Pim1小分子抑制剂在制备防治强直性脊柱炎产品中的应用
阅读说明：本技术 Pim1小分子抑制剂在制备防治强直性脊柱炎产品中的应用 (Application of Pim1 small-molecule inhibitor in preparation of product for preventing and treating ankylosing spondylitis ) 是由 沈慧勇 吴燕峰 苏泽鹏 谢中瑜 李进腾 于 2021-07-26 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药生物技术领域,具体涉及Pim1小分子抑制剂在制备防治强直性脊柱炎产品中的应用,本发明使用Pim1的特异性小分子抑制剂AZD1208,通过体内及体外实验证明了Pim1在Th17分化中的重要作用,证实了Pim1可作为阻断Th17分化与IL-17A分泌的靶点,并验证了用AZD1208治疗AS的安全性、有效性、可行性。与IL-17A单克隆抗体相比,pim1通过阻断Th17分化治疗AS,在机制上处于IL-17A单克隆抗体作用的上游,因此本发明能为治疗AS提供了新的靶点以及新的途径,为AS患者尤其是IL-17A单克隆抗体治疗效果不佳的患者提供新的选择。(The invention belongs to the technical field of medical biology, and particularly relates to an application of a Pim1 small-molecule inhibitor in preparation of a product for preventing and treating ankylosing spondylitis, wherein a specific small-molecule inhibitor AZD1208 of Pim1 is used, in-vivo and in-vitro experiments prove that Pim1 plays an important role in Th17 differentiation, so that Pim1 can be used AS a target for blocking Th17 differentiation and IL-17A secretion, and the safety, effectiveness and feasibility of using AZD1208 to treat AS are verified. Compared with the IL-17A monoclonal antibody, the pim1 treats the AS by blocking Th17 differentiation, and is positioned upstream of the effect of the IL-17A monoclonal antibody in mechanism, so the invention can provide a new target and a new way for treating the AS and provides a new choice for AS patients, particularly patients with poor treatment effect of the IL-17A monoclonal antibody.)
技术领域
本发明属于医药生物
技术领域
，具体涉及Pim1小分子抑制剂在制备防治强直性脊柱炎产品中的应用。背景技术
强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis,AS)是一种常见的自身免疫性疾病。AS发病率较高，在我国约为0.2-0.54％，好发于青壮年，男女比例为2-3:1。AS的病理特征为累及中轴骨关节的慢性进行性炎症与病理性成骨，临床主要表现为炎性腰背痛和中轴骨关节强直畸形，在疾病的慢性进展中，患者的劳动能力逐渐下降甚至丧失，严重影响生活质量。因AS无法完全治愈，给国家和个人带来了沉重的经济负担。
目前，AS的发病机制尚未完全阐明，但近年来越来越多的研究表明，Th17细胞及其分泌的IL-17A在AS的发生发展中起到重要的推动作用。Th17由外周血T细胞发育而来，其分化水平与AS疾病活动度呈正相关关系，其分泌的IL-17A参与了AS病理生理的多个过程。IL-17A在AS起止点炎的早期起到推动作用，介导炎症发生，同时IL-17A又充当起止点炎的放大器，诱导局部的间质细胞产生炎性因子参与炎症的反应过程。在骨组织中，IL-17A抑制成骨细胞和软骨细胞产生基质，诱导成骨细胞表达RANKL，激活破骨细胞，造成骨破坏。此外，IL-17A在AS患者的腰背痛症状中起到了敏化的作用，IL-17A通过降低疼痛感受器的刺激阈值，使患者对炎症刺激更加敏感，从而感受到更强的疼痛感。
目前，临床上治疗AS的药物主要有非甾体抗炎药(NSAIDs)、肿瘤坏死因子抑制剂(TNFi)、缓解病情抗风湿药(DMARDs)等。其中，NSAIDs类药物能改善部分患者腰背疼痛、晨僵、关节肿痛的症状，但仍有部分患者对NSAIDs类药物的治疗反应较差，且长期服用副作用明显。DMARDs类药物主要用于治疗外周关节炎者，但其对脊柱病变为主的AS治疗效果较差。TNFi能阻断TNF的活性，抑制病变进展，适用于NSAIDs类治疗无效、有关节外症状者。基于IL-17A在AS发生发展中的重要作用及临床评估，IL-17A单克隆抗体secukinumab于2020年在我国被批准用于治疗AS。Secukinumab虽在临床上展现了一定的治疗效果，但对部分AS患者仍存在效果不佳的情况。此外，Secukinumab价格昂贵，其使用对多数患者造成了较大的经济负担，因而普适性不高。因此，需要探索新的AS治疗靶点，并寻找特异性抑制该靶点的小分子抑制剂，以期为临床治疗AS带来安全有效的新方法。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明通过体内及体外实验发现，以Pim1作为新靶点，通过AZD1208等Pim1的特异性小分子抑制剂可以有效防治强直性脊柱炎，为强直性脊柱炎的防治提供了新的靶标，新的途径。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明的首要目的是提供Pim1小分子抑制剂在制备防治强直性脊柱炎产品中的应用，所述Pim1小分子抑制剂为分子量小于1000Da的生物功能分子。
优选地，所述Pim1小分子抑制剂包括但不限于pim1特异性抑制剂AZD1208。
AZD1208的分子式为C21H21N3O2S，分子量为379.48，结构如下所示：
Th17及其分泌的IL-17A在AS发生发展中具有重要作用，目前临床上已有拮抗IL-17A的单克隆抗体用于治疗AS，但对部分患者治疗效果仍然欠佳。
Th17来源于CD4+T细胞，其分化包括激活、增殖与分化等步骤，在分子水平涉及多条Ca2+相关通路与多种蛋白的磷酸化，Th17及其分泌的IL-17A在AS的发生发展中具有重要的作用。Pim1是细胞内的一种磷酸化激酶，能够结合蛋白质并将其磷酸化，能调节细胞内的Ca2+通路，且具有抗凋亡、促增殖的作用，因此可能是调控Th17分化的潜在靶点。
因此，本发明从IL-17A的源头出发，探索抑制Th17分化的靶点，阻断IL-17A的分泌，并着手于小分子化合物，探索安全、有效且具有高普适性的药物用于治疗AS。本发明将Pim1作为新的AS治疗靶点，发现使用Pim1的特异性小分子抑制剂AZD1208可以抑制CD4+T细胞向Th17分化，在IL-17A产生的源头上阻断了其分泌，对AS具有较好的疗效，且在体内与体外实验中均体现出较好的抗炎效果，亦体现出低毒性的特点。提示通过Pim1小分子抑制剂，以Pim1作为靶点，可以有效防治AS。
优选地，所述防治强直性脊柱炎为抑制Th17的分化。
优选地，所述防治强直性脊柱炎产品包括但不限于防治强直性脊柱炎的药物和防治强直性脊柱炎的保健功能食品。
本发明的第二个目的是提供一种防治强直性脊柱炎的药物，该药物以Pim1小分子抑制剂为主要活性成分。
优选地，所述Pim1小分子抑制剂包括但不限于pim1特异性抑制剂AZD1208。
优选地，为提高药品的适用范围，该药物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。所述载体和/或辅料包括酸味剂、调色剂、香味剂、甜味剂，或其组合。
优选地，药物的剂型包括但不限于注射剂、口服液、片剂、冲剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂。
本发明的第三个目的是提供一种防治强直性脊柱炎的保健功能食品，该食品以Pim1小分子抑制剂为主要活性成分。
优选地，所述Pim1小分子抑制剂包括但不限于pim1特异性抑制剂AZD1208。
优选地，为提高食品的适用范围，该食品还包括食品上可接受的载体和/或辅料。所述载体和/或辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、甜味剂、香味剂，或其组合。
优选地，食品的形式包括但不限于汤剂、饮料、糖果、口服液、胶囊剂、片剂和粉剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明使用Pim1的特异性小分子抑制剂AZD1208，通过体内及体外实验证明了Pim1在Th17分化中的重要作用，证实了Pim1可作为阻断Th17分化与IL-17A分泌的靶点，并验证了用AZD1208治疗AS的安全性、有效性、可行性。同时，与IL-17A单克隆抗体相比，pim1通过阻断Th17分化治疗AS，在机制上处于IL-17A的上游，因此本发明能为治疗AS提供了新的靶点以及新的途径，为AS患者尤其是IL-17A单克隆抗体治疗效果不佳的患者提供新的选择。
附图说明
图1为实施例1的实验流程图；
图2为CD4+T细胞向Th17分化过程中Pim1的表达情况；
图3为AZD1208抑制剂处理后CD4+T细胞向Th17分化的情况；
图4为AZD1208对CD4+T细胞的毒性作用；
图5为pim1特异性抑制剂AZD1208注射处理后CIA小鼠的关节炎评分情况；
图6为pim1特异性抑制剂AZD1208注射处理后CIA小鼠的肝肾功能指标变化情况。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
实施例1 Pim1小分子抑制剂通过抑制Th17的分化对强直性脊柱炎具有防治疗效
实验流程如图1所示，具体过程如下：
1、体外实验
(1)抑制Pim1对Th17分化的影响
使用人CD4磁珠(购买自美天旎，货号130-045-101)从人外周血单个核细胞(来源于健康的献血志愿者)中分选出CD4+T细胞，具体的分选方法如下：
将外周血按1:1的体积比轻轻加入Ficoll分离液之上，400g的转速(加速度1、减速度0)下离心35min，离心后用巴氏吸管小心吸取白膜层，用PBS清洗两次，离心去上清并用含有10％FBS的1640培养基重悬细胞，计数后按每106个细胞加入2uL磁珠与8uLbuffer(PBS100mL+0.5％BSA(0.5g)+2mM EDTA(0.654g)，用NaOH调节PH到7.2，过滤除菌)，充分混匀，避光、4度孵育15分钟。加入适量buffer，300g离心10min，弃上清，按500μL buffer/108个重悬细胞。将分离柱置于磁力架，用buffer润洗后，将细胞打入分选柱中，用buffer清洗3次，将分选柱从磁力架取下，加入1mL buffer，冲出分选柱中的细胞，1500转离心5min，弃去上清，用1mL含10％FBS的1640培养基重悬，计数，按0.6×106细胞/孔种板。
在Th17极化条件下(anti-CD3 1ug/mL，anti-CD28 1ug/mL，IL-23 30ng/mL，IL-620ng/mL，TGF-β5ng/mL)诱导CD4+T细胞向Th17分化，同时给予pim1特异性小分子抑制剂AZD1208 20uM或等体积的DMSO处理细胞，培养3天后，以CD4及IL-17A为标记，通过流式细胞术检测Th17分化的比例。
如图2、图3所示，发现CD4+T细胞向Th17分化过程中Pim1的表达上调，但使用AZD1208抑制Pim1活性后，Th17分化的比例显著下降；
(2)AZD1208抑制剂对CD4+T细胞的毒性
使用CCK-8酶标定量法检测药物对细胞的毒性。具体的检测为：向96孔板中加入100uL Th17极化培养的CD4+T细胞(约5000个细胞)，分别加入AZD1208或等体积的DMSO，同时设置加入不含细胞的培养液作为空白对照，每组设置5个复孔。向每个孔中加入10uLCCK-8溶液，孵育2小时，使用酶标仪在450nm测定吸光度。在检测范围内，450nm处吸光度与细胞活性大致成正比例关系。
如图4所示，发现使用AZD1208抑制Pim1对CD4+T细胞毒性较低。
2、体内实验
(1)抑制Pim1对CIA的治疗作用
使用6-8周龄的DBA/1雌性小鼠(购自江苏集萃药康生物科技有限公司)作为关节炎诱导对象，将CFA(弗氏完全佐剂，1mg/mL)和二型胶原(2mL/mL)置于冰上完全乳化后转移到1mL针筒内，离心，然后给每只小鼠腹股沟皮内注射100uL。21天后加强免疫(弗氏不完全佐剂IFA+二型胶原)，建立胶原诱导的关节炎模型(CIA)，按每组5只将CIA小鼠分为实验组与对照组。使用DMSO溶解AZD1208配制成60mg/mL的溶液，并用甲基纤维素稀释成3mg/mL的悬浊液，按照30mg/kg体重，1次/天的剂量，通过灌胃给予AZD1208(对照：同等比例的甲基纤维素与DMSO)治疗CIA，连续给药21，每3天进行一次关节炎评分。
如图5所示，连续给药21天后，发现Pim1的特异性小分子抑制剂AZD1208能显著降低CIA小鼠的关节炎评分。
(2)AZD1208抑制剂在体内的毒性作用
上述CIA小鼠连续给药21天后，在第21天脊椎脱臼处死小鼠，收集外周血检测肝肾功能指标【用MDH法检测血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)、用乳酸脱氢酶法检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、用苦味酸法检测血清肌酐(Scr)、用尿素酶-谷氨酸脱氢酶法检测血清尿素氮(BUN)】。如图6所示，发现使用AZD1208在体内抑制Pim1活性不会引起严重的肝肾功能损害。
通过上述实验可知，Pim1特异性小分子抑制剂AZD1208可以抑制CD4+T细胞向Th17分化，在IL-17A产生的源头上阻断了其分泌，对强直性脊柱炎(AS)具有较好的疗效，且在体内与体外实验中均体现出较好的抗炎效果，亦体现出低毒性的特点。可见，Pim1可作为AS治疗的新靶点。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。