壬二酸预防蒽环类抗肿瘤药物心肌毒性的应用
阅读说明：本技术 壬二酸预防蒽环类抗肿瘤药物心肌毒性的应用 (Application of azelaic acid in preventing cardiotoxicity of anthracycline antitumor drugs ) 是由 原阳 邢东明 高远真 邹林峰 李梦娇 卢琦 叶婷 张钰坤 刘振 柳欣林 张仁帅 于 2021-07-30 设计创作，主要内容包括：本发明属于防治心脏毒性的药物技术领域,具体涉及壬二酸预防蒽环类抗肿瘤药物心肌毒性的应用。壬二酸可以降低蒽环类抗肿瘤药物所致的心肌毒性,改善氧化应激反应,缓解细胞凋亡,从而降低阿霉素心脏毒性引起的致死性。本发明可以用于预防和减轻蒽环类抗肿瘤药物诱导的心肌毒性,具有临床实用性。(The invention belongs to the technical field of medicines for preventing and treating cardiotoxicity, and particularly relates to application of azelaic acid in preventing cardiotoxicity of anthracycline antitumor medicines. Azelaic acid can reduce cardiotoxicity caused by anthracycline antineoplastic drugs, improve oxidative stress reaction and relieve cell apoptosis, thereby reducing lethality caused by adriamycin cardiotoxicity. The invention can be used for preventing and reducing the myocardial toxicity induced by anthracycline antitumor drugs and has clinical practicability.)
技术领域
本发明属于防治心脏毒性的药物
技术领域
，具体涉及壬二酸预防蒽环类抗肿瘤药物心肌毒性的应用。背景技术
蒽环类药物包括阿霉素、柔红霉素、阿克拉霉素、伊达比星、表柔比星和米托蒽醌等，其中阿霉素(adriamycin)，又称多柔比星(DOX),是临床上常用的广谱抗肿瘤药物之一，被广泛地应用于治疗白血病、实体瘤、淋巴瘤、乳腺癌等肿瘤治疗，并取得了很好的疗效。但这类药物对心肌组织具有较高的亲和力，会产生累积性和剂量依赖性的心肌毒性，进一步发展成不可逆性心肌损伤，最终导致充血性心力衰竭，可能威胁生命，并且这种心脏毒性可出现在用药后不久、用药期间、治疗后，甚至停药后的数年或数十年，因此，这严重地限制了其在临床上的应用。
当前普遍认为，活性氧自由基和脂质过氧化引起的氧化应激增加、钙超载、能量代谢障碍、线粒体损伤、细胞凋亡等在DOX心脏毒性中起着重要作用。为了解决蒽环类药物临床应用的局限性，研究人员开展了大量的蒽环类药物引起心脏毒性的防治辅助治疗药物研究，主要包括线粒体保护剂、细胞凋亡抑制剂、铁离子螯合剂、抗氧化剂、自由基清除剂等。
多种化学物质已被研究，铁离子螯合剂右雷佐生(dexrazoxane)是目前FDA批准的唯一用于防治蒽环类抗肿瘤药物心脏毒性的保护剂，疗效显著并应用于临床，但该类药物治疗也存在一定的缺陷，可能会引起严重的骨髓抑制，影响阿霉素对某些恶性肿瘤的活性；其次该药物价格昂贵，而且只能以乳酸溶液溶解后缓慢静推，使其应用受到很大的限制。
针对蒽环类药物在临床治疗中出现的毒副作用，有学者曾设计合成果胶-阿霉素轭合物和木葡聚糖-阿霉素前体药物制剂等，改变药物的生物分布，改善药代动力学以及药效学性质，然而轭合物造价昂贵且载药量低，影响对肿瘤的治疗效果。此外，蒽环类抗肿瘤药物的脂质体制剂可减少药物在心脏的积蓄，增加药物在肿瘤组织的分布，从而减轻剂量依赖的急性毒性，比如已上市的阿霉素脂质体、柔红霉素脂质体等，但药物被包封在内水相，只有从脂质体中释放出来才能发挥效果，并且脂质体的制备过程复杂，以上缺点限制了蒽环类抗肿瘤药物脂质体制剂的广泛应用。因此，当前迫切需要寻找治疗效果良好且价格经济实惠的预防措施。
发明内容
根据现有技术上存在的缺陷，结合目前的研究前沿，本发明提供了壬二酸预防蒽环类抗肿瘤药物心肌毒性的应用，壬二酸与蒽环类抗肿瘤药物联合用药降低心肌毒性。实验证明，壬二酸可以降低阿霉素所致的心肌毒性，改善氧化应激反应，缓解细胞凋亡，从而降低阿霉素心脏毒性引起的致死性。本发明可以用于预防和减轻阿霉素诱导的心肌毒性，具有临床实用性。
本发明是采用以下的技术方案实现的：
本发明提供了壬二酸预防蒽环类抗肿瘤药物心肌毒性的应用。
本发明还提供了壬二酸作为蒽环类抗肿瘤药物心肌毒性抑制剂的应用。
其中，所述壬二酸为1,7-二羧基庚烷，结构式如式I所示：
具体地，所述蒽环类抗肿瘤药物包括阿霉素、柔红霉素、阿克拉霉素、伊达比星、表柔比星或米托蒽醌中的至少一种。
本发明的应用，用于制备抑制蒽环类抗肿瘤药物所致的心肌损伤的药物混合物、药物组合物。
进一步地，作为本发明的一个优选方案，所述药物混合物或药物组合物中，包括壬二酸和蒽环类抗肿瘤药物。
本发明还提供一种药物混合物或药物组合物，其活性成分包括壬二酸，
所述药物混合物或药物组合物具有下述1)-5)中至少一种功能：
1)预防和/或治疗蒽环类化疗药的心肌毒性；
2)缓解蒽环类化疗药引起的心肌细胞乳酸脱氢酶
3)降低蒽环类化疗药引起的活性氧自由基升高；
4)缓解蒽环类化疗药引起的心肌细胞脂质过氧化；
5)缓解蒽环类化疗药引起的线粒体膜去极化及细胞凋亡。
具体的，所述药物混合物或药物组合物为药学上可接受的任意剂型，包括片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、混悬剂和溶液剂中的至少一种。
本技术的核心在于，壬二酸(azelaic acid)，又叫杜鹃花酸，是一种白色至微黄色单斜棱晶、针状结晶或粉末，属于中长链二元酸的一种，存在于烤烟烟叶、白肋烟烟叶、香料烟烟叶中，也可通过化学方法合成，被应用于抑制活性氧自由基的产生，抑制细胞增殖，抗炎等。壬二酸作为一种非抗生素类局部应用的治疗痤疮药物，不易产生耐药性，使用安全。
壬二酸对心肌细胞乳酸脱氢酶LDH、活性氧ROS、超氧化物歧化酶SOD、丙二醛MDA、ATP水平的影响，以上检测结果反映出壬二酸可显著降低阿霉素诱导的心肌细胞毒性以及氧化应激水平，增加抗氧化酶活性，缓解细胞凋亡情况，从而推断壬二酸可预防和减轻阿霉素诱导的心肌毒性。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)本发明为预防蒽环类抗肿瘤药物引发的心肌毒性的方法提供了新思路、新方法。壬二酸可通过天然植物提取，也可通过化学方法合成，无明显不良反应，可口服或局部应用，易被接受，利于临床推广和应用。
(2)本发明研究发现在细胞模型实验中可显著降低阿霉素引起的心肌细胞毒性，具体表现在显著降低氧化应激水平，增加超氧化物歧化酶活性，且显著降低细胞凋亡率。本发明对阿霉素所诱导的心脏毒性有显著的保护效果，从而扩大阿霉素的临床应用。
附图说明
图1为实施例1中不同浓度壬二酸对阿霉素H9c2心肌细胞活性的影响对比图；
图2为实施例2中壬二酸对阿霉素H9c2心肌细胞LDH释放的影响对比图；
图3为实施例3中壬二酸对阿霉素H9c2心肌细胞ROS水平的影响对比图；
图4为图3的荧光信号强度数据图；
图5为实施例4中壬二酸对阿霉素H9c2心肌细胞SOD水平的影响对比图；
图6为实施例5中壬二酸对阿霉素H9c2心肌细胞MDA水平的影响对比图；
图7为实施例6中壬二酸对阿霉素H9c2心肌细胞ATP水平的影响对比图；
图8为实施例7中壬二酸对阿霉素H9c2心肌细胞凋亡的影响对比图；
图9为图8的荧光信号强度数据图；
图10为实施例8中壬二酸对阿霉素H9c2心肌细胞线粒体膜电位的影响对比图；
图11为图10的荧光信号强度数据图。
具体实施方式
为了使本发明目的、技术方案更加清楚明白，下面结合附图，对本发明作进一步详细说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下列实施例采用的材料如下：
本发明所述蒽环类抗生素优选包括阿霉素、柔红霉素、阿克拉霉素、伊达比星、吡柔比星或米托蒽醌中的一种，在本发明实施例中以阿霉素为例进行相应实验。
心肌细胞为H9c2细胞株，-80℃冷冻保存。
右雷佐生(DEXRA)：购自公司湖北威德利化学科技有限公司；货号Y694。
壬二酸(Aza)：分子式C9H16O4，CAS编号123-99-9，购自公司西安恩肽元生物科技有限公司；货号ETYSW201009-1。
DCFH-DA活性氧ROS荧光探针：购自公司大连美仑生物技术有限公司；货号MB4682；用量1ml；孵育时间15～60min；荧光波段：激发波长504nm，发射波长529nm。
CCK-8试剂盒，购自公司大连美仑生物技术有限公司；货号MA0218-L-10000T。
LDH检测试剂盒，购自公司北京索莱宝科技有限公司；货号BC0685。
CuZn/Mn-SOD活性检测试剂盒，购自公司上海碧云天生物技术有限公司；货号S0103。
TUNEL细胞凋亡检测试剂盒，购自公司上海碧云天生物技术有限公司；货号C1088。
ATP检测试剂盒，购自公司上海碧云天生物技术有限公司；货号，S0026B。
脂质氧化(MDA)检测试剂盒，购自公司上海碧云天生物技术有限公司；货号S0131S。
线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)，购自公司北京索莱宝科技有限公司；货号M8650-100T。
心肌细胞完全培养基溶液：体积比为89％DMEM+10％FBS(FBS:胎牛血清，购自公司大连美仑生物技术有限公司；货号PWL001)+1％双抗(双抗：青霉素/链霉素溶液，购自公司大连美仑生物技术有限公司；货号MA0110)
实施例1、壬二酸对阿霉素H9c2心肌细胞活性的影响
H9c2心肌细胞用培养基稀释为105/ml的细胞悬液，并接种于96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液，培养24h后，进行药物处理。分别设control组、阳性对照组(20μM右雷佐生+5μM阿霉素)、以及不同浓度(10μM、20μM、30μM、40μM)的壬二酸溶液(各浓度含有5μM阿霉素)组。培养24h后，以CCK-8细胞活力检测进行测定，使用酶标仪测定450nm处的吸光度，计算心肌细胞活性。
结果如图1所示，图中“*”表示与空白组相比，存在统计学差异，P<0.05；“*”表示与阿霉素组相比，存在统计学差异，P<0.05。相对于control组细胞活性120.06％，5μM阿霉素(Dox)组细胞活性为44.33％，阳性对照组细胞活性为121.46％，而合并使用10μM、20μM、30μM、40μM的壬二酸(Aza)后，细胞活性分别为110.02％、64.19％、49.00％、38.96％。α＝0.05水平下，10μM Aza+5μM Dox组与5μM Dox组存在显著性，后续实验采用10μM Aza。
实施例2、壬二酸对阿霉素H9c2心肌细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放的影响
H9c2心肌细胞用培养基稀释为106/ml的细胞悬液，并接种于6孔板中，每孔加入2mL细胞悬液，培养24h后，进行药物处理。分别设control组、阳性对照组(20μM右雷佐生+5μM阿霉素)、以及10μM壬二酸(含5μM阿霉素)溶液组。培养24h后，利用LDH检测试剂盒进行测定。
参照图2，图中“*”表示与空白组相比，存在统计学差异，P<0.05；“#”表示与阿霉素组相比，存在统计学差异，P<0.05。阿霉素组引起血清中乳酸脱氢酶的含量显著升高，与control组相比P<0.05；壬二酸治疗组细胞上清液血清中乳酸脱氢酶的含量接近于control组，与阿霉素组相比存在统计学差异P<0.05。
实施例3、壬二酸对阿霉素H9c2心肌细胞活性氧(ROS)水平的影响
H9c2心肌细胞用培养基稀释为106/ml的细胞悬液，并接种于6孔板中，每孔加入2mL细胞悬液，培养24h后，进行药物处理。分别设control组、阳性对照组(20μM右雷佐生+5μM阿霉素)、以及10μM壬二酸(含5μM阿霉素)溶液组。培养24h后，装载DCFH-DA探针，利用激光共聚焦显微镜拍摄(图3)，利用ImageJ图像处理软件处理图像(图4)。
图4中“*”表示与空白组相比，存在统计学差异，P<0.05；“#”表示与阿霉素组相比，存在统计学差异，P<0.05。阿霉素组引起ROS水平显著升高，与control组相比P<0.05；壬二酸治疗组ROS水平与阿霉素组相比存在统计学差异P<0.05，降低了ROS水平，并且效果优于阳性对照。
实施例4、壬二酸对阿霉素H9c2心肌细胞超氧化物歧化酶(SOD)水平的影响
H9c2心肌细胞用培养基稀释为106/ml的细胞悬液，并接种于6孔板中，每孔加入2mL细胞悬液，培养24h后，进行药物处理。分别设control组、阳性对照组(20μM右雷佐生+5μM阿霉素)、以及10μM壬二酸(含5μM阿霉素)溶液组。培养24h后，按照检测盒试剂(S0103，CuZn/Mn-SOD活性检测试剂盒)说明书进行操作。
结果如图5，图中“*”表示与空白组相比，存在统计学差异，P<0.05；“#”表示与阿霉素组相比，存在统计学差异，P<0.05。阿霉素组引起SOD水平显著降低，与control组相比P<0.05；壬二酸治疗组SOD水平与阿霉素组相比存在统计学差异P<0.05，提高了SOD水平。
实施例5、壬二酸对阿霉素H9c2心肌细胞丙二醛(MDA)水平的影响
H9c2心肌细胞用培养基稀释为106/ml的细胞悬液，并接种于6孔板中，每孔加入2mL细胞悬液，培养24h后，进行药物处理。分别设control组、阳性对照组(20μM右雷佐生+5μM阿霉素)、以及10μM壬二酸(含5μM阿霉素)溶液组。培养24h后，按照检测盒试剂(S0131S，脂质氧化(MDA)检测试剂盒)说明书进行操作。
参照图6，图中“*”表示与空白组相比，存在统计学差异，P<0.05；“#”表示与阿霉素组相比，存在统计学差异，P<0.05。阿霉素组引起MDA水平显著增加，与control组相比P<0.05；壬二酸治疗组MDA水平与阿霉素组相比存在统计学差异P<0.05，降低了MDA水平。
实施例6、壬二酸对阿霉素H9c2心肌细胞ATP水平的影响
H9c2心肌细胞用培养基稀释为106/ml的细胞悬液，并接种于6孔板中，每孔加入2mL细胞悬液，培养24h后，进行药物处理。分别设control组、阳性对照组(20μM右雷佐生+5μM阿霉素)、以及10μM壬二酸(含5μM阿霉素)溶液组。培养24h后，按照检测盒试剂(S0026B，ATP检测试剂盒)说明书进行操作。
参照图7，图中“*”表示与空白组相比，存在统计学差异，P<0.05；“#”表示与阿霉素组相比，存在统计学差异，P<0.05。阿霉素组引起ATP含量显著降低，与control组相比P<0.05；壬二酸治疗组ATP含量与阿霉素组相比存在统计学差异P<0.05，增加了ATP含量。
实施例7、壬二酸对阿霉素H9c2心肌细胞凋亡的影响
H9c2心肌细胞用培养基稀释为106/ml的细胞悬液，并接种于6孔板中，每孔加入2mL细胞悬液，培养24h后，进行药物处理。分别设control组、阳性对照组(20μM右雷佐生+5μM阿霉素)、以及10μM壬二酸(含5μM阿霉素)溶液组。培养24h后，按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(C1088，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒)说明书进行操作。染色后经处理，利用激光共聚焦显微镜拍摄(图8)，利用ImageJ图像处理软件处理图像(图9)。
根据图9显示，图中“*”表示与空白组相比，存在统计学差异，P<0.05；“#”表示与阿霉素组相比，存在统计学差异，P<0.05。阿霉素组引起细胞凋亡率显著增加，与control组相比P<0.05；壬二酸治疗组细胞凋亡率与阿霉素组相比存在统计学差异P<0.05，降低了细胞凋亡率。
实施例8、壬二酸对阿霉素H9c2心肌细胞线粒体膜电位的影响
H9c2心肌细胞用培养基稀释为106/ml的细胞悬液，并接种于6孔板中，每孔加入2mL细胞悬液，培养24h后，进行药物处理。分别设control组、阳性对照组(20μM右雷佐生+5μM阿霉素)、以及10μM壬二酸(含5μM阿霉素)溶液组。培养24h后，按照检测盒试剂(M8650-100T，线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1))说明书进行操作。经处理，利用激光共聚焦显微镜拍摄(图10)，利用ImageJ图像处理软件处理图像(图11)。
参照图11，图中“*”表示与空白组相比，存在统计学差异，P<0.05；“#”表示与阿霉素组相比，存在统计学差异，P<0.05。阿霉素组显著引起细胞去极化，与control组相比P<0.05；壬二酸治疗组与阿霉素组相比存在统计学差异P<0.05，缓解了细胞去极化。
当然，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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