具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

以下实施例中，所用的主要试剂及抗体如下：

spike-RBD蛋白(Genscript)；伊巴斯汀(Selleck)；氯雷他定(Selleck)；anti-Avidin-FITC(Invitrogen)；ReverTra qPCR RT Master Mix gDNA remove(Toyobo)；SYBRqPCR Mix(Genestar)；

免疫荧光抗体：Alexa Fluor647-anti-IL-1β(Biolegend，JK1B-1)，PE-anti-IL-6(BD，MQ2-6A3)，Alexa Fluor488-anti-TNFα(BD，MAb11)，BV421-anti-IL-8(BD，G265-8)；

RPMI-1640培养基(GIBCO)；胎牛血清(FBS)(Millipore)；二甲基亚砜(DimethylSulphoxide，DMSO)(Sigma)；多聚甲醛固定液(Paraformaldehyde，PFA)(Sigma)；磷酸缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)(Hyclone)；Triton-X100(Sigma)；Trizol(Invitrogen)；甲苯胺蓝(Sigma)；FACS缓冲液(Fluorescence activated Cell Sorting，FACS)；白细胞活化试剂(BD，550583)；固定/破膜液(BD，554722)。

若无特殊说明，其余所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商。

以下实施例中，若无特殊说明，所用实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。其中，所涉及到的引物序列如下：

人源：IL-6-F(SEQ ID NO.1)，5′-CAGACAGCCACTCACCTCTTCAG-3′；

IL-6-R(SEQ ID NO.2)，5′-CAGCCATCTTTGGAAGGTTCAG-3′；

TNF-α-F(SEQ ID NO.3)，5′-CCCAGGCAGTCAGATCATCTTC-3′；

TNF-α-R(SEQ ID NO.4)，5′-GTGAGGAGCACATGGGTGGAG-3′；

MMP9-F(SEQ ID NO.5)，5′-CCTTCTACGGCCACTACTGTGC-3′；

MMP9-R(SEQ ID NO.6)，5′-GCCAGTACTTCCCATCCTTGAAC-3′；

GAPDH-F(SEQ ID NO.7)，5′-ATCCCATCACCATCTTCCAGG-3′；

GAPDH-R(SEQ ID NO.8)，5′-CCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′；

IL-1β-F(SEQ ID NO.9)，5′-CGTCAGTTGTTGTGGCCATGGA-3′；

IL-1β-R(SEQ ID NO.10)，5′-GAGCGTGCAGTTCAGTGATCGTA-3′；

IL-8-F(SEQ ID NO.11)，5′-CTGATTTCTGCAGCTCTGTGTGA-3′；

IL-8-R(SEQ ID NO.12)，5′-GGTCCAGACAGAGCTCTCTTCCA-3′；

CCL20-F(SEQ ID NO.13)，5′-GCTGCTTTGATGTCAGTGCT-3′；

CCL20-R(SEQ ID NO.14)，5′-TGTCACAGCCTTCATTGGC-3′；

CCL5-F(SEQ ID NO.15)，5′-ACCACACCCTGCTGCTTTG-3′；

CCL5-R(SEQ ID NO.16)，5′-GCGGTTCTTTCGGGTGACA-3′；

鼠源：IL-6-F(SEQ ID NO.17)，5′-CTTCCATCCAGTTGCCTTCTTG-3′；

IL-6-R(SEQ ID NO.18)，5′-AATTAAGCCTCCGACTTGTGAAG-3′；

TNF-α-F(SEQ ID NO.19)，5′-CAGACCCTCACACTCAGATCATCT-3′；

TNF-α-R(SEQ ID NO.20)，5′-CCTCCACTTGGTGGTTTGCTA-3′；

IL-1β-F(SEQ ID NO.21)，5′-CTTTCAGAGGCCAGAGAGTCC-3′；

IL-1β-R(SEQ ID NO.22)，5′-TCCCTGTAGTGACAGCACCT-3′；

IL-8-F(SEQ ID NO.23)，5′-CGGCAATGAAGCTTCTGTAT-3′；

IL-8-R(SEQ ID NO.24)，5′-CCTTGAAACTCTTTGCCTCA-3′；

INFγ-F(SEQ ID NO.25)，5′-ATGAACGCTACACACTGCATC-3′；

INFγ-R(SEQ ID NO.26)，5′-CCATCCTTTTGCCAGTTCCTC-3′；

GAPDH-F(SEQ ID NO.27)，5′-TGCACCACCAACTGCTTAG-3′；

GAPDH-R(SEQ ID NO.28)，5′-GATGCAGGGATGATGTTC-3′；

CRP-F(SEQ ID NO.29)，5′-CAGAGATTCCTGAGGCTCCAACA-3′；

CRP-R(SEQ ID NO.30)，5′-AGTCACCGCCATACGAGTCCTG-3′；

CCL20-F(SEQ ID NO.31)，5′-AAGACAGATGGCCGATGAAG-3′；

CCL20-R(SEQ ID NO.32)，5′-AGGTTCACAGCCCTTTTCAC-3′；

CCL5-F(SEQ ID NO.33)，5′-GTGCCCACGTCAAGGAGTAT-3′；

CCL5-R(SEQ ID NO.34)，5′-GGGAAGCTATACAGGGTCA-3′；

qRT-PCR检测病毒载量引物如下：

N-F(SEQ ID NO.35)，5′-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3′；

N-R(SEQ ID NO.36)，5′-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3′；

探针序列(SEQ ID NO.37)为：

5′-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3′。

所有动物实验均由中国科学院广州生物研究院和中国科学院昆明动物所实验动物福利与伦理委员会批准。所有SARS-CoV-2感染实验均在生物安全Ⅲ级实验室内进行。

实施例1

本实施例用于验证氯雷他定或伊巴斯汀能够抑制LAD2脱颗粒。

(1)将5×10⁵LAD2细胞/孔接种于24孔细胞培养板，分别加入依巴斯汀(3μg/mL)和氯雷他定(5μg/mL)孵育20小时；

(2)用SARS-CoV-2sipke-RBD(10μg/mL)刺激细胞(即得到实验组Eba.+RBD和Lor.+RBD)，用spike包装的慢病毒刺激细胞(即得到实验组Eba.+假病毒和Lor.+假病毒)，分别在30分钟和2小时收集细胞；

(3)用4％多聚甲醛(PFA)室温固定细胞30分钟，PBS洗3遍，之后用anti-Avidin-FITC在4℃避光孵育1小时，PBS洗3次之后进行流式检测；

所得如图1所示，spike-RBD蛋白或spike包装的慢病毒可以诱导肥大细胞脱颗粒，而使用伊巴斯汀或氯雷他定处理后，细胞的脱颗粒水平显著低于spike-RBD单独刺激，说明氯雷他定或伊巴斯汀的单独使用可抑制由spike-RBD诱导的脱颗粒。

实施例2

本实施例用于验证氯雷他定和伊巴斯汀对SARS-CoV-2引发的炎症因子风暴的抑制作用。

(1)将5×10⁵LAD2细胞/孔接种于24孔细胞培养板，分别加入依巴斯汀(3μg/mL)和氯雷他定(5μg/mL)孵育20小时；

(2)再用sipke-RBD(10μg/mL)刺激细胞2小时后，收集细胞上清用于培养A549细胞，得到Eba.+RBD组和Lor.+RBD组；

(3)24小时后收集A549细胞，分别通过定量mRNA的产生和用特异性抗体进行细胞内免疫染色来确定细胞因子的表达；

(4)在mRNA水平，Trizol裂解细胞抽提RNA，利用ReverTra qPCR RT Master MixgDNA remover逆转录为cDNA，利用Thunderbird SYBR qPCR Mix在Bio-rad CFX96 PCR仪上检测IL-6，IL-8，TNFα和IL-1β的表达；

所用引物序列如SEQ ID NO.1～16所示；

用伊巴斯汀(Eba.+RBD组)或氯雷他定(Lor.+RBD组)抑制Spike-RBD蛋白刺激LAD2脱颗粒，用其上清培养A549细胞，所得结果如图2所示，由图可知，IL-6(I图)，IL-8(II图)，TNFα(III图)，IL-1β(IV图)，CCL20(Ⅴ图)，CCL5(Ⅵ图)的mRNA表达水平均显著上调；

其中，实验组及对照组包括：采用空白培养基(Medium)培养、采用含有sipke-RBD的培养基培养(RBD Medium组)、采用未做任何处理的LAD2上清进行培养(LAD2 medium组)、采用sipke-RBD处理后的LAD2细胞的上清进行培养(即RBD组)、采用伊巴斯汀预处理，再用sipke-RBD处理后的LAD2细胞的上清进行培养(Eba.+RBD组)，采用氯雷他定预处理，再用sipke-RBD处理后的LAD2细胞的上清进行培养(Lor.+RBD组)。

(5)胞内免疫染色实验中，首先向A549细胞中白细胞活化试剂和蛋白转运抑制剂6小时，之后用固定破膜液4℃固定细胞20分钟，荧光抗体4℃避光染色过夜，洗涤后，将细胞重悬于FACS缓冲液中以进行流式细胞术分析。

所得实验结果如图3所示，其中，Isotype组染色的是对照抗体，用于消除由于抗体非特异性结合而产生的背景染色；medium组为对照组，与实验组使用的为相同的目的抗体；相比于RBD组，Eba.+RBD组和Lor.+RBD组中，IL-6，IL-8和IL-1β的蛋白表达水平均显著性下调。

其结果也证明，在细胞水平，伊巴斯汀和氯雷他定能够通过抑制肥大细胞脱颗粒进而抑制炎症因子产生。

实施例3

本实施例利用ACE2人源化小鼠模型验证氯雷他定和伊巴斯汀对SARS-CoV-2引发的炎症因子风暴的抑制作用及对肺损伤的保护作用。

(1)所述ACE2人源化小鼠模型为C57BL/6N-Ace2^{em2(hACE2-WPRE,pgk-puro)/CCLA}小鼠，在小鼠攻毒前一天，腹腔注射依巴斯汀(5mg/kg)或氯雷他定(10mg/kg)，攻毒剂量为5×10⁶TCID50；

(2)在之后的每一天都注射相同剂量的依巴斯汀或氯雷他定至第四天；

(3)感染后第5天，对小鼠麻醉和安乐死后取其肺部分别进行RNA抽提和组织病理学染色(H&E，甲苯胺蓝)；通过qPCR检测IL-6，IL-8，TNFα，IL-1β，INFγ，CRP，CCL20和CCL5的表达，所用引物及探针序列如SEQ ID NO.17～37所示；

通过H&E和甲苯胺蓝染色检测肺部病理损伤以及肥大细胞脱颗粒情况。

如图4的组织病理学结果显示，攻毒后小鼠肺部出现大量肥大细胞的脱颗粒，并出现较严重的肺损伤；其中，肺损伤处见图5中箭头所示的位置，包括：肺泡间隔增厚、出血、粘膜脱落、透明膜形成、炎性细胞浸润和纤维渗出等现象。

图6(A)和图6(B)为Eba.+SARS-CoV-2组的染色结果，图7(A)和图7(B)为Lor.+SARS-CoV-2组的染色结果，对各组H&E染色中肺组织损伤程度进行打分并甲苯胺蓝染色中肥大细胞数量进行统计；

打分及统计结果如图8(A)和图8(B)所示，可见Lor.+SARS-CoV-2和Eba.+SARS-CoV-2组的小鼠肺组织损伤程度与肥大细胞脱颗粒均显著低于SARS-CoV-2攻毒组。

此外，(RT-)RNA定量检测结果如图9所示，SARS-CoV-2感染后，IL-6(I图)，IL-8(II图)，TNFα(III图)，IL-1β(IV图)，CRP(V图)，INFγ(VI图)，CCL20(VII图)和CCL5(VIII图)的mRNA表达水平均显著性上调，表明小鼠攻毒后肺部发生严重的炎症因子风暴；依巴斯汀或氯雷他定使用后，均可抑制SARS-CoV-2诱导的IL-6，IL-8，TNFα，IL-1β，INFγ，CRP(C反应蛋白)，CCL20和CCL5的表达。

因此，本发明实施例的结果表明，在C57BL/6N-Ace2^{em2(hACE2-WPRE,pgk-puro)/CCLA}小鼠模型中，伊巴斯汀和氯雷他定均能通过抑制肥大细胞脱颗粒，进而抑制SARS-CoV-2诱发的炎症因子产生及阻止SARS-CoV-2诱导的肺损伤。

综上所示，本发明在体内、体外证实氯雷他定和伊巴斯汀可抑制SARS-CoV-2引发的炎症因子产生，并保护肺部、阻止损伤；这一结果提示氯雷他定和伊巴斯汀可以作为免疫调节剂，降低COVID-19炎症因子反应，并有望联合抗病毒药物治疗重症感染，在治疗COVID-19中具有重要的临床应用价值。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院

<120> 氯雷他定或依巴斯汀在制备预防和/或治疗COVID-19炎症的药物中的应用

<130> 20210624

<160> 37

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

cagacagcca ctcacctctt cag 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

cagccatctt tggaaggttc ag 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 3

cccaggcagt cagatcatct tc 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 4

gtgaggagca catgggtgga g 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 5

ccttctacgg ccactactgt gc 22

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 6

gccagtactt cccatccttg aac 23

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 7

atcccatcac catcttccag g 21

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 8

ccttctccat ggtggtgaag ac 22

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 9

cgtcagttgt tgtggccatg ga 22

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 10

gagcgtgcag ttcagtgatc gta 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 11

ctgatttctg cagctctgtg tga 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 12

ggtccagaca gagctctctt cca 23

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成()

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gctgctttga tgtcagtgct 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成()

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tgtcacagcc ttcattggc 19

<210> 15

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<212> DNA

<213> 人工合成()

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accacaccct gctgctttg 19

<210> 16

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<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 16

gcggttcttt cgggtgaca 19

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成()

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cttccatcca gttgccttct tg 22

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成()

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aattaagcct ccgacttgtg aag 23

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成()

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cagaccctca cactcagatc atct 24

<210> 20

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<212> DNA

<213> 人工合成()

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cctccacttg gtggtttgct a 21

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ctttcagagg ccagagagtc c 21

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<212> DNA

<213> 人工合成()

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tccctgtagt gacagcacct 20

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<212> DNA

<213> 人工合成()

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cggcaatgaa gcttctgtat 20

<210> 24

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<212> DNA

<213> 人工合成()

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ccttgaaact ctttgcctca 20

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<212> DNA

<213> 人工合成()

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atgaacgcta cacactgcat c 21

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<212> DNA

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ccatcctttt gccagttcct c 21

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<212> DNA

<213> 人工合成()

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tgcaccacca actgcttag 19

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<212> DNA

<213> 人工合成()

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gatgcaggga tgatgttc 18

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cagagattcc tgaggctcca aca 23

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agtcaccgcc atacgagtcc tg 22

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aagacagatg gccgatgaag 20

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<213> 人工合成()

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aggttcacag cccttttcac 20

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gtgcccacgt caaggagtat 20

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gggaagctat acagggtca 19

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<212> DNA

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ggggaacttc tcctgctaga at 22

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cagacatttt gctctcaagc tg 22

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<213> 人工合成()

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ttgctgctgc ttgacagatt 20