嗪基、硫杂氮杂环己烷基、硫杂氧杂环己烷基、高哌嗪基、高哌啶基、氮杂环庚烷基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、四氢噻喃基、恶唑烷基、噻唑烷基、异噻唑烷基、1,1-二氧代异噻唑烷基、硫酮基恶唑烷酮基、咪唑烷酮基、4,5,6,7-四氢[2H]四氢茚基,4-氢[2H]苯并咪唑基、4,5,6,7-四氢苯并[d]咪唑基、1,6-二氢咪唑并[4,5-d]吡咯病[2,3-b]吡啶基、噻嗪基、硫苯基、恶嗪基、噻二嗪基、恶二嗪基、二噻嗪基、二恶嗪基、氧杂硫杂氮杂环己烯基、硫杂三氮杂环己烯基、氧杂三氮杂环己烯基、二硫杂二氮杂环己烯基、咪唑啉基、二氢嘧啶基、四氢嘧啶基、1-吡咯啉基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、二氢吲哚基、噻喃基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二氧杂环己烷基、1,3-二氧杂环戊基、吡唑啉基、吡唑啶基、二硫杂环己基、二硫环戊基、嘧啶酮基、嘧啶二酮基、嘧啶-2,4-二酮基、哌嗪酮基、哌嗪二酮基、3-氮杂双环[3.1.0]己烷基、3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚烷基、6-氮杂双环[3.1.1]庚烷基、3-氮杂双环[3.1.1]庚烷基、3-氮杂双环[4.1.0]庚烷基、氮杂双环[2.2.2]己烷基、2-氮杂双环[3.2.1]辛烷基、8-氮杂双环[3.2.1]辛烷基、2-氮杂双环[2.2.2]辛烷基、8-氮杂双环[2.2.2]辛烷基、7-氧杂双环[2.2.1]庚烷、氮杂螺[3.5]壬烷基、氮杂螺[2.5]辛烷基、氮杂螺[4.5]癸烷基、1-氮杂螺[4.5]癸烷-2-酮基、氮杂螺[5.5]十一碳烷基、四氢吲哚基、八氢吲哚基、四氢异吲哚基、四氢吲唑基、1,1-二侧氧基、六氢硫吡喃基。含有硫原子或氧原子以及一至三个氮原子的5-员杂环的实例为噻唑基，包括噻唑-2-基及噻唑-2-基N-氧化物，噻二唑基，包括1,3,4-噻二唑-5-基及1,2,4-噻二唑-5-基，恶唑基，例如恶唑-2-基及恶二唑基，如1,3,4-恶二唑-5-基及1,2,4-恶二唑-5-基。含有2至4个氮原子的5-员杂环基实例包括咪唑基，例如咪唑-2-基；三唑基，如1,3,4-三唑-5-基；1,2,3-三唑-5-基、1,2,4-三唑-5-基和四唑基，例如1H-四唑-5-基。苯并稠合的5-员杂环基的代表性实例为苯并恶唑-2-基、苯并噻唑-2-基及苯并咪唑-2-基。含有一到三个氮原子和任选的硫或氧原子的6-员杂环基实例，例如吡啶基，例如吡啶-2-基、吡啶-3-基及吡啶-4-基；嘧啶基，例如嘧啶-2-基及嘧啶-4-基；三嗪基，例如1,3,4-三嗪-2-基及1,3,5-三嗪-4-基；哒嗪基，特别是哒嗪-3-基及吡嗪基。吡啶N-氧化物及哒嗪N-氧化物以及吡啶基、嘧啶-2-基、嘧啶-4-基、哒嗪基和1,3,4-三嗪-2-基是杂环基的其它实例。一些具体例中，杂环基团包括与一个或多个(如，1、2或3个)不同环状基团(如，碳环或杂环)稠合的杂环，其中基团或附接点在杂环，以及一些具体例中，在其中附接点是含有于杂环中包含的杂原子

因此，用语杂环包括N-杂环基，其如本文所用是指含有至少一个氮的杂环基，以及其中杂环基与分子其余部分的附接点是经由杂环基中的氮原子。N-杂环基的代表性实例包括1-吗啉基、1-哌啶基、1-哌嗪基、1-吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑啉基和咪唑烷基。术语杂环还包括C-杂环基，其如用于本文是指含有至少一个杂原子的杂环基，并且其中杂环基与分子其余部分的附接点是经由杂环基中的碳原子。C-杂环基的代表性实例包括2-吗啉基、2-或3-或4-哌啶基、2-哌嗪基和2-或3-吡咯烷基。用语杂环还包括杂环基烷基，如上文所公开的，其是指式-R^c-杂环基的基团，其中R^c是亚烷基链。用语杂环也包括杂环基烷氧基，如本文所用，其是指经由式-O--R^c-杂环基的氧原子键结的基团，其中R^c是亚烷基链。

如使用于本文，用语"芳基(aryl)"单独使用或作为较大部分的一部分使用(例如，“芳烷基(aralkyl)”，其中烷基上的末端碳原子是连接点，例如芐基)，“芳烷氧基(aralkoxy)”，其中氧原子是附接点或“芳氧基烷基(aroxyalkyl)”，其中连接点在芳基上)是指包括单环、双环或三环碳环系统的基团，其包括稠环，其中该系统中的至少一个环是芳族的。一些具体例中，芳烷氧基是苯甲氧基。术语“芳基”可以与术语“芳环(aryl ring)”互换使用。一具体例中，芳基包括具有6至18个碳原子的基团。另一具体例中，芳基包括具有6至10个碳原子的基团。芳基的实例包括苯基、萘基、蒽基、联苯基、菲基、萘基、1,2,3,4-四氢萘基、1H-茚基、2,3-二氢-1H-茚基、萘啶基等，其等可为本文所述的一个或多个取代基取代或独立取代。特定的芳基是苯基。一些具体例中，芳基包括稠合至一个或多个(如，1、2或3个)不同环状基团(如，碳环或杂环)的芳环，其中基团或附接点在芳环。

因此，用语芳基涵盖芳烷基(如，苄基(benzyl))其如上文所公开是指式-Rc-芳基的基团，其中Rc是亚烷基链，例如亚甲基或亚乙基。一些具体例中，芳烷基是任选取代的芐基。用语芳基还包括芳烷氧基，如使用于本文，芳烷氧基是指经由式-O-Rc-芳基的氧原子键结的基团，其中Rc是亚烷基链，例如亚甲基或亚乙基。

如使用于本文，用语"杂芳基(heteroaryl)"单独使用或作为较大分子的一部分(如，"杂芳基烷基(heteroarylalkyl)"(也为“杂芳烷基(heteroaralkyl)”)，或"杂芳基烷氧基(heteroarylalkoxy)"(也为“杂芳烷氧基(heteroaralkoxy)”)，意指具有5至14个环原子的单环、双环或三环系统，其中至少一个环是芳族的且含有至少一个杂原子。一具体例中，杂芳基包括5至6员单环芳族基团，其中一个或多个环原子是独立地任选取代的氮、硫或氧。另一具体例中，杂芳基包括5至6员单环芳族基团，其中一个或多个环原子是氮、硫或氧。杂芳基的代表性实例包括噻吩基、呋喃基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、异噻唑基、恶唑基、异恶唑基、三唑基、噻二唑基、恶二唑基、四唑基、噻三唑基、恶三唑基、吡啶基、嘧啶基、咪唑并嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基、四嗪基、四唑并[1,5-b]哒嗪基、嘌呤基、去氮杂嘌呤基、苯并恶唑基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、苯并咪唑基、吲哚基、1,3-噻唑-2-基、1,3,4-三唑-5-基、1,3-恶唑-2-基、1,3,4-恶二唑-5-基、1,2,4-恶二唑-5-基、1,3,4-噻二唑-5-基、1H-四唑-5-基、1,2,3-三唑-5-基和吡啶-2-基N-氧化物。用语“杂芳基”也包括其中杂芳基稠合至一个或多个环状(如，碳环基或杂环基)环的基团，其中基团或附点位于杂芳基环。非限制性实例包括吲哚基、吲哚嗪基、异吲哚基、苯并噻吩基、苯并硫苯基、亚甲二氧基苯基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并二恶唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹恶啉基、4H-喹唑啉基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩恶嗪基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基及吡啶并[2,3-b]-1,4-恶嗪-3(4H)-酮。杂芳基可以是单-环、双-环或三-环。一些具体例中，杂芳基包括稠合到一个或多个(如，1、2或3)个不同环状基团(如，碳环或杂环)的杂芳环，其中基团或附接点在杂芳环，以及一些具体例中，附接点为杂环中包含的杂原子。

用语杂芳基也涵盖N-杂芳基，如使用于本文，是指如上定义的杂芳基，其含有至少一个氮原子，其中N-杂芳基与分子其余部分的附接点是杂芳基。用语杂芳基也包括C-杂芳基，如使用于本文，是指如上定义的杂芳基，并且其中杂芳基与分子其余部分的附接点是经由杂芳基中的碳原子。用语杂芳基进一步包括杂芳基烷基，其如上文所公开是指式-Rc-杂芳基的基团，其中Rc是如上文定义的亚烷基链。用语杂芳基进一步包括杂芳烷氧基(或杂芳基烷氧基)基团，如使用于本文，是指经由式-O--Rc-杂芳基的氧原子键结的基团，其中Rc是如上定义的亚烷基。

本文所述的任何基团可以是取代的或未取代的。如使用于本文，用语“取代的”泛指所有允许的取代基，隐含条件是此类取代与取代原子和取代基的允许价态一致，并且该取代产生稳定的化合物，亦即化合物：不自发地经历转化，例如通过重排、环化、消除等。代表性的取代基包括卤素、羟基和含有任意数量碳原子，例如1-14个碳原子的任何其他有机基团，并且可以包括一个或多个(如，1、2、3或4)个杂原子例如氧、硫及氮以直链、支链或环状结构形式。

取代基的代表性实例因此可包括烷基、取代烷基(如，C1-C6、C1-5、C1-4、C1-3、C1-2、C1)、烷氧基(如，C1-C6、C1-5、C1-4、C1-3、C1-2、C1)、取代烷氧基(如，C1-C6、C1-5、C1-4、C1-3、C1-2、C1)、卤烷基(如，CF₃)、烯基(如，C2-C6、C2-5、C2-4、C2-3、C2)、取代烯基(如，C2-C6、C2-5、C2-4、C2-3、C2)、炔基(如，C2-C6、C2-5、C2-4、C2-3、C2)、取代炔基(如，C2-C6、C2-5、C2-4、C2-3、C2)、环状(如，C3-C12、C5-C6)、取代环状(如，C3-C12、C5-C6)、碳环状(如，C3-C12、C5-C6)、取代碳环状(如，C3-C12、C5-C6)、杂环状(如，C3-C12、C5-C6)、取代杂环状(如，C3-C12、C5-C6)、芳基(如，苄基及苯基)、取代芳基(如，取代苄基或苯基)、杂芳基(如，吡啶基或嘧啶基)、取代杂芳基(如，取代吡啶基或嘧啶基)、芳烷基(如，苄基)、取代芳烷基(如，取代芳烷基)、卤基、羟基、芳基氧基(如，C6-C12、C6)、取代芳基氧基(如，C6-C12、C6)、芳基硫基(如，C1-C6)、取代芳基硫基(如，C1-C6)、芳基硫基(如，C6-C12、C6)、取代芳基硫基(如，C6-C12、C6)、氰基、羰基、取代羰基、羧基、取代羧基、胺基、取代胺基、酰胺基、取代酰胺基、硫基、取代硫基、亚磺酰基、取代亚磺酰基、磺酰基、取代磺酰基、胺亚磺酰基、取代胺亚磺酰基、胺磺酰基、取代胺磺酰基、脲、取代脲、胺基甲酸酯、取代胺基甲酸酯、胺基酸、及肽基。

用语“结合(binding)”因为它涉及式I化合物的靶向配体和靶向蛋白质之间的相互作用，在本发明中它们是AKT的所有三种同功型，亦即AKT1、2和3，通常是指分子间在靶向配体与细胞中存在的其他蛋白质实体的结合方面可能是优先的或基本上特异性的相互作用在功能上是微不足道的。本发明双官能化合物可以优先结合和募集AKT的所有三种同功型以进行靶向降解。

用语“结合”因为它涉及降解决定子和E3泛素连接酶之间的相互作用，通常是指分子间相互作用，其可能表现出或可能不表现出等于或超过靶向配体和靶蛋白之间的亲和力的亲和力水平，但尽管如此，其中亲和力足以实现将连接酶募集到靶向降解和靶向蛋白质的选择性降解。

概括地，本发明涉及双官能化合物，其包含结合AKT1、2和3的靶向配体及代表结合E3泛素连接酶的部分的降解子，通过连接子彼此共价连接，其中该化合物具有式I代表的结构:

其中

R_1为H或OH；

R₂为H、甲基、乙基或异丙基；

或其医药可接受盐或立体异构物。

靶向配体

一些具体例中，其中R₁及R₂为H，靶向配体具有TL1所代表的结构:

因此，一些具体例中，本发明化合物具有式I-1所代表的结构:

或其医药可接受盐或立体异构物。

一些具体例中，其中R₁为H及R₂为甲基，靶向配体具有TL1所代表的结构:

因此，一些具体例中，本发明户合物具有式I-2所代表的结构:

或其医药可接受盐或立体异构物。

一些具体例中，其中R₁为OH及R₂为H，靶向配体具有TL3所代表的结构:

因此，一些具体例中，本发明化合物具有式I-3所代表的结构:

或其医药可接受盐或立体异构物。

一些具体例中，其中R₁为OH及R₂为甲基，靶向配体具有结构TL4所代表的结构:

因此，一些具体例中，本发明化合物具有式I-4所代表的结构:

或其医药可接受盐或立体异构物。

连接子

连接子(“L”)提供靶向配体与降解决定子的共价连接。连接子的结构可能并不重要，只要它实质上不干扰靶向配体或降解决定子的活性。一些具体例中，连接子包括亚烷基连接子(如，具有0至11，包含性的，亚烷基单元)。其他具体例中，连接子可包括二价亚烷基链，其中断于或终止于(于一端或二端)--O--、--S--、--N(R')--、--C(O)--、--C(O)O--、--OC(O)--、--OC(O)O--、--C(NOR')--、--C(O)N(R')--、--C(O)N(R')C(O)--、--C(O)N(R')C(O)N(R')--、--N(R')C(O)--、--N(R')C(O)N(R')--、--N(R')C(O)O--、--OC(O)N(R')--、--C(NR')--、--N(R')C(NR')--、--C(NR')N(R')--、--N(R')C(NR')N(R')--、--S(O)₂--、--OS(O)--、--S(O)O--、--S(O)--、--OS(O)₂--、--S(O)₂O--、--N(R')S(O)₂--、--S(O)₂N(R')--、--N(R')S(O)--、--S(O)N(R')--、--N(R')S(O)₂N(R')--、--N(R')S(O)N(R')--、C_3-12亚碳环基、3-至12-员亚杂环基、5-至12-员亚杂芳环基或其任何组合的至少一者，其中R'为H或C₁-C₆烷基，其中中断或一端或二端的终止基可为相同或不同。

一些具体例中，连接子包括终止于NH-基的C1-C10亚烷基，其中氮也结合至降解决定子。

一些具体例中，连接子包括亚烷基链，其具有1至10个亚烷基单元且中断或终止于

"亚碳环基(Carbocyclene)"意指其为任选的经取代的二价碳环基团。

"亚杂环基(Heterocyclene)"意指其可任选的经取代的二价杂环基团。

"亚杂芳环基(Heteroarylene)"意指其可任选的经取代的二价杂芳族基团。

可适合使用于本发明的亚烷基连接子的代表性实例包括下述者:其中n为1至12的整数(“的”意指包含)，如，1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、2至3、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、3至4、4至10、4至9、4至8、4至7、4至6、4至5、5至10、5至9、5至8、5至7、5至6、6至10、6至9、6至8、6至7、7至10、7至9、7至8、8至10、8至9、9至10以及1、2、3、4、5、6、7、8、9及10，其实例包括:

以及

亚烷基链种酯于各种官能基(如上述)，其实例如下述:

以及

亚烷基链由各种官能基(如上述)所中断， 其实例如下述:

以及

亚烷基链由亚杂环基所中断或终止，如，

其中m及n独立地为1至10的整数，其实例包括:

以及

亚烷基链西安、亚杂环和/或芳基所中断，其实例包括:

以及

亚烷基链由亚杂环及芳基，及杂原子所中断，其实例包括:

以及

以及

亚烷基链由杂原子如N、O或B所中断，如，其中各n独立地为1至10的整数，如，1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、2至3、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、3至4、4至10、4至9、4至8、4至7、4至6、4至5、5至10、5至9、5至8、5至7、5至6、6至10、6至9、6至8、6至7、7至10、7至9、7至8、8至10、8至9、9至10及1、2、3、4、5、6、7、8、9以及10，以及R为H或C1至C4烷基，其实例为

一些具体例中，连接子可包括聚乙二醇链，其可终止于(于一端或二端)-S-、-N(R')-、-C≡C-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-C(NOR')-、-C(O)N(R')-、-C(O)N(R')C(O)-、-C(O)N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(O)-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(O)O-、-OC(O)N(R')-、-C(NR')-、-N(R')C(NR')-、-C(NR')N(R')-、-N(R')C(NR')N(R')-、-OB(Me)O-、-S(O)₂-、-OS(O)-、-S(O)O-、-S(O)-、-OS(O)₂-、-S(O)₂O-、-N(R')S(O)₂-、-S(O)₂N(R')-、-N(R')S(O)-、-S(O)N(R')-、-N(R')S(O)₂N(R')-、-N(R')S(O)N(R')-、C_3-12亚碳环基、3-至12-员亚杂环基、5-至12-员亚杂芳环基或其任何组合的至少一者，其中R'为H或C₁-C₆烷基，其中一或二个终止基团可为相同或不同。

一些具体例中，连接子包括具有2至8个PEG单元的聚乙二醇以及终止于

包括聚乙二醇链的连接子的实例包括:

其中n为2至10的整数，其实例包括:

以及

一些具体例中，聚乙二醇连接子可终止于官能基，其实例为如下述:

以及

一些具体例中，连接子为式L10所代表:

其中

A为不存在、CO或NR₃COCH₂，其中R₃为H或甲基；

m独立地为1至10；

以及n独立地为0、1、2或3。

因此，一些具体例中，本发明化合物由结构I-5所代:

或其医药可接受盐或立体异构物，其中

A为不存在、CO或NR₃COCH₂,其中R₃为H或甲基；

R₁为H或OH；

R₂为H、甲基、乙基或异丙基；

m独立地为1至10；

以及n独立地为0、1、2或3。

一些具体例中，连接子为结构的任一者所代表:

以及

因此，一些具体例中，本发明组合物由式I-6至I-21的任一者所代表:

或其医药可接受盐或立体异构物，其中

R₁为H或OH；以及

R₂为H、甲基、乙基或异丙基。

降解决定子(Degron)

泛素-蛋白酶体途径(UPP)是调节关键调节蛋白并降解错误折叠或异常蛋白的关键细胞途径。UPP是多个细胞过程的核心。泛素与特定蛋白质底物的共价连接是经由E3泛素连接酶的作用达成的。这些连接酶包括超过500种不同的蛋白质，并根据其E3功能活性的结构元素分为多个类别。

一些具体例中，降解决定子结合E3泛素连接酶，其为小脑蛋白且为结构D1a至D1h的任一者所代表:

以及

结合小脑蛋白且其可能适用于本发明的其他降解决定子揭示于美国专利第9,770,512号及美国专利公开案号2018/0015087、2018/0009779、2016/0243247、2016/0235731、2016/0235730及2016/0176916，以及国际专利公开案WO 2017/197055、WO 2017/197051、WO 2017/197036、WO 2017/197056及WO 2017/197046。

因此一些具体例中，本发明的化合物由式I-21至I-29的任一者所代表:

以及

或其医药可接受盐或立体异构物，其中

R₁为H或OH；以及

R₂为H、甲基、乙基或异丙基。

一些具体例中，通过降解决定子结合的E3泛素连接酶为凡希佩尔-林道(vonHippel-Lindau,VHL)肿瘤压制因子。参照，Iwai et al.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 96:12436-41(1999)。

结合VHL的降解决定子的额外实例为由下述式所代表:

其中Y’为键、N、O或C；

其中Z为环状基，一些具体例中其为C₅-C₆碳环基或杂环基；

以及

一些具体例中，本发明提供由式I-30至I-34的任一者所代表的化合物

以及

或

其医药可接受盐或立体异构物，

其中Z为a C₅-C₆碳环基或杂环基；

R_1为H或OH；以及

R₂为H、甲基、乙基或异丙基。

结合VHL且其可能适用于本发明的其他降解决定子揭示于美国专利公开案2017/0121321 A1。

因此，一些具体例中，本发明的化合物由结构TL-1至TL-4、L1至L7以及本文所描述的降解决定子的结构的组合所产生的任何结构所代表，包括D1a至D2d，或其医药可接受盐或立体异构物。

一些具体例中，本发明提供由下述结构的任一者所代表的化合物:

以及

其医药可接受盐及立体异构物。

式I的双官能化合物可为游离酸或游离碱，或医药可接受盐的形式。如使用于本文，用语"医药可接受"于盐的上下文中意指化合物的盐，其不破坏化合物的生物活性或性质，且为相对无毒，亦即可以将盐形式的化合物投药至受试者而不引起不希望的生物效应(例如头晕或胃部不适)或与组合物中含有的任何其他成分的有害方式的交互作用。用语"医药可接受盐"意指通过本发明的化合物与合式的酸或碱的反应所获得的产物。本发明的化合物的医药可接受盐类的实例包括该些衍生自合式的无机碱如Li、Na、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Al、Zn及Mn盐类。与无机酸所形成的胺基的医药可接受、非毒性加成盐类的实例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、异烟酸盐、乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、4-甲基苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐等。本发明的某些化合物可以与各种有机碱如离氨酸、精氨酸、胍、二乙醇胺或二甲双胍形成医药可接受盐。

一些具体例中，本发明的化合物是同位素衍生物，因为它具有至少一个原子的所需同位素取代，其量高于同位素的天然丰度，即，被富集。一具体例中，该化合物包括氘或多个氘原子。用更重的同位素，亦即²H，替代可提供某些治疗优势，因为代谢稳定性更高，例如，体内半衰期增加或剂量要求降低，因此在某些情况下可能是有利的。

式I的双官能化合物可具有至少一个手性中心并且因此可为立体异构体的形式，如使用于本文，其涵盖个别化合物的所有异构体，其仅不同在于它们的原子在空间的定向。用语立体异构体包括镜像异构体(包括化合物的(R-)或(S-)构型的对映异构体)、镜像异构体的混合物(对映异构体的物理混合物、外消旋体或外消旋混合物)、几何(顺式/反式或E/Z、R/S)化合物的异构体和具有一个以上手性中心且互不镜像的化合物的异构体(非对映异构体)。化合物的手性中心可能在体内发生差向异构化；因此，对于这些化合物，以(R-)形式给予化合物被认为与以(S-)形式给予化合物等效。因此，式I的双官能化合物可以以单独异构体的形式并且实质上不含其他异构体的形式，或以各种异构体的混合物的形式，例如立体异构体的外消旋混合物的形式制备和使用。

一些具体例中，式I的双官能化合物是同位素衍生物，因为它具有至少一个原子的所需同位素取代，其量高于同位素的天然丰度，亦即，被富集。一具体例中，该化合物包括氘或多个氘原子。用更重的同位素，亦即²H，替代可提供某些治疗优势，因为代谢稳定性更高，例如，体内半衰期增加或剂量要求降低，因此在某些情况下可能是有利的。

合成的方法

一些具体例中，本发明关于制造式I的双官能化合物或其医药可接受盐或立体异构物的方法。概括地，双官能化合物或其医药可接受盐类或立体异构物可通过已知适用于制备化学相关化合物的任何方法来制备结合各种操作具体例中描述的合成方案将更好地理解本发明的化合物，这些合成方案说明了可以制备本发明化合物的非限制性方法。

医药组成物

本发明的另一态样关于药物组合物，其包含治疗有效量的式I双官能化合物或其医药可接受盐或立体异构物，以及医药可接受的载体。本领域已知的术语“医药可接受的载体”是指适于将本发明的化合物施用于哺乳动物的医药可接受的材料、组合物或载体。合适的载体可以包括，例如，液体(水性和非水性的类似物，及其组合)、固体、封装材料、气体、以及它们的组合(例如，半固体)，以及发挥携带或运输作用的气体从一个器官或身体的一部分到另一个器官或身体的一部分的化合物。在对制剂的其他成分是生理学惰性的并且与制剂的其他成分相容并且对受试者或患者无害的意义上，载体是“可接受的”。取决于制剂的类型，组合物可包含一种或多种医药可接受的赋形剂。

概括地，式I的双官能化合物及其医药可接受盐及立体异构物可以根据常规药物实践例如常规混合、溶解、制粒、糖衣丸制造、研磨、乳化、包封，配制成给定类型的组合物、截留和压缩过程(参照如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy(20thed.),ed.A.R.Gennaro,Lippincott Williams&Wilkins,2000andEncyclopedia ofPharmaceutical Technology,eds.J.Swarbrick and J.C.Boylan,1988-1999,MarcelDekker,New York)。制剂的类型取决于投药方式，其中可能包括肠内(例如，口服、口腔、舌下和直肠)、肠胃外(例如，皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)和胸骨内注射，或输注技术、眼内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、经皮、皮间、阴道内、腹膜内、粘膜、鼻腔、气管内滴注、支气管滴注和吸入)和局部(如透皮)。一般而言，最合适的投药途径将取决于多种因素，包括例如药剂的性质(例如，其在胃肠道环境中的稳定性)、和/或受试者的状况(例如，受试者是否能够耐受口服投药)。例如，肠胃外(例如，静脉内)投药也可能是有利的，因为化合物可以相对快速地投药，例如在单剂量治疗和/或急性病症的情况下。

一些具体例中，双官能化合物配制用于口服或静脉内投药(如，全身性静脉内注射)。

因此，式I的双官能化合物可配制成固体组合物(如，粉剂、锭剂、分散粒剂、胶囊、扁囊剂和栓剂)、液体组合物(如，溶解化合物的溶液、分散化合物固体颗粒的悬浮液、乳液、和含有脂质体、胶束、或纳米颗粒、糖浆和酏剂)的溶液；半固体组合物(如，凝胶、悬浮液和乳膏)；和气体(例如，气雾剂组合物的推进剂)。还可配制化合物用于快速、中间或延长释放

用于口服投药的固体剂型包括胶囊、锭剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在此固体剂型中，活性化合物与载体如柠檬酸钠或磷酸二钙及额外的载体或赋形剂混合，如a)填充剂或填充剂如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，b)黏合剂，例如甲基纤维素、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，c)湿润剂，例如甘油，d)崩解剂，例如交联聚合物(例如，交联聚乙烯吡咯烷酮(交聚维酮)、交联羧甲基纤维素钠(交联羧甲基纤维素钠)、羟基乙酸淀粉钠、琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，e)溶液阻滞剂，如石蜡，f)吸收促进剂，例如四级铵化合物，g)湿润剂，例如鲸蜡醇及单硬脂酸甘油酯，h)吸收剂，例如高岭土和膨润土，和i)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠及其混合物。在胶囊、锭剂和丸剂的情况下，剂型还可以包括缓冲剂。类似类型的固体组合物也可用作软和硬填充明胶胶囊中的填充剂，使用赋形剂如乳糖或乳汁糖以及高分子量聚乙二醇等。锭剂、糖衣丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂等固体剂型可制成包衣和外壳，如肠溶衣和其他包衣。它们可进一步含有遮光剂。

一些具体例中，式I的双官能化合物可配制成硬或软明胶胶囊。可使用的代表性赋形剂包括预胶化淀粉、硬脂酸镁、甘露醇、富马酸硬脂酯钠、无水乳糖、微晶纤维素及交联羧甲基纤维素钠。明胶壳可包括明胶、二氧化钛、氧化铁及着色剂。

用于口服投药的液体剂型包括溶液剂、混悬剂、乳剂、微乳剂、糖浆剂及酏剂。除化合物外，液体剂型可含有本领域常用的水性或非水性载体(取决于化合物的溶解度)，例如水或其他溶剂、助溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油及芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇及脱水山梨糖醇的脂肪酸酯，以及其混合物。口服组合物也可包括赋形剂，例如湿润剂、悬浮剂、着色剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂。

肠胃外投药的可注射制剂可包括无菌水溶液或油质悬浮液。它们可以根据标准技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂进行配制。无菌注射制剂也可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液、混悬液或乳剂，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的载体及溶剂中包括水、林格氏溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，油酸等脂肪酸用于制备注射剂。可注射制剂可被灭菌，例如，通过细菌截留过滤器过滤，或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂，其可在使用前溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中。可通过减缓其吸收以延长化合物的作用，这可通过使用水溶性差的液体悬浮液或结晶或无定形材料来实现。还可通过将化合物悬浮在油性媒剂中以达成来自肠胃外投药制剂的化合物的延长吸收。

某些具体例中，式I的双官能化合物可以局部而非全身方式投药，例如，通过将复合物直接注射到器官中，通常以贮库制剂或缓释制剂的形式投药。特定具体例中，长效制剂通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射投药。可注射贮库形式是通过在生物可降解聚合物(例如聚丙交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐)中形成化合物的微囊基质制成的)。化合物的释放速率可通过改变化合物与聚合物的比例以及所使用的特定聚合物的性质来控制。长效注射制剂也可通过将化合物包裹在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。此外，其他具体例中，化合物在靶向药物递送系统中递送，例如在用器官特异性抗体包被的脂质体中。此类具体例中，脂质体靶向器官并被器官选择性吸收。

式I的双官能化合物可配置为用于口颊或舌下投药，其实例包括锭剂、口含定及凝胶。

式I的双官能化合物可配制为用于吸入投药。适合通过吸入投药的各种形式包括气雾剂、雾剂或粉末。药物组合物可使用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)从加压包或喷雾器以气雾剂喷雾形式递送。一些具体例中，加压气雾剂的剂量单位可通过提供阀门以递送计量量来确定。一些具体例中，包括明胶的胶囊和药筒，例如用于吸入器或吹入器中，可配制为含有化合物和合适的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。

式I的双官能化合物可配制用于局部投药，如本文所用，是指通过将制剂施用于表皮而皮内投药。这些类型的组合物通常为软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液和喷雾剂的形式。

可用于配制局部应用组合物的载体的代表性实例包括溶剂(例如醇、多元醇、水)、乳膏、洗剂、软膏、油、膏剂、脂质体、粉剂、乳液、微乳液和缓冲溶液(例如、低渗或缓冲盐水)。例如，可使用饱和或不饱和脂肪酸如硬脂酸、棕榈酸、油酸、棕榈油酸、鲸蜡醇或油醇配制乳膏。乳霜也可含有非离子表面活性剂，如聚氧40-硬脂酸酯。

一些具体例中，局部制剂还可包括赋形剂，其实例是渗透促进剂。这些药剂能够将药理活性化合物输送通过角质层并进入表皮或真皮，优选地，具有很少或无全身性吸收。已经评估了多种化合物在提高药物穿透皮肤的速度方面的有效性。参照，例如，PercutaneousPenetration Enhancers,Maibach H.I.and Smith H.E.(eds.),CRC Press,Inc.,BocaRaton,Fla.(1995)，其研究各种皮肤穿透增强剂的使用及测试，以及Buyuktimkin et al.,Chemical Means of Transdermal Drug Permeation Enhancement in Transdermal andTopical Drug Delivery Systems,Gosh T.K.,Pfister W.R.,Yum S.I.(Eds.),Interpharm Press Inc.,Buffalo Grove,Ill.(1997)。渗透增强剂的代表性实例包括甘油三酯(例如，大豆油)、芦荟组合物(例如，芦荟凝胶)、乙醇、异丙醇、辛基苯基聚乙二醇、油酸、聚乙二醇400、丙二醇、N-癸基甲基亚砜、脂肪酸酯(例如肉荳蔻酸异丙酯、月桂酸甲酯、甘油单油酸酯和丙二醇单油酸酯)和N-甲基吡咯烷酮。

可包含在局部以及其他类型的制剂中(在它们相容的范围内)的其他赋形剂的代表性实例包括防腐剂、抗氧化剂、保湿剂、润肤剂、缓冲剂、助溶剂、皮肤保护剂、和表面活性剂。合适的防腐剂包括醇、四级胺、有机酸、对羟基苯甲酸酯及酚类。合适的抗氧化剂包括抗坏血酸及其酯、亚硫酸氢钠、丁基化羟基甲苯、丁基化羟基茴香醚、生育酚和螯合剂如EDTA和柠檬酸。合适的保湿剂包括甘油、山梨糖醇、聚乙二醇、尿素及丙二醇。合适的缓冲剂包括柠檬酸、盐酸和乳酸缓冲剂。合适的助溶剂包括四级铵氯化物、环糊精、苯甲酸芐酯、卵磷脂和聚山梨醇酯。合适的皮肤保护剂包括维生素E油、阿拉托因(allatoin)、聚二甲基硅氧烷、甘油、凡士林和氧化锌。

穿皮制剂透皮制剂通常使用穿皮递送装置和穿皮递送贴剂，其中将化合物配制在亲脂乳液或缓冲水溶液中，溶解和/或分散在聚合物或黏合剂中。可以构建贴剂以用于药剂的连续、脉动或按需递送。化合物的透穿皮递送可以通过离子电渗贴剂达成。穿皮贴剂可以提供化合物的受控递送，其中通过使用速率控制膜或通过将化合物捕获在聚合物基质或凝胶中来减慢吸收速率。吸收促进剂可用于增加吸收，其实例包括帮助经由皮肤的可吸收的医药可接受的溶剂。

眼科制剂包括滴眼剂。

用于直肠投药的制剂包括灌肠剂、直肠凝胶、直肠泡沫、直肠气雾剂和保留灌肠剂，其可含有常规栓剂基质，例如可可脂或其他甘油酯，以及合成聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮、PEG等。用于直肠或阴道投药的组合物也可配制成栓剂，其可以通过将化合物与合适的非刺激性载体和赋形剂混合而制备，例如可可脂、脂肪酸甘油酯的混合物、聚乙二醇、栓剂蜡及其组合，其所有者在环境温度为固体，但在体温为液体，因此在直肠或阴道腔中融化并释放化合物。

剂量

如使用于本文，用语"医疗有效量"意指式I的双官能化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体，或包含式(I)的双官能化合物或其医药可接受盐或立体异构物的组合物的量，即有效地在患有疾病或病症的特定患者中产生期望的治疗反应。用语“治疗有效量”因此包括本发明的化合物或其医药可接受盐或立体异构物的量，其在施用时诱导待治疗的疾病或病症的积极改变，或足以防止发展或疾病或病症的进展，或在一定程度上减轻在受试者中治疗的疾病或病症的一种或多种症状，或简单地杀死或抑制患病(例如，癌症)细胞的生长，或减少患病细胞中AKT1、2和3的数量。

化合物的总日剂量及其用法可以根据标准医学实施来决定，例如，由主治医师使用合理的医学判断来决定。对任何特定受试者的特定治疗有效剂量可能取决于多种因素，包括所治疗的疾病或病症及其严重程度(例如，其现状)；受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所使用的特定化合物的投药时间、投药途径和排泄率；治疗的持续时间；与所使用的特定化合物组合使用或同时使用的药物；以及医学领域众所周知的类似因素(参照，例如，Goodman and Gilman's,ThePharmacological Basis of Therapeutics,10thEdition,A.Gilman,J.Hardman and L.Limbird,eds.,McGraw-Hill Press,155-173,2001)。

式I的双官能化合物可在很宽的剂量范围内有效。一些具体例中，总日剂量(例如，对于成年人)可以在约0.001至约1600mg、0.01至约1600mg、0.01至约500mg、约0.01至约100mg、约0.5至约100mg、1至约100-400mg/天、约1至约50mg/天和约5至约40mg/天，或在其他实施方案中约10至约30mg每天。一些具体例中，每日总剂量可能从400毫克到600毫克不等。根据化合物每天投药的次数，可以配制单独的剂量以含有所需的剂量。例如，胶囊可以用约1至约200mg的化合物(如，1、2、2.5、3、4、5、10、15、20、25、50、100、150和200毫克0一些具体例中，根据化合物每天投药的次数，可以配制单独的剂量以含有所需的剂量。

使用方法

一些态样中，本发明关于治疗涉及AKT活性功能障碍或失调的疾病或病症的方法，其需要向有需要的受试者投药治疗有效量的式I双功能化合物或其医药可接受盐或立体异构体物。

疾病或疾患可以说是由功能失调的AKT活性表征或介导的(例如，相对于非病理状态，AKT水平升高或其他功能异常的AKT)。“疾病”通常被认为是受试者的健康状态，其中受试者不能维持体内平衡，并且其中如果疾病没有改善则受试者的健康继续恶化。相比之下，受试者的“疾病”是一种健康状态，其中受试者能够维持体内平衡，但受试者的健康状况不如没有疾病时的健康状态。如果不加以治疗，疾病不一定会导致动物健康状况进一步下降。

用语“受试者(subject)”(或“患者(patient)”)如使用于本文，包括易于或患有指定疾病或疾患的动物界的所有成员。一些具体立中，受试者是哺乳动物，例如人或非人哺乳动物。该方法也适用于狗、猫等伴侣动物以及牛、马、绵羊、山羊、猪等家畜和其他驯养和野生动物。根据本发明“需要”治疗的受试者可能“患有或怀疑患有”特定疾病或疾患，可能已被阳性诊断或以其他方式呈现足够数量的风险因素或足够数量或体征或症状的组合，使得医疗专业人员可以诊断或怀疑受试者患有疾病或疾患。因此，患有和怀疑患有特定疾病或疾患的受试者不一定是两个不同的群体。

一些具体例中，式I化合物可用于治疗细胞增生疾病和疾患(例如，癌症或良性肿瘤)。如本文所用，用语“细胞增生疾病或疾患”是指以细胞生长失调或异常或两者兼有为特征的病症，包括非癌病症，例如肿瘤、癌前病症、良性肿瘤和癌症。

可以用本发明的化合物治疗的非癌性(例如，细胞增生)疾病或病症的例示性类型包括炎性疾病和疾患、自身免疫性疾病、神经变性疾病、心脏病、病毒性疾病、慢性和急性肾脏疾病或损伤、代谢疾病以及过敏和遗传疾病。

特定非癌性疾病和病症的代表性实例包括类风湿性关节炎、斑秃、淋巴组织增生病症、自身免疫性血液病(例如，溶血性贫血、再生障碍性贫血、无汗性外胚层发育不良、纯红细胞性贫血和特发性血小板减少症)、胆囊炎、肢端肥大症、类风湿性脊柱炎、骨关节炎、痛风、硬皮病、败血症、败血性休克、泪腺炎、冷吡啉相关周期性症候群(CAPS)、内毒素性休克、子宫内膜炎、革兰氏阴性败血症、干燥性角结膜炎、呼吸性休克症候群、哮喘、成人窘迫症候群慢性阻塞性肺病、慢性肺部炎症、慢性移植排斥、化脓性汗腺炎、炎症性肠病、克隆氏症、贝塞氏症候群、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、多发性硬化症、幼年型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性血管炎、甲状腺炎、艾迪生病、扁平苔藓、阑尾炎、大疱性天疱疮、天疱疮、副叶天疱疮肾病、桥本氏病、干燥症候群、白斑病、韦格纳肉芽肿、肉芽肿性睾丸炎、自身免疫性卵巢炎、结节病、风湿性心脏炎、强直性脊柱炎、格雷夫氏病、自身免疫性血小板减少性紫癜、银屑病性纤维瘤、溃疡性银屑病、溃疡性溃疡性关节炎、肝炎、肝纤维化、CD14介导的败血症、非CD14介导的败血症、急慢性肾病、肠易激症候群、发热、再狭窄、宫颈炎、中风和缺血性损伤、神经创伤、急慢性疼痛、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、慢性心衰竭、充血性心力衰竭、急性冠脉症候群、恶病质、疟疾、麻风病、利甚曼病、莱姆病、Reiter症候群、急性滑膜炎、肌肉退化、滑囊炎、肌腱炎、腱鞘炎、椎间盘突出、破裂或脱垂的椎间盘症候群、骨硬化症、鼻窦炎、血栓形成、硅肺、肺肌肉病、骨吸收疾病，如骨质疏松症、纤维肌痛和其他病毒、艾滋病疾病，如带状疱疹、单纯疱疹I或II、流感病毒和巨细胞病毒、I型和II型糖尿病、肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病视网膜病变、22q11.2缺失症候群、Angelman症候群、Canavan病、乳糜泻、Charcot-Marie-牙齿疾病、色盲、猫叫症候群(Cri du chat)、唐氏症候群、囊性纤维化、杜兴氏肌营养不良症、血友病、克氏综合症、神经纤维瘤病、苯丙酮尿症、Prader-Willi综合症、镰状细胞病、Tay-Sachs病、特纳综合症、尿素循环障碍、地中海贫血、中耳炎、胰腺炎、腮腺炎、心包炎、腹膜炎、咽炎、胸膜炎、静脉炎、肺炎、葡萄膜炎、多肌炎是直肠炎、间质性肺纤维化、皮肌炎、动脉粥样硬化、动脉硬化、肌萎缩侧索硬化、社交障碍、静脉曲张、阴道炎、抑郁症和婴儿猝死综合症。

其他具体例中，该方法涉及治疗患有癌症的受试者。概括地，本发明的化合物可有效治疗癌症(实体瘤，包括原发性和转移性肿瘤)、肉瘤、黑色素瘤和血液癌症(影响血液的癌症，包括淋巴细胞、骨髓和/或淋巴结)，例如如白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。癌症可以是血管化的，或尚未基本上血管化的，或非血管化的肿瘤。

癌症的代表性实例包括肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症(例如，卡波西和AIDS相关淋巴瘤)、阑尾癌、儿童癌症(例如，儿童小脑星形细胞瘤、儿童脑星形细胞瘤)、基底细胞癌、皮肤癌(非黑色素瘤)、胆管癌、肝外胆管癌、肝内胆管癌、膀胱癌、膀胱癌、脑癌(例如，胶质瘤和胶质母细胞瘤，如脑干胶质瘤、妊娠滋养细胞肿瘤胶质瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、类癌、神经系统癌症(例如中枢神经系统癌、中枢神经系统淋巴瘤)、宫颈癌、慢性骨髓增生性疾病、结直肠癌(如结肠癌、直肠癌)、淋巴肿瘤、蕈状肉芽肿、Sezary症候群、子宫内膜癌、食道癌、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃肠癌(例如胃癌、小肠癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(GIST))、胆管癌、生殖细胞肿瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、头颈癌、神经内分泌肿瘤、霍奇金淋巴瘤、安娜堡III期和IV期儿童非霍奇金淋巴瘤、ROS1阳性难治性非霍奇金淋巴瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、眼癌、胰岛细胞瘤(内分泌胰腺)、肾癌(如威尔姆氏瘤、肾细胞癌)、肝癌、肺癌(如非小细胞肺癌和小细胞肺癌))、ALK阳性间变性大细胞淋巴瘤、ALK阳性晚期恶性实体肿瘤、华氏巨球蛋白瘤、黑色素瘤、眼内(眼)黑色素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、转移性鳞状颈癌伴隐匿性原发性多发性内分泌瘤(MEN)，骨髓增生异常症候群、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌(例如口腔癌、唇癌、口腔癌、舌癌)癌、口咽癌、喉癌、喉癌)、卵巢癌(例如，卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤)、胰腺癌、胰岛细胞胰腺癌、鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体细胞瘤、转移性未分化甲状腺癌、未分化甲状腺癌、甲状腺乳头状癌、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、子宫癌(例如子宫内膜癌、子宫肉瘤、子宫体癌)、鳞状细胞癌、睾丸癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、幼年黄色肉芽肿肾盂和输尿管等泌尿器官移行细胞癌、尿道癌、妊娠滋养细胞肿瘤、阴道癌、外阴癌、肝母细胞瘤、横纹肌样瘤、威尔姆式瘤。

可用本发明的双官能化合物治疗的肉瘤包括软组织癌和骨癌，其代表性实例包括骨肉瘤或成骨肉瘤(骨)(例如尤文氏肉瘤)、软骨肉瘤(软骨)、平滑肌肉瘤(平滑肌)、横纹肌肉瘤(骨骼肌)、间皮肉瘤或间皮瘤(体腔的膜内衬)、纤维肉瘤(纤维组织)、血管肉瘤或血管内皮瘤(血管)、脂肪肉瘤(脂肪组织)、胶质瘤或星状细胞源性结缔组织见于大脑)、黏液肉瘤(原始胚胎结缔组织)、间充质或混合中胚层肿瘤(混合结缔组织类型)和组织细胞肉瘤(免疫癌)。

一些具体例中，本发明的方法需要治疗患有血液系统、肝、脑、肺、结肠、胰腺、前列腺、皮肤、卵巢、乳房、皮肤和子宫内膜的细胞增生疾病或疾患的受试者。

如使用于本文，“血液系统的细胞增生疾病或病症”包括淋巴瘤、白血病、髓样肿瘤、肥大细胞肿瘤、骨髓增生异常、良性单株γ蛋白病、淋巴瘤样丘疹病、真性红细胞增多症、慢性粒细胞白血病、不明原因的髓样化生和原发性血小板增多症。因此，血液癌症的代表性实例可包括多发性骨髓瘤、淋巴瘤(包括T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤(MCL)和ALK+间变性大细胞淋巴瘤(例如，选自弥漫性大B细胞淋巴瘤的B细胞非霍奇金淋巴瘤(例如，生长中心B细胞样弥漫性大B细胞淋巴瘤或活化的B细胞样弥漫性大B-细胞淋巴瘤)、伯基特淋巴瘤/白血病、套细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤/华氏巨球蛋白血症、转移性胰腺癌、难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤和复发性B细胞非霍奇金淋巴瘤、儿童淋巴瘤和淋巴细胞和皮肤来源的淋巴瘤，例如小淋巴细胞淋巴瘤、白血病，包括儿童白血病、毛细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性髓细胞白血病(例如，急性单核细胞白血病)、慢性淋巴细胞白血病、小淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病和肥大细胞白血病、髓细胞肿瘤和肥大细胞肿瘤。

如使用于本文，“肝脏的细胞增生疾病或病症”包括影响肝脏的所有形式的细胞增生疾患。肝脏的细胞增生疾患可包括肝癌(例如，肝细胞癌、肝内胆管癌和肝母细胞瘤)、肝脏的癌前病变或癌前病变、肝脏的良性生长或病变、肝脏的恶性生长或病变以及肝脏以外的组织和器官中的转移性病变。肝脏的细胞增生疾患可包括肝脏的增生、化生和发育不良。

如使用于本文，“脑的细胞增生疾病或病症”包括影响脑的所有形式的细胞增生疾患。脑细胞增生疾患可包括脑癌(例如，神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤和原始神经外胚层肿瘤(髓母细胞瘤))、脑的癌前病变或癌前病变、脑的良性生长或病变，以及脑部的恶性生长或病变，以及除脑以外的组织和器官中的转移性病变。脑的细胞增生疾患可包括脑的增生、化生和发育不良。

如使用于本文，“肺的细胞增生疾病或病症”包括影响肺细胞的所有形式的细胞增生疾患。肺细胞增生疾患包括肺癌、肺的癌前病变和癌前病变、肺的良性生长或病变、肺的增生、化生和发育不良，以及肺以外的组织和器官中的转移性病变。肺癌包括所有形式的肺癌，例如，恶性肺肿瘤、原位癌、典型类癌和非典型类癌。肺癌包括小细胞肺癌(“SLCL”)、非小细胞肺癌(“NSCLC)、腺癌、小细胞癌、大细胞癌、鳞状细胞癌和间皮瘤。肺癌可包括“瘢痕癌”、细支气管癌、巨细胞癌、梭形细胞癌和大细胞神经内分泌癌。肺癌还包括具有组织学和超微结构异质性(例如，混合细胞类型)的肺肿瘤。一些具体中，本发明的化合物可用于治疗非转移性或转移性肺癌(例如NSCLC、ALK阳性NSCLC、携带ROS1重排的NSCLC、肺腺癌和鳞状细胞肺癌)。

如使用于本文，“结肠的细胞增生疾病或病症”包括影响结肠细胞的所有形式的细胞增生疾患，包括结肠癌、结肠癌前病变或癌前病变、结肠腺瘤性息肉和结肠异时性病变。结肠癌包括散发性和遗传性结肠癌、恶性结肠肿瘤、原位癌、典型类癌和非典型类癌、腺癌、鳞状细胞癌和鳞状细胞癌。结肠癌可能与遗传性症状有关，例如遗传性非息肉性结直肠癌、常见的腺瘤性息肉病、MYH相关息肉病、Gardner症候群、Peutz-Jeghers症候群、Turcot症候群和幼年性息肉病。结肠细胞增生疾患的特征还在于结肠的增生、化生或发育不良。

如使用于本文，“胰的细胞增生疾病或病症”包括影响胰细胞的所有形式的细胞增生疾患。胰细胞增增生疾患可包括胰癌、胰癌前病变或癌前病变、胰增生、胰发育不良、胰良性生长或病变、在胰以外的身体组织和器官中的恶性生长或病变以及转移性病变。胰癌包括所有形式的胰癌，包括导管腺癌、腺鳞癌、多形性巨细胞癌、黏液腺癌、破骨细胞样巨细胞癌、黏液性囊腺癌、腺泡癌、未分类的大细胞癌、小细胞癌、胰腺母细胞瘤、乳头状肿瘤、黏液性囊腺瘤、乳头状囊性肿瘤和浆液性囊腺瘤，以及具有组织学和超微结构异质性(例如，混合细胞)的胰肿瘤。.

如使用于本文，“前列腺的细胞增生疾病或病症”包括影响前列腺的所有形式的细胞增生疾患。前列腺的细胞增生疾患可包括前列腺癌、前列腺的癌前病变或癌前病变、前列腺的良性生长或病变、前列腺的恶性生长或病变，以及前列腺以外的组织和器官的转移性病变前列腺的细胞增生疾患可包括前列腺的增生、化生和发育不良。

如使用于本文，“卵巢的细胞增生疾病或病症”包括影响卵巢细胞的所有形式的细胞增生疾患。卵巢的细胞增生疾患可以包括卵巢的癌前病变或癌前病变、卵巢的良性生长或病变、卵巢癌和身体中除卵巢以外的组织和器官中的转移性病变。卵巢的细胞增生疾患可包括卵巢的增生、化生和发育不良。

如使用于本文，“乳房的细胞增生疾病或病症”包括影响乳房细胞的所有形式的细胞增生疾患。乳房的细胞增生疾患可包括乳癌、乳房的癌前病变或癌前病变、乳房的良性生长或病变、以及除乳房以外的身体组织和器官中的转移病变。乳房的细胞增生疾患可包括乳房的增生、化生和发育不良。

如使用于本文，”皮肤的细胞增生疾病或病症”包括影响皮肤细胞的所有形式的细胞增生疾患。皮肤的细胞增生疾患可能包括皮肤的癌前或癌前状态、皮肤良性生长或病变、黑色素瘤、恶性黑色素瘤或其他恶性皮肤生长或病变、转移性组织和器官病变在皮肤以外的身体中。皮肤的细胞增生疾患可包括皮肤增生、化生和发育不良。

如使用于本文，“子宫内膜的细胞增生疾病或病症”包括影响子宫内膜细胞的所有形式的细胞增生疾病。细胞增生的子宫内膜疾病可以包括子宫内膜的癌前病变或癌前病变、子宫内膜的良性生长或病变、子宫内膜癌以及子宫内膜以外的身体组织和器官的转移性病变。子宫内膜的细胞增生疾患可包括子宫内膜增生、化生和发育不良。

一些具体例中，本发明的化合物或医药可接受盐类或立体异构物用于治疗高风险神经母细胞瘤(NB).

一些具体例中，该疾病或病症为急性髓系白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、或弥漫性大B细胞癌。其他具体例中，疾病或病症为小实体瘤。其他具体例中，疾病或病症为结肠癌、直肠癌、胃癌、乳癌或胰腺癌。

式(I)的双官能化合物可以作为单一疗法或通过联合疗法的方式施用于患者，例如癌症患者。治疗可以是“前线/一线”，即作为未接受过先前抗癌治疗方案的患者的初始治疗，单独或与其他治疗联合；或“二线”，作为治疗既往接受过抗癌治疗方案的患者，单独或联合其他治疗；或作为“三线”、“四线”等治疗，单独或与其他治疗联合。也可以对先前接受过不成功或部分成功但对特定治疗不耐受的治疗的患者进行治疗。治疗也可以作为辅助治疗给予，即预防目前没有可检测疾病的患者或手术切除肿瘤后癌症的复发。因此，对于已经接受过另一种疗法的患者，如化疗、放免疫疗法、手术疗法、免疫疗法、放射疗法、靶向疗法或其任何组合，可以给予一些双官能化合物。

一些具体例中，本发明的化合物或医药上可接受的盐或立体异构物，可单独用于治疗三阴性乳癌，或与紫杉醇等化疗剂合用。

本发明的方法可能需要以单剂量或多剂量(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20或更多剂量)。例如，投药频率可以从一天一次到大约每八周一次。具体的一些例子中，投药频率范围从大约每天一次持续1、2、3、4、5、或6周，在其他实施例中需要28天的周期，包括每天投药3周(21天)。其他具体例子中，双官能化合物可以一天两次(BID)，分两天半(共5剂)或一天一次(QD)，分两天(共2剂)。其他具体例子中，双官能化合物可以在五天的疗程中每天投药一次(QD)。

组合疗法

式I的双官能化合物可以与至少一种其他活性剂例如抗癌剂或方案组合或同时用于治疗疾病和病症。用语“组合”和“同时”在本文中是指共同投药，包括基本上同时投药，通过相同或不同的剂型，通过相同或不同的投药方式，或依序，例如，作为同一治疗方案的一部分，或通过连续的治疗方案。因此，如果在开始施用第二种化合物时相继投药，则两种化合物中的第一种在某些情况下在治疗部位仍可检测到有效浓度。可决定顺序和时间间隔，使得它们可以一起作用(如，协同作用以提供比以其他方式施用时增加的益处)。例如，治疗剂可以在不同时间点同时或以任何顺序依次投药；然而，如果不是同时投药，它们可以在足够接近的时间投药以提供期望的治疗效果，这可能是一种协同方式。因此，用语不限于在完全相同的时间投药活性剂。

一些具体例中，治疗方案可以包括与一种或多种已知用于治疗疾病或病症(例如，癌症)的其他疗法组合施用式I的化合物。额外的抗癌治疗剂的剂量可能与已知或推荐剂量相同甚至更低。参照，Hardman et al.,eds.,Goodman&Gilman's The PharmacologicalBasis Of Basis Of Therapeutics,10th ed.,McGraw-Hill,New York,2001；Physician'sDesk Reference 60th ed.,2006。举例而言，所属技术领域已知抗癌剂可与本发明化合物组合使用。参照，如美国专利第9,101,622号(其5.2节)及美国专利第Patent 9,345,705B2号(其12至18栏)。额外的活性剂和治疗方案的代表性实例包括放射疗法、化学治疗剂(例如，有丝分裂抑制剂、血管生成抑制剂、抗激素、自噬抑制剂、烷化剂、嵌入抗生素、生长因子抑制剂、抗雄激素、信号转导通路抑制剂、抗-微管剂、铂配位复合物、HDAC抑制剂、蛋白酶体抑制剂和拓扑异构酶抑制剂)、免疫调节剂、治疗性抗体(例如，单特异性和双特异性抗体)和CAR-T疗法。

一些具体例中，式I的双官能化合物和额外的抗癌治疗剂可以相隔少于5分钟、相隔少于30分钟、相隔少于1小时、相隔约1小时、相隔约1至约2小时、相隔约2小时至约3小时，相隔约3小时至约4小时，相隔约4小时至约5小时，相隔约5小时至约6小时，相隔约6小时至约7小时，相隔约7小时约至约8小时，相隔约8小时至约9小时，相隔约9小时至约10小时，相隔约10小时至约11小时，相隔约11小时至约12小时，相隔约12小时至18小时，相隔18小时至24小时，相隔24小时至36小时，相隔36小时至48小时，相隔48小时至52小时，相隔52小时至60小时，相隔60小时至72小时，相隔72小时相隔84小时，相隔84小时至96小时，或相隔96小时至120小时。两种或更多种抗癌治疗剂可以在同一次患者就诊中投药。

一些具体例中，式I的双官能化合物和额外的药剂或治疗剂(例如，抗癌治疗剂)被循环施用。循环疗法包括在一段时间内给予一种抗癌治疗剂，然后在一段时间内给予第二种抗癌治疗剂，并重复这种顺序投药，即循环，以减少对一种或两种抗癌疗法的耐药性发展，以避免或减少一种或两种抗癌疗法的副作用，和/或提高疗法的功效一实例中，循环疗法包括施用第一种抗癌治疗剂一段时间，然后施用第二种抗癌治疗剂一段时间，任选地，随后施用第三种抗癌治疗剂一段时间等等，并重复这种顺序投药，即循环以减少对其中一种抗癌疗法的耐药性的发展，以避免或减少其中一种抗癌疗法的副作用，和/或改善抗癌疗法的疗效。

一些具体例中，式I的双官能化合物可与其他抗癌药物组合使用，例如曲美替尼(Trametinib)(如，治疗复发性和未经治疗的成人急性髓系白血病、乳癌、浆细胞骨髓瘤、子宫内膜腺癌、子宫体癌、黑色素瘤、子宫颈癌)、达拉菲尼(Dabrafenib)和曲美替尼(如，治疗成人实体瘤、复发性结肠癌、复发性黑色素瘤、复发性卵巢癌、结肠癌和皮肤黑色素瘤、二甲苯磺酸拉帕替尼(Lapatinib Ditosylate)(如，治疗雌激素受体(ER)+/-乳腺癌、HER/Neu+乳腺癌，孕酮受体(PR)+/-乳腺癌)、GSK1120212(如，治疗蛋白酶体难治性多发性骨髓瘤、子宫内膜癌和三阴性乳腺癌)、司美替尼(Selumetinib)(如，治疗黑色素瘤、胆囊腺癌、原发性胆管细胞癌、肝癌)、肝外胆管胆管癌、转移性肝外胆管癌、胆囊癌、胰腺泡细胞癌、胰导管腺癌和胰癌)、盐酸苯达莫司汀(Bendamustine Hydrochloride)及利妥昔单抗(Rituximab)(如，治疗淋巴细胞白血病)、迪那西利(Dinaciclib)(如，治疗胰癌)、羟氯喹(如，治疗晚期实体瘤、黑色素瘤、前列腺癌或肾癌)、奥拉帕利(Olaparib)(如，治疗乳腺癌和恶性肿瘤)、厄洛替尼盐酸盐(Erlotinib Hydrochloride)(如，治疗腺鳞癌、细支气管肺泡癌、大细胞肺癌、肺腺癌、非小细胞肺癌和鳞状细胞肺癌)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)和二甲苯磺酸拉帕替尼(如，治疗胃食管交界处的腺癌、HER2阳性乳腺癌、食管癌、胃癌)、依维莫司(Everolimus)(如，治疗肾细胞癌)、比卡鲁胺(Bicalutamide)(如，治疗前列腺癌)、阿那曲唑(Anastrozole)及乙酸戈舍瑞林(Goserelin Acetate)(如，治疗乳腺癌)、阿那曲唑和氟维司群(Fulvestrant)(如，治疗乳腺癌)、阿那曲唑(如，治疗卵巢癌和子宫内膜癌)、紫杉醇(如，治疗实体瘤、卵巢癌、子宫内膜癌和乳腺癌)癌)、曲美替尼和乌普色替(Uprosertib)(如，治疗葡萄膜黑色素瘤)、硼替佐米及地塞米松(如，治疗多发性骨髓瘤)、MK-2206(如，治疗结直肠肿瘤)、紫杉醇及曲妥珠单抗(如，治疗人类表皮生长因子受体2(HER2)-过度表达的实体瘤恶性肿瘤)、依西美坦(Exemestane)和戈舍瑞林(如，治疗乳腺癌)、吉西他滨(Gemcitabine)(如，治疗实体瘤和非霍奇金淋巴瘤)、多西他赛(Docetaxel)和泼尼松龙(如，治疗前列腺癌)、卡铂(Carboplatin)和紫杉醇(如，用于治疗对铂耐药的卵巢癌、子宫内膜癌)、吉非替尼(Gefitinib)(如，用于治疗非小细胞肺癌)、卡铂(如，用于治疗卵巢癌)、Cobimetinib(如，治疗肿瘤)、氟维司群(如治疗乳腺癌)和奥沙利铂(Oxaliplatin)、5-氟尿嘧啶和亚叶酸(改良的FOLFOX6[mFOLFOX6]，例如治疗晚期或转移性胃癌或胃食管交界处(GEJ)癌)。

医药试剂盒

本发明双官能化合物和/或含有这些化合物的组合物可以组装成试剂盒或药物系统。根据本发明该态样的试剂盒或药物系统包括载体或包装，例如盒子、纸箱、管等，其中具有一个或多个容器，例如小瓶、管、安瓿或瓶子，它们被严密限制含有式I化合物或其药物组合物。本发明的试剂盒或药物系统还可包括使用化合物和组合物的印刷说明。

考虑以下实施例将进一步理解本发明的这些和其他态样，这些实施例旨在说明本发明的某些特定具体例，但并不旨在限制其范围，如权利要求书所定义。

[实施例]

实施例1:合成(2S,4R)-1-((S)-2-(3-(3-(((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-((R)-5-甲 基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)胺基)丙氧基)丙酰胺 基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯啶-2- 羧酰胺(1)。

(R)-5-甲基-4-(哌嗪-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶二盐酸盐

对1,4-二恶烷(2.7mL)及DCM(300μL)的溶液添加(R)-4-(5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-羧酸第三-丁基酯(250mg,0.79mmol)及于1,4-二恶烷的4M HCl(1mL)。反应搅拌5小时。反应混合物于真空浓缩以获得粗制(R)-5-甲基-4-(哌嗪-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶二盐酸盐呈浅褐色固体(230mg,定量性收率)，其使用而无进一步纯化。

MS m/z 219.16[M+H]⁺

方案1.合成化合物1.

((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-((R)-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]-嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)胺基甲酸第三-丁基酯

对(R)-5-甲基-4-(哌嗪-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊并-[d]嘧啶二盐酸盐(230mg,0.79mmol)、(S)-3-((第三-丁氧基羰基)胺基)-2-(4-氯苯基)丙酸(260mg,0.87mmol)及1-[双(二甲基胺基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟-磷酸盐(HATU)(299mg,0.79mmol)于DMF(5.5mL)的溶液添加N,N-二异丙基乙基胺(DIEA)(686μL,3.93mmol)。反应搅拌1小时。反应以乙酸乙酯稀释且以盐水清洗(10mL x 4)。汇集的有机层以无水硫酸钠干燥，且于真空浓缩。粗制残质通过柱层析于硅胶纯化(0-10％MeOH于DCM中)以给出((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-((R)-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)胺基甲酸第三-丁基酯(375mg,95％收率)呈黄色油。

MS m/z 500.26[M+H]⁺.

(S)-3-胺基-2-(4-氯苯基)-1-(4-((R)-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]-嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)丙烷-1-酮

对((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-((R)-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)胺基甲酸第三-丁基酯(375mg,0.75mmol)于1,4-二恶烷(4mL)中的溶液添加于1,4-二恶烷(1.5mL)的4M HCl。反应搅拌2小时。反应混合物于真空浓缩。粗制残质溶解于4:1氯仿:异丙醇且以水性(aq.)饱和(sat.)NaHCO₃清洗。有机层以4:1氯仿:异丙醇(20mL x 3)萃取，于无水硫酸钠干燥，且于真空浓缩。获得粗制(S)-3-胺基-2-(4-氯苯基)-1-(4-((R)-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)丙烷-1-酮(299mg,定量性收率)呈黄色泡沫。

MS m/z 400.20[M+H]⁺.

3-(3-(((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-((R)-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]-嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)胺基)丙氧基)丙酸第三-丁基酯

对(S)-3-胺基-2-(4-氯苯基)-1-(4-((R)-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)丙烷-1-酮(74mg,0.19mmol)及3-(3-侧氧基丙氧基)丙酸第三-丁基酯(29mg,0.14mmol)添加二氯乙烷(DCE)(3.8mL)且反应于室温搅拌20分钟。添加一份三乙酰氧基硼氢化钠Sodium triacet氧基borohydride(STAB)(60mg,0.28mmol)添加且反应搅拌15小时。反应以饱和NaHCO₃(aq)猝冷且以4:1氯仿:异丙醇(10mL x 3)萃取。粗制物通过柱层析于硅胶纯化(0-20％MeOH于DCM)以获得3-(3-(((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-((R)-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)胺基)-丙氧基)丙酸第三-丁基酯(27mg,32％收率)呈黄色油。

MS m/z 586.35[M+H]⁺.

3-(3-(((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-((R)-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)胺基)丙氧基)丙酸二盐酸盐

对3-(3-(((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-((R)-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)胺基)丙氧基)丙酸第三-丁基酯(27mg,0.05mmol)添加1,4-二恶烷(750μL)及于1,4-二恶烷的4M HCl(250μL)。反应搅拌5小时。反应混合物于真空浓缩以获得粗制3-(3-(((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-((R)-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)胺基)丙氧基)丙酸(22mg,79％收率)呈二盐酸盐。

MS m/z 530.30[M+H]⁺.

对3-(3-(((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-((R)-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]-嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)胺基)丙氧基)丙酸二盐酸盐(22mg,0.03mmol)、(2S,4R)-1-((S)-2-胺基-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯啶-2-羧酰胺盐酸盐(16mg,0.03mmol)及HATU(13mg,0.03mmol)添加DMF(1mL)及DIEA(35μL,0.2mmol)。反应搅拌1小时且通过逆相HPLC纯化(25-85％MeOH于H₂O中)以获得化合物1呈灰白色(3.5mg,11％收率)。

1H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ8.91(d,J＝1.7Hz,1H),8.32-8.26(m,2H),7.83(d,J＝9.3Hz,1H),7.43-7.39(m,2H),7.38-7.35(m,2H),7.32-7.28(m,4H),5.06(s,1H),4.85(q,J＝7.1Hz,1H),4.47(d,J＝2.1Hz,1H),4.36(t,J＝12.7Hz,2H),4.21(s,1H),3.67-3.58(m,2H),3.51(ddt,J＝15.7,9.0,4.9Hz,6H),3.39(dtd,J＝18.9,9.4,4.0Hz,6H),2.97(d,J＝11.2Hz,2H),2.86(s,2H),2.75(dt,J＝17.1,8.4Hz,1H),2.66-2.60(m,1H),2.51-2.45(m,1H),2.38(d,J＝1.5Hz,3H),2.29(dt,J＝14.7,6.0Hz,2H),2.11(dq,J＝12.7,8.6Hz,2H),1.95(t,J＝10.5Hz,1H),1.73(tt,J＝8.3,4.7Hz,3H),1.51(ddt,J＝12.9,8.6,4.1Hz,1H),1.30(d,J＝7.0Hz,3H),0.97(d,J＝6.7Hz,3H),0.86(s,9H).

MS m/z 956.51[M+H]⁺.哚

实施例2:合成合成N-(3-(((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-((5R,7R)-7-羟基-5-甲基- 6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)-胺基)丙基)-2-((2-(2, 6-二侧氧基哌啶-3-基)-1,3-二侧氧基异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺(2)。

方案2.合成中间体1(Int-1).

4-((5R,7R)-7-羟基-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)-哌嗪-1-羧酸第三-丁基酯

起始物质4-((5R,7R)-7-羟基-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-羧酸第三-丁基酯根据报导于WO2008006032A1的步骤而制备。

(5R,7R)-5-甲基-4-(哌嗪-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-7-醇二盐酸盐

对4-((5R,7R)-7-羟基-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-羧酸第三-丁基酯(426mg,1.27mmol)于1,4-二恶烷(7.5mL)及DCM(1mL)的溶液添加于1,4-二恶烷的4M HCl(2.5mL)的4M HCl。反应搅拌16小时。反应混合物于真空浓缩以获得粗制(5R,7R)-5-甲基-4-(哌嗪-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-7-醇(373mg,定量性收率)呈二盐酸盐。

MS m/z 235.21[M+H]⁺。

((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-((5R,7R)-7-羟基-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)胺基甲酸第三-丁基酯

对(5R,7R)-5-甲基-4-(哌嗪-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-7-醇二盐酸盐(277mg,0.9mmol)、(S)-3-((第三-丁氧基羰基)-胺基)-2-(4-氯苯基)丙酸(270mg,0.9mmol)及HATU(343mg,0.9mmol)于DMF(9mL)的溶液添加DIEA(784μL,4.5mmol)。反应搅拌1小时。反应混合物以乙酸乙酯稀释，且以盐水清洗(15mL x 4)。汇集的有机层以无水硫酸钠干燥，且于真空浓缩。粗制残质通过柱层析于硅胶纯化(0-15％MeOH于DCM)以获得((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-((5R,7R)-7-羟基-5-甲基-6,7-二氢-5H-cyclopen-ta[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)胺基甲酸第三-丁基酯(430mg,93％收率)呈白色泡沫。

MS m/z 516.25[M+H]⁺。

(S)-3-胺基-2-(4-氯苯基)-1-(4-((5R,7R)-7-羟基-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)丙烷-1-酮(Int-1)

对((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-((5R,7R)-7-羟基-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)胺基甲酸第三-丁基酯(430mg,0.83mmol)于1,4-二恶烷(3mL)的溶液添加于1,4-二恶烷的4M HCl(1mL)。反应搅拌4小时。反应混合物于真空浓缩。粗制残质溶解于4:1氯仿:异丙醇且以饱和NaHCO₃(aq)清洗。有机层以4:1氯仿:异丙醇(20mL x 3)萃取，于无水硫酸钠干燥，且于真空浓缩。获得粗制(S)-3-胺基-2-(4-氯苯基)-1-(4-((5R,7R)-7-羟基-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)丙烷-1-酮(332mg,定量性收率)呈褐色泡沫。

MS m/z 416.20[M+H]⁺。

方案3.由Int-1合成化合物2。

2-((2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-1,3-二侧氧基异吲哚啉-4-基)氧基)-N-(3-羟基丙基)乙酰胺

对2-((2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-1,3-二侧氧基异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸(100mg,0.3mmol)、3-胺基丙烷-1-醇(23mg,0.3mmol)及HATU(114mg,0.3mmol)于DMF(3mL)的溶液添加DIEA(160μL,0.9mmol)。反应搅拌1小时且通过逆相HPLC纯化(10-75％MeOH于H₂O)以获得2-((2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-1,3-二侧氧基异吲哚啉-4-基)氧基)-N-(3-羟基丙基)乙酰胺呈白色固体(78mg,66％收率)。

MS m/z 390.16[M+H]⁺。

2-((2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-1,3-二侧氧基异吲哚啉-4-基)氧基)-N-(3-侧氧基丙基)乙酰胺

对2-((2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-1,3-二侧氧基异吲哚啉-4-基)氧基)-N-(3-羟基丙基)乙酰胺(60mg,0.15mmol)于DCM(6mL)的溶液添加戴斯-马丁氧化剂(Dess-Martinperiodinane(DMP))(131mg,0.31mmol)。反应搅拌2小时。过滤反应混合物且于真空浓缩以获得粗制2-((2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-1,3-二侧氧基异吲哚啉-4-基)氧基)-N-(3-侧氧基丙基)乙酰胺(60mg,定量性收率)呈黄色固体。

MS m/z 388.12[M+H]⁺。

对2-((2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-1,3-二侧氧基异吲哚啉-4-基)氧基)-N-(3-侧氧基丙基)乙酰胺(60mg,0.154mmol)及(S)-3-胺基-2-(4-氯苯基)-1-(4-((5R,7R)-7-羟基-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)丙烷-1-酮(Int-1,90mg,0.18mmol)添加MeOH(1.5mL)。反应搅拌30分钟。对反应混合物添加NaBH₃CN(20mg,0.31mmol)且反应搅拌1小时。反应以饱和NaHCO₃猝冷且以乙酸乙酯萃取。汇集的有机层以无水硫酸钠干燥，且于真空浓缩。粗制物通过逆相HPLC纯化(15-85％MeOH于H₂O)以获得化合物2呈白色固体(12.6mg,9％收率)。

MS m/z 787.34[M+H]⁺。

实施例3:合成N-(8-(((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-((5R,7R)-7-羟基-5-甲基-6,7- 二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)胺基)辛基)-2-((2-(2,6-二侧 氧基哌啶-3-基)-1,3-二侧氧基异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺(3).

使用8-胺基辛烷醇以与实施例2中的化合物2的类似方式获得化合物3呈白色固体(11.1mg,13％收率)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ8.36(s,1H),7.84(t,J＝5.8Hz,1H),7.77-7.71(m,1H),7.43(d,J＝7.3Hz,1H),7.32(dd,J＝8.4,1.7Hz,3H),7.29-7.25(m,2H),5.31(s,1H),5.05(dd,J＝12.8,5.5Hz,1H),4.76(t,J＝6.7Hz,1H),4.69(s,2H),4.14(dd,J＝8.2,5.7Hz,1H),3.63-3.44(m,5H),3.39(tt,J＝9.5,4.7Hz,3H),3.16-3.12(m,1H),3.05(td,J＝12.1,11.1,7.5Hz,3H),2.83(ddd,J＝16.8,13.7,5.4Hz,1H),2.59-2.46(m,3H),2.00-1.80(m,4H),1.37-1.11(m,14H),0.96(d,J＝6.9Hz,3H).MS m/z 857.40[M+H]⁺.

实施例4:合成N-(2-(2-(2-(((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-((5R,7R)-7-羟基-5-甲 基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)胺基)乙氧基)乙氧基) 乙基)-2-((2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-1,3-二侧氧基异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺(4)。

使用2-(2-胺基乙氧基)乙烷-1-醇以与实施例2中的化合物2的类似方式获得化合物4呈白色固体(2.5mg,8％收率)。

MS m/z 817.34[M+H]⁺。

实施例5:合成N-(2-(2-(((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-((5R,7R)-7-羟基-5-甲基-6, 7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)胺基)乙氧基)乙基)-2-((2- (2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-1,3-二侧氧基异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺(5)。

使用2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙烷-1-醇以与实施例2中的化合物2的类似方式获得化合物5呈白色固体(3.0mg,5％收率)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ8.35(s,1H),7.92(t,J＝5.7Hz,1H),7.74(t,J＝7.9Hz,1H),7.43(d,J＝7.2Hz,1H),7.34(t,J＝8.8Hz,3H),7.26(d,J＝8.1Hz,2H),5.31(d,J＝5.6Hz,1H),5.05(dd,J＝12.8,5.4Hz,1H),4.76(q,J＝6.2Hz,1H),4.72(s,1H),4.24(d,J＝8.1Hz,1H),3.61(dd,J＝12.9,5.5Hz,1H),3.52(d,J＝5.6Hz,3H),3.46-3.35(m,12H),3.06(t,J＝9.9Hz,1H),2.87-2.71(m,4H),2.57-2.46(m,2H),2.01-1.80(m,4H),0.95(d,J＝6.8Hz,3H).

MS m/z 861.36[M+H]⁺。

实施例6:合成(2S,4R)-1-((2S,15S)-2-(tert-丁基)-15-(4-氯苯基)-16-(4- ((5R,7R)-7-羟基-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-4,16-二侧氧 基-7,10-二氧杂-3,13-二氮杂十六酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基) 乙基)吡咯啶-2-羧酰胺(6)。

方案4.合成化合物6。

3-(2-(2-(((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-((5R,7R)-7-羟基-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)胺基)乙氧基)乙氧基)丙酸第三-丁基酯

对(S)-3-胺基-2-(4-氯苯基)-1-(4-((5R,7R)-7-羟基-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)丙烷-1-酮(57mg,0.12mmol)及3-(2-(2-侧氧基乙氧基)乙氧基)丙酸第三-丁基酯(27mg,0.12mmol)添加DCE(3mL)。反应搅拌20分钟。添加一份STAB(49mg,0.23mmol)且反应搅拌4小时。反应通过饱和NaHCO₃猝冷，且以DCM萃取(10mL x 3)。汇集的有机层以无水硫酸钠干燥，且于真空浓缩。粗制残质通过逆相HPLC纯化(0-80％MeOH于H₂O)以获得3-(2-(2-(((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-((5R,7R)-7-羟基-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)胺基)乙氧基)乙氧基)丙酸第三-丁基酯呈黄色油(49mg,47％收率)。

MS m/z 632.33[M+H]⁺。

3-(2-(2-(((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-((5R,7R)-7-羟基-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)胺基)乙氧基)乙氧基)丙酸二盐酸盐

对3-(2-(2-(((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-((5R,7R)-7-羟基-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)胺基)乙氧基)乙氧基)丙酸第三-丁基酯(49mg,0.006mmol)添加1,4-二恶烷(700μL)及于1,4-二恶烷的4M HCl(300μL)。反应搅拌6小时且于真空浓缩。获得粗制3-(2-(2-(((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-((5R,7R)-7-羟基-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)胺基)乙氧基)乙氧基)丙酸(42mg,定量性收率)呈二盐酸盐。

MS m/z 576.30[M+H]⁺。

对3-(2-(2-(((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-((5R,7R)-7-羟基-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)胺基)乙氧基)乙氧基)丙酸二盐酸盐(21mg,0.026mmol)、(2S,4R)-1-((S)-2-胺基-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯啶-2-羧酰胺盐酸盐(26mg,0.052mmol)及HATU(10mg,0.026mmol)添加DMF(1mL)及DIEA(32μL,0.182mmol)。反应搅拌1小时。反应通过逆相HPLC纯化(20-80％MeOH于H₂O)以获得化合物6呈白色固体(10.8mg,34％收率)。

MS m/z 1002.52[M+H]⁺。

实施例7:合成3-(4-(10-(((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-((5R,7R)-7-羟基-5-甲基- 6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)胺基)癸-1-炔-1-基)-1- 侧氧基异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(7)。

方案5.合成化合物7。

3-(4-溴-1-侧氧基异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮

对3-溴-2-(溴甲基)苯甲酸甲基酯(1g,3.25mmol)及3-胺基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(642mg,3.9mmol)添加MeCN(6.5mL)及三乙基胺(TEA)(1.04mL,7.5mmol)。反应于80℃搅拌16小时。反应混合物冷却至室温且于真空浓缩。粗制物悬浮于乙酸以酯并过滤。固体以乙酸乙酯(50mL x 2)及H₂O(50mL x 3)清洗。收集固体以获得3-(4-溴-1-侧氧基异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮呈紫色固体(803mg,76％收率)。

MS m/z 322.09[M+H]⁺。

3-(4-(10-羟基癸-1-炔-1-基)-1-侧氧基异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮

对3-(4-溴-1-侧氧基异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(500mg,1.55mmol)、癸-9-炔-1-醇(478mg,3.10mmol)、Pd(PPh₃)₂Cl₂₍113mg,0.16mmol)及CuI(61mg,0.32mmol)添加DMF(8mL)及TEA(4mL)。反应加热至70℃且持续加热3小时。反应混合物冷却至室温且以乙酸乙酯稀释。有机层以盐水清洗(5mL x 4)。汇集的有机层以无水硫酸钠干燥，且于真空浓缩。粗制物通过柱层析于硅胶纯化(0-15％MeOH于DCM)以获得3-(4-(10-羟基癸-1-炔-1-基)-1-侧氧基异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮呈黄色固体(503mg,82％收率)。

MS m/z 397.25[M+H]⁺。

10-(2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-1-侧氧基异吲哚啉-4-基)癸-9-炔醛

对3-(4-(10-羟基癸-1-炔-1-基)-1-侧氧基异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(119mg,0.3mmol)添加DCM(6mL)及DMP(191mg,0.45mmol)。反应搅拌2小时。过滤反应混合物且于真空浓缩以获得10-(2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-1-侧氧基异吲哚啉-4-基)癸-9-炔醛呈白色固体(40mg,34％收率)。

MS m/z 395.23[M+H]⁺。

对Int-1(22mg,0.05mmol)及10-(2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-1-侧氧基异吲哚啉-4-基)癸-9-炔醛(21mg,0.05mmol)添加DCE(2mL)。反应搅拌30分钟。添加一份STAB(23mg,0.11mmol)且反应搅拌1小时。反应以加入饱和NaHCO₃(aq)猝冷，且以DCM萃取(10mLx 3)。汇集的有机层以无水硫酸钠干燥，且于真空浓缩。粗制物通过逆相HPLC纯化(30-99％MeOH于H₂O)以获得化合物7呈白色固体(12.5mg,23％收率)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ10.92(s,1H),8.56(d,J＝40.2Hz,1H),8.36(s,1H),7.64(dd,J＝7.6,1.0Hz,1H),7.55(dd,J＝7.7,1.1Hz,1H),7.49-7.38(m,2H),7.34-7.24(m,2H),5.16-5.01(m,2H),4.48-4.32(m,3H),4.23(d,J＝17.6Hz,1H),3.87(d,J＝10.1Hz,1H),3.69(dd,J＝10.1,3.9Hz,1H),3.55-3.26(m,5H),3.03(ddt,J＝12.1,8.1,4.2Hz,1H),2.93-2.76(m,3H),2.56-2.46(m,1H),2.42-2.31(m,3H),2.09-1.86(m,3H),1.58-1.42(m,4H),1.35(q,J＝7.0Hz,2H),1.22(d,J＝7.7Hz,6H),1.00(d,J＝6.9Hz,3H).

MS m/z 794.40[M+H]⁺。

实施例8:合成3-(4-(6-(((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-((5R,7R)-7-羟基-5-甲基-6, 7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)胺基)己-1-炔-1-基)-1-侧 氧基异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(8).

使用己-5-炔-1-醇以与实施例7中的化合物7的类似方式获得化合物8呈白色固体(5.20mg,12％收率)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ11.01(s,1H),8.62(d,J＝38.2Hz,1H),8.45(s,1H),7.73(d,J＝7.6Hz,1H),7.63(d,J＝7.6Hz,1H),7.56-7.44(m,2H),7.36(d,J＝8.1Hz,2H),5.15(dt,J＝15.1,7.5Hz,2H),4.55-4.41(m,2H),4.32(d,J＝17.7Hz,2H),3.99-3.86(m,2H),3.81-3.49(m,7H),3.37(dt,J＝14.9,8.3Hz,2H),3.13(ddt,J＝12.9,9.2,4.6Hz,1H),3.07-2.87(m,3H),2.65-2.52(m,3H),2.44(td,J＝13.2,4.6Hz,1H),2.03(td,J＝15.8,12.6,6.6Hz,2H),1.78(ddt,J＝13.6,9.8,5.7Hz,2H),1.62(p,J＝7.3Hz,2H),1.24(s,1H),1.07(d,J＝6.9Hz,3H).MS m/z 738.38[M+H]⁺。

实施例9:合成4-(4-(((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-((5R,7R)-7-羟基-5-甲基-6,7- 二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)胺基)丁基)-2-(2,6-二侧氧基 哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(9).

2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-4-(4-羟基丁-1-炔-1-基)异吲哚啉-1,3-二酮

对4-溴-2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(337mg,1.0mmol)、丁-3-炔-1-醇(140mg,2.0mmol)、Pd(PPh₃)₂Cl₂(71mg,0.1mmol)及CuI(38mg,0.2mmol)添加DMF(5mL)及TEA(2.5mL)。反应加热至70℃且持续加热3小时。反应混合物冷却至室温且以乙酸乙酯稀释。有机层以盐水清洗(5mL x 4)。汇集的有机层以无水硫酸钠干燥，且于真空浓缩。粗制物通过柱层析于硅胶纯化(0-15％MeOH于DCM)以获得2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-4-(4-羟基丁-1-炔-1-基)异吲哚啉-1,3-二酮呈暗黄色固体(228mg,70％)。

MS m/z 327.15[M+H]⁺。

方案6.合成化合物9。

2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-4-(4-羟基丁基)异吲哚啉-1,3-二酮

T对2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-4-(4-羟基丁-1-炔-1-基)异吲哚啉-1,3-二酮(228mg,0.7mmol)添加MeOH(20mL)及Pd/C(30mg)。对反应混合物导入H₂(g)且反应搅拌5小时。反应于过滤且于真空浓缩以获得2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-4-(4-羟基丁基)异吲哚啉-1,3-二酮(231mg,定量性收率)的粗制物。

MS m/z 331.17[M+H]⁺。

4-(2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-1,3-二侧氧基异吲哚啉-4-基)丁醛

对2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-4-(4-羟基丁基)异吲哚啉-1,3-二酮(231mg,0.7mmol)添加DCM(5mL)及DMP(445mg,1.1mmol)。反应搅拌2小时，过滤，且于真空浓缩以获得4-(2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-1,3-二侧氧基异吲哚啉-4-基)丁醛(131mg,57％收率)。

MS m/z 329.12[M+H]⁺。

对Int-1(20mg,0.05mmol)、4-(2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-1,3-二侧氧基异吲哚啉-4-基)丁醛(16mg,0.05mmol)添加DCE(1mL)。反应搅拌30分钟。添加一份STAB(20mg,0.1mmol)且反应搅拌1小时。反应通过饱和NaHCO₃(aq)猝冷且以DCM萃取(10mL x 3)。汇集的有机层以无水硫酸钠干燥，且于真空浓缩。粗制残质通过逆相HPLC纯化(20-80％MeOH于H₂O)以获得化合物9呈白色固体(6.3mg,14％收率)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ11.12(d,J＝3.4Hz,1H),8.67(s,1H),8.44(d,J＝55.2Hz,1H),7.89-7.80(m,1H),7.76-7.67(m,1H),7.50(d,J＝8.2Hz,2H),7.35(dd,J＝8.8,3.2Hz,2H),5.22-5.08(m,2H),4.46(dt,J＝8.7,4.2Hz,1H),3.81-3.44(m,7H),3.39(dtd,J＝21.0,10.7,10.0,4.7Hz,2H),3.11(ddt,J＝12.6,8.7,4.3Hz,1H),2.96(tt,J＝13.8,7.0Hz,2H),2.91-2.85(m,1H),2.85-2.73(m,2H),2.66-2.52(m,2H),2.19-1.93(m,3H),1.68(p,J＝7.5Hz,2H),1.64-1.52(m,2H),1.24(d,J＝3.3Hz,1H),1.07(dd,J＝7.3,3.2Hz,3H).

MS m/z 728.34[M+H]⁺。

实施例10:合成3-(4-(10-(((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-((5R,7R)-7-羟基-5-甲基- 6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)胺基)癸基)-1-侧氧基异 吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(10)。

方案7.合成化合物10.

3-(4-(10-羟基癸基)-1-侧氧基异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮

对3-(4-(10-羟基癸-1-炔-1-基)-1-侧氧基异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(100mg,0.25mmol)及Pd/C(10mg)添加MeOH(10mL)。导入H₂(g)至反应混合物且搅拌4小时。反应混合物于过滤且于真空浓缩以获得3-(4-(10-羟基癸基)-1-侧氧基异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(105mg,定量性收率)的粗制物呈褐色固体。

MS m/z 401.30[M+H]⁺。

10-(2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-1-侧氧基异吲哚啉-4-基)癸醛对3-(4-(10-羟基癸基)-1-侧氧基异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(40mg,0.1mmol)添加DCM(2mL)及DMP(64mg,0.15mmol)。反应搅拌2小时。过滤反应混合物且于真空浓缩以获得10-(2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-1-侧氧基异吲哚啉-4-基)癸醛(36mg,90％收率)呈白色固体。

MS m/z 399.35[M+H]⁺。

对Int-1(35mg,0.085mmol)及10-(2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-1-侧氧基异吲哚啉-4-基)癸醛(34mg,0.085mmol)添加DCE(1mL)。反应混合物搅拌30分钟。添加一份STAB(36mg,0.17mmol)且反应搅拌1小时。反应以加入饱和NaHCO₃(aq)猝冷且以DCM萃取(20mL x3)。汇集的有机层以无水硫酸钠干燥，且于真空浓缩。粗制残质通过逆相HPLC纯化(15-85％MeOH于H₂O)以获得化合物10呈白色固体(11mg,25％收率)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ10.99(s,1H),8.65(s,1H),8.52-8.37(m,1H),7.57(dd,J＝5.9,2.7Hz,1H),7.51-7.48(m,1H),7.46(d,J＝6.0Hz,2H),7.40-7.32(m,2H),5.19-5.10(m,2H),4.51-4.41(m,2H),4.30(d,J＝17.0Hz,1H),3.98-3.89(m,1H),3.75-3.50(m,7H),3.42-3.33(m,2H),3.11(dp,J＝12.6,4.2Hz,1H),2.98-2.88(m,3H),2.66-2.58(m,3H),2.43(qd,J＝13.2,4.4Hz,2H),2.08(ddt,J＝10.8,5.3,2.7Hz,1H),2.02(dd,J＝10.4,4.9Hz,2H),1.63-1.53(m,4H),1.30(d,J＝4.7Hz,4H),1.25(s,8H),1.07(d,J＝6.9Hz,3H).

MS m/z 798.45[M+H]⁺。

3-(4-(10-(((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-(((5R,7R)-7-羟基-5-甲基-6,7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)胺基)癸基)-1-侧氧基异吲哚啉-2-基)-1-甲基哌啶-2,6-二酮(10-Me)

使用8-3-(4-(10-羟基癸基)-1-侧氧基异吲哚啉-2-基)-1-甲基哌啶-2,6-二酮以与化合物10类似的方式获得化合物10-Me呈灰白色固体(9mg,16％收率)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)8.43(s,1H),7.57(dd,J＝5.8,2.8Hz,1H),7.49-7.43(m,4H),7.37-7.32(m,2H),5.40(d,J＝5.5Hz,1H),5.21(dd,J＝13.4,5.1Hz,1H),4.83(q,J＝6.3Hz,1H),4.45(d,J＝17.1Hz,1H),4.38(dd,J＝8.9,5.1Hz,1H),4.29(d,J＝17.1Hz,1H),3.76-3.41(m,8H),3.41-3.34(m,3H),3.10(t,J＝10.0Hz,1H),3.01(s,3H),2.99-2.95(m,1H),2.83-2.73(m,3H),2.63(t,J＝7.7Hz,2H),2.43(qd,J＝13.2,4.5Hz,1H),2.05-1.87(m,3H),1.59(t,J＝7.5Hz,2H),1.50(s,2H),1.33-1.27(m,4H),1.23(s,8H),1.02(d,J＝6.9Hz,3H).LC-MS:m/z 812.47[M+1].

实施例11:合成N-((S)-2-(4-氯苯基)-3-(4-((5R,7R)-7-羟基-5-甲基-6,7-二 氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-侧氧基丙基)-11-(2-(2,6-二侧氧基哌啶-3- 基)-1-侧氧基异吲哚啉-4-基)十一烷酰胺(11)。

11-(2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-1-侧氧基异吲哚啉-4-基)十一-10-炔酸第三-丁基酯

对3-(4-溴-1-侧氧基异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(162mg,0.5mmol)、十一-10-炔酸第三-丁基酯(238mg,1.0mmol)、Pd(PPh₃)₂Cl₂(35mg,0.05mmol)及CuI(19mg,0.1mmol)添加DMF(2.5mL)及TEA(1.3mL)。反应加热至70℃且持续加热3小时。反应混合物冷却至室温且以乙酸乙酯稀释。有机层以盐水清洗(5mL x 4)。汇集的有机层以无水硫酸钠干燥，且于真空浓缩。粗制物通过柱层析于硅胶纯化(0-15％MeOH于DCM)以获得11-(2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-1-侧氧基异吲哚啉-4-基)十一-10-炔酸第三-丁基酯(120mg,50％收率)呈黑色固体。

MS m/z 481.31[M+H]⁺。

11-(2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-1-侧氧基异吲哚啉-4-基)十一-10-炔酸

对11-(2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-1-侧氧基异吲哚啉-4-基)十一-10-炔酸第三-丁基酯添加DCM(1mL)and TFA(0.3mL)。反于室温搅拌1小时。反应混合物于真空浓缩且通过逆相HPLC纯化(15-90％MeOH于H₂O)以获得11-(2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-1-侧氧基异吲哚啉-4-基)十一-10-炔酸(6.5mg,20％收率)呈白色固体。

MS m/z 425.28[M+H]⁺.

化合物11

对Int-1(6mg,0.015mmol)、11-(2-(2,6-二侧氧基哌啶-3-基)-1-侧氧基异吲哚啉-4-基)十一-10-炔酸(7mg,0.015mmol)及HATU(6mg,0.015mmol)添加DMF(1mL)及DIEA(11μL,0.06mmol)。反应搅拌1小时且通过逆相HPLC纯化(15-90％MeOH于H₂O)以获得化合物11呈白色固体(1mg,6％收率)。

MS m/z 822.40[M+H]⁺。

实施例12:AKT1、AKT2及AKT3于MDA-MB-468及MCF10A细胞株利用双官能化合物的 降解

MDA-MB-468(人类乳癌细胞株)细胞维持于cells were maintained in补充有10％FBS(Thermo Fisher Scientific)的RPMI1640(Wisent Bioproducts)及MCF10A(人类乳房上皮细胞株)细胞维持于补充有5％马血清(Fisher)、胰岛素(10μg/ml)(LifeTechnologies)、氢皮质酮(500ng/ml)表皮生长因子(20ng/ml)(R&DSystems)及霍乱毒素(100ng/ml)(List Biological Lab)的杜贝可修饰伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM))/Ham’s F12(Wisent Bioproducts)。MDA-MB-468及MCF10A细胞分别以250,000cells/mL及200,000cells/mL接种。次日以本发明双官能化合物处理细胞。24小时后，细胞以磷酸盐缓冲生理盐水于4℃清洗且溶裂于放射性免疫沉淀测试(RIPA)缓冲液(150mM Tris-HCl,150mM NaCl,0.5％(w/v)脱氧胆酸钠,1％(v/v)NP-40,pH 7.5)含有0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠、1mM焦磷酸钠、20mM氟化钠、50nM花萼海绵诱癌素(calyculin)及0.5％(v/v)蛋白酶抑制剂混合物)。细胞抽出物通过于14,000rpm于4℃离心10分钟预澄清。使用Bio-Rad DC蛋白质测试以评估蛋白质浓度，且使用SDS样品缓冲液正常化样品浓度。溶裂物解油SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳解析且以100伏特电泳性地转移至硝基纤维素膜(BioRad)持续90分钟。膜以5％(w/v)非脂无水乳或5％(w/v)牛血清白蛋白于tris-缓冲生理盐水(TBS)缓冲液封阻1小时后，与特异性一级抗体于封阻缓冲液于4℃封阻整夜，振荡。抗-AKT1(CST2938)、抗i-AKT2(CST3063)、抗-AKT3(CST8018)、抗-磷酸-Thr246-PRAS40(CST2997)、抗-PRAS40(CST2691)及抗-纽蛋白(CST13901)抗体由Cell Signaling购得。膜于TBS-T清洗三次且与萤光团接合的二级抗体于室温培育1小时。膜于TBS-T清洗三次且使用CLx造影。储存影像且使用ImageStudio^TM 软件分析。

AKT同功型于MDA-MB-468细胞中以本发明双官能化合物1及3于24-小时处理后以剂量依赖性方式降解(图1)。以DMSO对照处理表示基线AKT同功型表达。GDC0068处理造成的40kDa(PRAS40)信号的磷酸化脯胺酸-富集AKT受质的减低，表示AKT抑制作用。

实施例13:AKT1、AKT2及AKT3于MCF10A细胞株利用本发明功能化合物的降解

AKT1、AKT2及AKT3于MCF10A细胞株利用本发明功能化合物1及3的降解如实施例12的描述进行。

AKT同功型于MCF10A细胞中以本发明双官能化合物1及3于24-小时处理后以剂量依赖性方式降解(图2)。以DMSO对照处理指示基线AKT同功型表达。GDC0068处理造成的磷酸化PRAS40信号的的减低，表示AKT抑制作用。

实施例14:AKT1、AKT2及AKT3于MDA-MB-468及MCF10A细胞株中利用本发明双官能 化合物10的降解

AKT1、AKT2及AKT3于MDA-MB-468及MCF10A细胞株中利用本发明双官能化合物10的降解如实施例12的描述进行。

AKT同功型于MDA-MB-468细胞(图3)及MCF10A细胞(图4)中以本发明双官能化合物1及3于24-小时处理后以剂量依赖性方式降解。以DMSO对照处理指示基线AKT同功型表达.GDC0068处理造成的磷酸化PRAS40信号的的减低，表示AKT抑制作用。

实施例15:AKT结合测试.

Z’-LYTE测试(目录编号PV3193,Invitrogen^TM)对于AKT1,AKT2、AKT3、PKG1、S6K1、PKN1、βMSK2及Haspin蛋白于Life Technologies^TM使用Km ATP浓度以10-点剂量回应进行。LanthaScreen^TM测试对于RET(V804M)以10-点剂量回应于Life Technologies^TM进行。

AKT结合测试的结果总结于表1。表1中的数据显示本发明化合物以低纳米莫耳浓度抑制所有的AKT同功型。

表1.利用本发明双官能化合物的AKT结合测试

N.T＝未测试

实施例16:本发明双官能化合物10诱发依赖于CRBN、类泛素化(neddylation)及蛋 白酶体的AKT同功型的降解

试验及模型及受试者详细内容

MOLT4(雄性，CVCL_0013)、Jurkat(雄性，CVCL_0065)、ZR-75-1(雌性，CVCL_0588)、LNCaP(雄性，VCL_0395)、T47D(雌性，CVCL_0553)、MCF-7(雌性，CVCL_0031)、MDA-MB-468(雌性，CVCL_0419)及HCC1937(雌性，CVCL_0290)细胞于37℃、5％CO₂的存在下，培养于补充有10％热失活胎牛血清(ThermoFisher Scientific)及100U/mL青霉素-链霉素的RPMI培养基(Wisent Bioproducts)。IGROV1(雌性，CVCL_1304)及PC3(雄性，CVCL_0035)细胞于于37℃、5％CO₂的存在下，培养于补充有10％热失活胎牛血清(ThermoFisherScientific)及100U/mL青霉素-链霉素的DMEM培养基

药物处理试验

细胞以每毫升250,000细胞(MDA-MB-468、MOLT4、IGROV1、PC3及Jurkat)或每毫升200,000细胞(T47D)于每孔2mL的具有10％血清的RPMI或DMEM培养基接种于6-孔处理组织培养盘(Greiner,Cat#TCG-657160)或60mm处理组织培养盘(Cat#430166)且培养整夜。次日，细胞以指示的化合物于合适的浓度处理且于特定时间收获蛋白质溶裂物。

免疫墨点分析

细胞以1x PBS清洗一次后于含有0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠、1mM焦磷酸钠、20mM氟化钠、50nM花萼海绵诱癌素蛋白(calyculin)及0.5％(v/v)蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液(150mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.5％(w/v)脱氧胆酸钠，1％(v/v)NP-40，pH 7.5)中溶裂15分钟。细胞抽出物于4℃通过于14,000rpm离心10分钟预澄清。使用Bio-Rad DC蛋白质测试以评估蛋白质浓度，且使用SDS样品缓冲液正常化样品浓度。溶裂物通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳性地解析且以100伏特电泳性地转移至硝基纤维素膜(BioRad)进行90分钟。膜以5％(w/v)非脂无水乳于tris-缓冲生理盐水(TBS)缓冲液封阻1小时后，与特异性一级抗体稀释于5％(w/v)非脂无水乳于TBS-T(具有0.05％202k7TBS)于4℃封阻整夜，振荡。次日，膜以TBS-T清洗且与萤光团接合的二级抗体于室温培育1小时。膜再次以TBS-T清洗且使用CLxImaging System(Biosciences)造影。

串联质量标记法(TMT)LC-MS样品制备

MOLT4细胞利用DMSO、250nM本发明双官能化合物10m以生物学三重复。通过离心收集细胞。溶裂缓冲液(8M尿素、50mM NaCl、50mM 4-(2羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(EPPS)pH8.5、1x蛋白酶抑制剂及1xPhosStop^TM添加至细胞块且细胞通过20次通过21号(1.25英吋长度)针进行均质化以达成具有蛋白质浓度界于0.5-4mg mL^-1的细胞溶裂物。均质化的样品于4℃通过于20,000x g离心10分钟进行澄清。.

使用Bradford测试以测定细胞溶裂物中的最终蛋白质浓度。对于各样品将200mg蛋白质进行还原及烷基化如先前技术所描述(An et al.,Nat.Comm.8:15398(2017))。使用甲醇/氯仿沉淀蛋白质。简而言，对细胞溶裂物添加四容积的甲醇，着添加一容积的氯仿，以及最后添加三容积的水。混合物进行涡漩且于14,000xg离心5分钟以自水层分离氯仿层。沉淀的蛋白质以三容积甲醇清洗，于14,000xg离心5分钟，以即使所得清洗过的沉淀蛋白质空气干燥。沉淀蛋白质重悬于4M尿素、50mM HEPES pH 7.4，接着通过稀释至1M尿素利用添加200mM EPPS pH 8以LysC(1:50；酵素:蛋白质)于室温分解12小时。LysC分解稀释至0.5M尿素、200mM EPPS pH 8然后利用胰蛋白酶(1:50；酵素:蛋白质)于37℃分解6小时。

串联质量标记(TMT)试剂(ThermoFisher Scientific)根据制造商指引溶解于无水乙腈(ACN)。无水ACN添加至各肽样品至最终浓度30％v/v，且利用加入TMT试剂度各样品以比例1:4肽:TMT标志进行诱导标志。11-重标志反应于室温实施1.5小时且通过于室温加入0.3％羟基胺进行猝息15分钟。以1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1比例组合样品通道，使用C18固相抽出匣(Waters)脱盐且对于通道比例比较通过LC-MS分析。然后使用通道比例分析中所测定的已调整容积组合样品且于离心式真空浓缩机干燥。然后组合的样品重悬于1％甲酸且于利用C18SPE(Waters)进行脱盐之前进行酸化(pH2-3)。然后样品经由aerispeptide xb-c18柱利用含有5％乙腈及10mM NH₄HCO₃于LC-MS级H₂O的移动相A及含有90％乙腈及10mM NH₄HCO3于LC-MS级H₂O的移动相B(二者pH 8.0)通过高pH逆相HPLC(Agilent LC1260)离线划分为96个分液。然后96个所得分液以非连续方式汇集至24个分液且每个分液使用于后续的质谱分析。

使用Orbitrap Fusion^TMLumos^TM质谱仪(ThermoFisher Scientific,San Jose,CA,USA)偶合Proxeon EASY-nLC^TM1200LC pump(ThermoFisher Scientific)收集数据。肽分离于50cm及75mm内径的EASY-Spray^TM柱(ES803a,ThermoFisher Scientific)。肽分离使用190分钟梯度的6-27％乙腈于1.0％甲酸利用流速300nL/min。

各分析使用MS3-系TMT方法如先前技术所描述(McAlister et al.,Anal.Chem.86:7150-7158(2014))。对于肽测定于Orbitrap使用质量范围m/z 340-1350，解析120,000，AGC靶5x 105，最大注射时间100ms，动态排除120秒获得数据。依赖于MS2谱的数据于离子阱中获得，利用正常化碰撞能量(NCE)设于35％，AGC靶设于1.8x 104以及最大注射时间120ms。MS3扫描获得于Orbitrap利用HCD碰撞能量设于55％，AGC靶设为2x 105，最大注射时间150ms，解析于50,000及利用最大同步前驱物选择(SPS)前驱物设至10。

LC-MS数据分析

使用Proteome Discoverer 2.2(ThermoFisher Scientific)进行RAW档案处理及控制肽及蛋白质水平伪发现率，自肽组装蛋白质及自肽的蛋白质定量。MS/MS谱针对于Uniprot人类数据库(September2016)利用前置序列及反置序列进行检索。数据库检索条件如下述:具有二个漏失裂解的胰蛋白酶，前驱物质量耐受10ppm，片段离子质量耐受0.6Da,，半胱胺酸的静态烷基化(57.02146Da)，肽的离胺酸残基及N终端的静态TMT标志(229.16293Da)，丝胺酸、苏胺酸及酪胺酸的各种磷酸化(79.966Da)以及甲硫胺酸的各种氧化(15.99491Da)。TMT报导子离子强度于MS3扫描中对于各报导子离子使用约理论m/z的0.003Da窗进行测量。与品质差的MS3图谱相配的肽谱排除于定量外(10通道的总信号-对-杂讯<200且前驱物单离特异性<0.5)。只有试验中鉴定的含有置绍二个独特肽的蛋白质被包括于最终定量。

阐释于图5A的数据显示本发明双官能化合物10在12小时处理后以剂量依赖性方式诱导所有三种AKT同功型的强力降解，以界于100及250nM所观察的最大降解。MDA-MB-468细胞利用250nM的本发明双官能化合物10历时的处理解明4小时内的所有AKT同功型的部分降解以及达24小时的AKT丰度的进行性损失(图5B)。

本发明双官能化合物10与蛋白酶体抑制剂硼替左米或与预防对于如CRL4CRBN的cullin TING连接酶的功能所需的类泛素化的NEDD-8活化酵素抑制剂MLN-4924的共同处理(Soucy et al.,Clin.Cancer Res.15:3912-3916(2009))，预防AKT失稳定化，表示降解依赖于泛素-蛋白膜体系统(图5C)。与过量的GDC-0068或来那度胺的共处理本发明双官能化合物10以分别竞争结合至AKT或CRBN，二者皆预防AKY降解，展现AKT与CRBN的缔合为本发明双官能化合物10诱导AKT降解所需(图5C)。

为概括地评估降解者选择性，适合于蛋白体学且表达所有三种AKT同功型的细胞株的MOLT4细胞，利用250nM的本发明双官能化合物10处理4小时且如上述进行无偏、多重质谱法为主的蛋白体学分析。这分析鉴定所有三种AKT同功型以及RNF166的显著下调，RNF166已知为受到来那度胺处理而下调的环-指蛋白质(图5D)(Kronke et al.,Nature 523:183-188(2015))。

阐释于图6A的数据显示本发明双官能化合物10的抗增生效应为降解依赖性的，因为双官能化合物不能结合CRBN的双官能化合物10-Me不能结合CRBN，为显著的较低潜力(GR50＝413nM)于本发明双官能化合物10and且具有相当于GDC-0068的GR50值。类似的倾向可见于对SAKT抑制作用敏感的其他细胞株，具有对于本发明双官能化合物10相比于GDC-0068的8-至14-倍较低的GR50值(图6A-图6D)。此外，来那度胺，对于RNF166、IKZF1及IKZF3降解使用作为对照，不具有强的抗增生效应，建议增强的抗增生效应气音于AKT降解(图6A-图6D)。

虽然本发明双官能化合物10于MDA-MB-468及HCC1937细胞相比于GDC-0068展现较强的抗增生效应，但本发明双官能化合物10与双官能化合物10-Me之间没有明显的GR50值差异(图6E-图6F)。因此，本发明双官能化合物10于该些细胞株中的抗增生效应像是起因于脱靶效应而无关于AKT降解，其显现于于升高浓度的本发明双官能化合物10及双官能化合物10-M。这与先前研究所报导的MDA-MB-468及HCC1937对于AKT抑制的阻抗性一致(Lin etal.,Clin.Cancer Res.19:1760-1772(2013))，且表示AKT降界于该些细胞株中具有如同AKT抑制的类似表现型效应。总结，数据显示本发明双官能化合物10更强力于GDC-0068的压制增生作用，且强调靶向AKT降解的潜式治疗价值。

为了检测该些效应是否在不同的细胞株通用化，我们也比较本发明双官能化合物10及GDC-0068在MDA-MB-468及T47D细胞的效应(图7A-图7B)。本发明双官能化合物10于250nM显著地减低PRAS40、GSK3I3及S6的磷酸化(图7A)，而较弱的回应可见于利用相当剂量的GDC-0068(图7B)。

应注意地，阐释于图7C至图7D的数据显示利用250nM的本发明双官能化合物10于T47D及MDA-MB-468细胞二者处理后至少96小时，本发明双官能化合物10促进所有三种AKT同功型的持续失稳定作用。此耐久的AKT降解造成下调信号的持续抑制，因为pPRAS40水平也显著地减低长达96小时(图7C)。相对于此，里用相当剂量的GDC-0068的处理不仅造成不太明显的抑制pPRAS40，且此效应的耐久性也较短(图7D)。

为进一步特征化通过本发明双官能化合物10所诱导的AKT降解的延长耐久性的潜在机制，利用250nM的本发明双官能化合物10或GDC-0068处理12小时候进行洗除试验。阐释于图7E-图7F的数据显示本发明双官能化合物10-已处理的细胞在洗除后长达96小时没有可侦测的AKT水平的再结合，建议AKT的再合成率为低。一致性地，本发明双官能化合物10在洗除后强力地压制pPRAS40的水平长达96小时(图7E)，而在洗除GDC-0068-已处理细胞则造成pPRAS40的再结合，因为被期望为可逆的抑制剂(图7F)。总体而言，数据建议本发明双官能化合物10-介导的AKT降解造成比AKT抑制作用为更强力的且耐久的药学效应。

说明书中引用的所有文献，包括专利文献和非专利文献，都表明本发明所属领域技术人员的技术水平所有这些文献均以引用方式并入本文，其程度如同每个单独的文献都被具体地和单独地指示为以引用方式并入相同。

虽然本文描述的本发明已经参考特定实施例进行描述，但是应当理解，这些具体例仅是对本文描述的原理和应用的说明因此应当理解，在不脱离由所附权利要求书限定的本文所述的各种具体例的精神和范围的情况下，可以对说明性具体例进行多种修改并且可以设计其他布置。