一种去除样本中核糖体rna和/或线粒体rna的方法和试剂盒
阅读说明：本技术 一种去除样本中核糖体rna和/或线粒体rna的方法和试剂盒 (Method and kit for removing ribosomal RNA and/or mitochondrial RNA in sample ) 是由 倪健 杨玉霞 陈曦 罗俊峰 于 2021-08-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种去除样本中核糖体RNA和/或线粒体RNA的方法和试剂盒,属于基因检测技术领域。本发明提供由异尾双链探针杂交捕获人类、小鼠和大鼠核糖体RNA和线粒体RNA,达到分离去除核糖体RNA和线粒体RNA的目的。本发明具有操作简单,流程简短,成本低廉,去除效率高,兼容多种商用RNA二代测序建库试剂盒的特点。(The invention discloses a method and a kit for removing ribosome RNA and/or mitochondrial RNA in a sample, belonging to the technical field of gene detection. The invention provides a method for capturing human, mouse and rat ribosomal RNA and mitochondrial RNA by hybridization of a heterotail double-stranded probe, thereby achieving the purpose of separating and removing the ribosomal RNA and the mitochondrial RNA. The method has the characteristics of simple operation, short flow, low cost, high removal efficiency and compatibility with various commercial RNA second-generation sequencing library building kits.)
技术领域
本发明涉及一种去除样本中核糖体RNA和/或线粒体RNA的方法和试剂盒，属于基因检测技术领域。
背景技术
癌症是影响人类健康的恶性疾病之一，为了研究癌症的发生与发展机理，科学家们离不开模式生物的帮助，科学家们利用小鼠和大鼠建立各种各样的癌症模型，有了这些生物模型，才能研究各种技术与机理的变化、尝试各种药物的药效和代谢机制的变化等等，在某些应用场景中，RNA是这些变化的集中体现，随着生物技术的发展，第二代高通量测序(next generation sequencing)中的RNA-seq能够提供给科学家们实时、海量的生物变化信息，RNA-seq一直以来都是科学家们研究癌症的重要工具和手段。
但是，在人类、小鼠和大鼠样本中，核糖体RNA是总RNA中丰度最高的RNA种类，大约占总RNA的90％，而核糖体RNA几乎不能提供有用的转录本信息。在二代测序的应用中，为了尽可能的获得最多的有用转录本信息，有两种办法可以采用。一是用oligo-dT富集mRNA的多聚尾A(polyA)，然而这种方法只能富集带有polyA的mRNA,而有些真核生物mRNA并没有polyA，同时用此方法捕获时会丢失其它RNA的种类，比如非编码RNA中的snRNA、snoRNA、miRNA等；此外因为捕获需要高质量完整的RNA，对低质量不完整和产量低的mRNA富集效果也会不佳。另外一种是核糖体RNA去除的方法，此方法更适合低质量或产量低的RNA，同时也保留了更多的RNA种类多样性，提升了转录本信息量。
线粒体rRNA包括12S和16S两个亚基，这两个亚基在不同的细胞和发育时期中表达变化非常大，二代高通量测序RNA-seq质控流程中也需要过滤掉这部分数据的。这两个亚基通常占有RNA-seq数据量的10％。
已有的核糖体RNA去除方法主要是用探针捕获，具体探针类型包括RNA探针，DNA探针，锁核酸探针等，但是都有一定的缺点和不足。比如已报道的Epicentre公司的RiboZero试剂盒RNA探针需要保存在-70℃的超低温条件下，不利于操作，并且会捕获非靶标的RNA，造成转录本信息丢失；Invitrogen公司RiboMinus的核糖体RNA去除效率只有80％，核糖体RNA仍然占据了大量数据；此外，市场上的试剂盒也存在操作时长过长和成本过高的问题。例如，NEB公司的 rRNA Depletion Kit和Vazyme公司的Ribo-off rRNAdepletion kit整个实验流程都超过2小时。从专利文件CN104685071A中可以得出，凯杰公司RNA消除组合物的探针需与靶区域形成复杂双链杂交体，并与带抗体的磁珠结合后达到去除核糖体RNA或者线粒体RNA的目的，如此复杂设计的成本难以降低。再者，有些试剂盒并不提供核糖体RNA 45s亚基和线粒体rRNA去除，最终还是影响了RNA-seq的有效数据量。
发明内容
针对目前去除核糖体RNA和线粒体RNA方法的不足，为了更好的满足癌症研究中的需求，本发明公开一种去除核糖体RNA和线粒体RNA的方法及试剂盒，该发明流程简短，成本低廉，去除效率高，具有可以独立使用，也可兼容多种商用RNA二代测序建库试剂盒的特点。
本发明的第一个目的是提供一种去除样本中核糖体RNA和/或线粒体RNA的方法，所述方法是通过采用若干异尾双链探针捕获样本中的核糖体RNA和/或线粒体RNA，形成DNA-RNA杂交复合体，分离杂交复合体，去除样本中的核糖体RNA和/或线粒体RNA；其中，所述的异尾双链探针由带有标记的探针序列(probes)和保护序列(protectors)组成；所述的探针序列由TH区域、overlap区域和NH区依次连接组成，其中，TH区域和overlap区域根据样本中待去除RNA的亚基片段进行设计，与待去除RNA的亚基片段的部分序列互补，NH序列不与待去除RNA的亚基片段的序列互补；所述的保护序列与探针序列中overlap区域和NH区互补。
进一步地，所述的待去除RNA的亚基片段为核糖体RNA 45S亚基、核糖体RNA18S亚基、核糖体RNA5.8S亚基、核糖体RNA5S亚基、线粒体RNA 12S亚基、线粒体RNA 16S亚基中的一种或多种。
进一步地，所述的探针序列在0.3M NaCl浓度，60℃条件下，包含以下一种或多种特征：
(1)探针序列的TH区域吉布斯自由能为(-4.00～-16.00)kcal/mol；NH端的吉布斯自由能为(-1.00～-12.00)kcal/mol；
(2)探针序列的TH端和NH端的吉布斯自由能差异ΔΔG(ΔGTH-ΔGNH)在(4.00～-15.00)kcal/mol之间；
(3)探针序列的overlap区域吉布斯自由能为(-5.00～-40.00)kcal/mol之间
进一步地，所述的探针序列的长度为20-80bp，保护序列的长度为10-70bp。
进一步地，所述的样本为人类、小鼠或大鼠RNA样本。
进一步地，根据人类、小鼠和大鼠核糖体RNA和线粒体RNA亚基设计，所述的探针序列和保护序列如下表所示，可通用于人类、小鼠和大鼠样本中核糖体RNA和线粒体RNA去除：
进一步地，所述的标记为生物素标记或生物素间臂标记，标记在探针序列的5’端或者3’端。
本发明的第二个目的是提供一种用于去除样本中核糖体RNA和/或线粒体RNA的试剂盒，所述试剂盒中包括异尾双链探针，所述的异尾双链探针由带有标记的探针序列和保护序列组成；所述的探针序列由TH区域、overlap区域和NH区依次连接组成，其中，TH区域和overlap区域根据样本中待去除RNA的亚基片段进行设计，与待去除RNA的亚基片段的部分序列互补，NH序列不与待去除RNA的亚基片段的序列互补；所述的保护序列与探针序列中overlap区域和NH区互补。
进一步地，所述的试剂盒中还包括2x B&W缓冲液(1xTE,1M NaCl，0.1％Tween-20)，1x B&W缓冲液(0.5xTE,0.5M NaCl,0.05％Tween-20)，链霉亲和素磁珠，beads清洗液(0.1MNaCl+0.1M NaOH)，阳性对照和阴性对照。
本发明的有益效果是：
本发明提供由异尾双链探针杂交捕获人类、小鼠和大鼠核糖体RNA和线粒体RNA，达到分离去除核糖体RNA和线粒体RNA的目的。本发明具有操作简单，流程简短，成本低廉，去除效率高，兼容多种商用RNA二代测序建库试剂盒的特点。
附图说明
图1为异尾双链探针的结构设计图；
图2为样本捕获杂交实验流程；
图3为整合基因组浏览器图(IGV)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：人类核糖体RNA异尾双链探针设计
1)从NCBI数据库下载人类/大鼠/小鼠核糖体RNA 45S、18S、5.8S、5S亚基的序列，数据下载后序列比对找到不同物种的这些亚基的共有序列和种内保守序列的位置，并检查预测的RNA二级结构(http://www.unafold.org/mfold/applications/rna-folding-form.php)。
2)针对人类核糖体RNA的共有序列和保守序列分别设计探针，探针位置尽量避免设计在二级结构的双链区域，并考虑吉布斯自由能量的限制条件，探针各部分区域能量具体原则是在0.3M NaCl浓度，60℃条件下同时满足以下条件：
(1)探针序列的TH区域吉布斯自由能为(-4.00～-16.00)kcal/mol；NH端的吉布斯自由能为(-1.00～-12.00)kcal/mol；
(2)探针序列的TH端和NH端的吉布斯自由能差异ΔΔG(ΔGTH-ΔGNH)在(4.00～-15.00)kcal/mol之间；
(3)探针序列的overlap区域吉布斯自由能为(-5.00～-40.00)kcal/mol之间。
表1
核糖体亚基类型
探针数目(条)
28s
51
18s
19
5.8s
3
5s
2
45s
5
共设计完成的人体核糖体RNA探针的数目如表1。
探针设计完成后合成带有生物素或者生物素间臂的探针，探针的贮存浓度为100μM。100ul体系中100ng-1ug总RNA使用的探针量为15pmol。相比已有的技术，因为合成没有使用抗体，RNA探针或者锁核酸等其它修饰，在此浓度下节约了杂交捕获的成本。
依据各部分区域能量原则，本发明根据人类核糖体RNA和线粒体RNA亚基设计得到的探针序列和保护序列如表2所示(序号1～80为探针序列，序号81～160为保护序列)：
表2
实施例2：人类核糖体RNA和线粒体RNA去除
1)取新鲜500ul新鲜人类全血,采用全血总RNA提取试剂盒(杭州新景生物)进行总RNA提取。在2ml离心管中加入1ml buffer L9,加入500μl全血，涡旋振荡30秒混合均匀。13000rpm离心10分钟，吸取700μl离心上清转移到新的1.5ml离心管中，加入500μl无水乙醇；转移600μl前述混合液到核酸纯化柱，纯化柱置于2ml的收集管中，12000rpm离心30秒，丢弃2ml的收集管中的滤液，将核酸纯化柱回到2ml的收集管，将1.5ml离心管中剩余的液体全部倒入核酸纯化柱中，12000rpm离心30秒。丢弃收集管中的滤液，放回核酸纯化柱，在纯化柱中加入500μl buffer WA,12000rpm离心30秒,弃滤液，放回核酸纯化柱，在纯化柱中加入700μl buffer WBR,12000rpm离心30秒。弃滤液，放回核酸纯化柱,14000rpm离心1分钟。丢弃收集管，将核酸纯化柱置于一个RNase-free的1.5ml离心管中，在纯化柱中央加入50μlRNase-free water，室温静置1分钟，12000rpm离心30秒。弃纯化柱，用于后续核糖体RNA和线粒体RNA去除实验。
2)NanoDrop定量RNA，取9份100ng的人类总RNA备用，3份用Probes+Protectors捕获，3份用Probes捕获，3份total用来作对照，直接建库。
3)异尾双链探针混合液制备，包括1.5μl的100μM的probes，3μl的100μM的保protectors，4.5μl 2x B&W缓冲液，和91μl 1x B&W缓冲液。Probes+Protectors混合液振荡离心后，放置于PCR仪器上，并设置touchdown程序为94-25℃，70个循环，每个循环降低1℃。
第二组探针混合液(Probes)，具体包括1.5μl的100μM的探针，1.5μl 2x B&W缓冲液，和97μl 1x B&W缓冲液。
4)杂交捕获：
PCR管中放入100ng RNA,加入同体积的2x B&W缓冲液，加入1x B&W缓冲液至90μl。置于PCR仪器上75℃温浴。离心后加入10μl Probes+Protectors探针混合液或者10μlProbes混合液，上下颠倒混匀样本后置于PCR仪器上，60℃温浴30分钟。
清洗75μl链霉亲和素磁珠(DynabeadsTM MyOneTM Streptavidin T1)，取磁珠放磁力架上澄清后，倒掉上清，加入100μl 1x Beads清洗液，等待澄清并去除上清，用200μl 1xB&W缓冲液重新悬浮磁珠，离开磁力架1分钟再放回磁力架，等待澄清后去除上清，并重复2次上述步骤。用20μl 1x B&W缓冲液悬浮，60℃干式恒温器温浴10分钟，离心后置于磁力架，并去除上清。将磁珠加入RNA的探针混合液中，混匀后60℃温浴15分钟，放回磁力架，取上清作为核糖体RNA去除的样本，并用RNA clean beads纯化RNA样本。
5)一链、二链合成和纯化，使用Illumina TruSeq RNA sample Prep kit V2合成cDNA，具体配置如下反应体系：
PCR仪程序：25℃10min,42℃50min,70℃15min,4℃hold。
反应完成后加入second strand master mix至一链cDNA中，振荡混匀并舜离，置于PCR仪器上1小时。完成后按照AMPure XP磁珠说明纯化产物。
6)末端修复
使用VAHTS Universal DNA Library Prep Kit for Illumina V3构建文库，EndPrep Mix 4解冻后颠倒混匀，于0.2mL PCR管中配置如下反应：
组分
体积
片段化DNA
25μL
End Prep Mix 4
7.5μL
使用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心将反应液收集至管底；将PCR管置于PCR仪中，进行如下反应(105℃热盖)：
温度
时间
20℃
15min
65℃
15min
4℃
Hold
7)接头连接
将Rapid Ligation buffer 2解冻后颠倒混匀，在End Preparation步骤PCR管中配置如下反应：
组分
体积
End Preparation产物
32.5μL
Rapid Ligation buffer 2
12.5μL
Rapid DNA Ligase
2.5μL
DNA Adapter X
2.5μL
使用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心将反应液收集至管底；将PCR管置于PCR仪中，进行如下反应(105℃热盖)：
温度
时间
20℃
15min
4℃
Hold
完成后按照AMPure XP磁珠说明纯化产物。
8)将PCR Primer Mix3，HiFi Amplification Mix解冻后颠倒混匀，在PCR管中配置如下反应：
PCR循环设置如下：
9)核糖体RNA去除效果展示
表中Total指未经探针处理的三个样本，Probes+protectors为经异尾双链探针捕获去除的三个样本，probes为单链探针捕获去除的样本。由表可得，Probes+protectors的平均去除效率可达98.04％，仅用probes的去除效率也达到98.79％。虽然从结果上来看，单独使用探针序列去除效果更好，但是本发明中使用的探针序列的设计是在同时满足探针序列和保护序列的区域能量原则的基础上进行设计的，因此，保护序列也较为重要。
10)线粒体RNA 16S的去除效果
IGV图中，CG240-C1和CG240-C2代表probes探针的捕获去除效果；CG240-CP1和CG240-CP2代表probes+protectors探针的捕获去除效果；CG240-T1和CG240-T2代表未经探针处理的样本。经计算可知，高达96％的线粒体RNA 16S被去除。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。