包含活性多肽的化妆品或药品及其制备方法
阅读说明：本技术 包含活性多肽的化妆品或药品及其制备方法 (Cosmetic or pharmaceutical product comprising active polypeptide and process for preparing same ) 是由 王京 李宇 于 2021-07-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及包含活性多肽的化妆品或药品及其制备方法。本发明通过从鱼皮中通过羟自由基清除能力以及对黑色素细胞增殖抑制能力二项指标,筛选并鉴定获得了活性肽,所述活性肽能够较好的美白特性以及抗衰老功能,制备成为美白抗衰老化妆品或者药物后具有较好的应用前景和应用价值。(The present invention relates to cosmetics or pharmaceuticals comprising active polypeptides and methods of making the same. The active peptide is obtained by screening and identifying through two indexes of hydroxyl free radical scavenging capacity and melanocyte proliferation inhibition capacity in fish skin, has good whitening property and anti-aging function, and has good application prospect and application value after being prepared into whitening anti-aging cosmetics or medicaments.)
技术领域
本发明涉及药物和化妆品领域，更具体的涉及包含活性多肽的化妆品或药品及其制备方法。
背景技术
衰老是指机体所有器官机能减退和储备能力的下降，是生物界最基本的自然规律之一。皮肤衰老作为机体整体衰老的一个部分具有特殊的意义。皮肤衰老主要分为内源性衰老和外源性衰老两种形式。内源性由于机体内不可抗拒因素(如重力、机体内分泌及免疫功能随机体衰老而改变)及遗传等因素所引起。外源性衰老主要是由太阳的紫外线辐射引起所以又称为光老化。
氧化应激在时程老化、光老化过程中均有一定作用，这与ROS的产生有关。年龄增大抗氧化防御机制降低会导致ROS累积增加。时程老化过程中体内聚集了多余ROS以及受损的细胞。后者包括了DNA氧化、蛋白氧化以及脂质氧化。而光老化过程中UVA被皮肤色基(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、卟啉、尿刊酸)吸收后，通过能量传递产生ROS，使得细胞内蛋白、DNA、脂质氧化，这一ROS介导的光化学反应是光老化的重要机制之一。总之，多种原因包括年龄增长、紫外线、热能等因素均可造成氧化应激，ROS能使MMPs增加，降解有胶原，抑制新胶原的合成，促进皮肤衰老。
生物活性肽一般指除具有营养功能外，另具有一定生理功能的肽的总称。食源性生物活性肽是指动植物蛋白质经蛋白酶酶解、或微生物发酵等方法制得，且具有多种生理活性的肽类物质，如酪蛋白磷酸肽、大豆抗氧化肽、乳肽、鱼肽等，其在美容、调节胃肠道运动、免疫调节、抗高血压、抗菌、抗血栓、抗氧化、促进矿物元素吸收等方面发挥着重要作用。
活性肽的生理活性涉及人体的消化、吸收、营养代谢调控、生长发育、免疫、神经调节等各个环节。在Biopep肽库中，列出了2600多种具有各种不同生物活性的肽段，包括具有阿片样活性、促进矿物结合、降血压、镇静安眠、抗血栓形成、降胆固醇、降甘油三酯、抗氧化、抑菌、抗癌、抗肥胖症、改善免疫调节、改善激素调节、迅速恢复体能、提高人体耐力等各种功效.在吸收上，小肽还具有无抗原性和易于吸收及透过血脑屏障的优点。此外，大多数活性肽还具有良好的加工特性，生物活性肽是极具潜力的一类兼具营养性及功能性的食品基料，它将为有效利用蛋白质和节约蛋白质资源开辟新的途径，也是医药食品领域的一种新原料、新材料。
动物多肽是治疗皮肤衰老的一个研究方向。绝大多数动物的生物活性肽都是在动物和它们的器官中提取分离的。主要包含：鹿茸多肽，林蛙皮多肽，乌骨鸡活性多肽，羊胎盘多肽，猪皮胶原多肽。经大量的实验研究证明鹿茸多肽确实具有很好的抗氧化及抗炎活性，对于化妆品的开发具有很好的前景。鹿茸多肽不仅对免疫系统、循环系统、神经系统、骨代谢以及糖代谢等起着重要作用，在炎症、抑制病毒、抗氧化等方面也有着突出的效果。鹿茸多肽还有对于组织伤口愈合、抗衰老方面的药理作用。李慧萍等利用碱性蛋白酶从林蛙皮中获得胶原多肽，通过实验证实其清除O2-和DPPH自由基能力很强，拥有极好的抗氧化能力。而聂林燕等发现了林蛙皮的小分子肽有很好的抑菌效果，并研制了两款护肤品，效果明显可用于护肤品的开发或保健食品的研制。沈鹏等用林蛙皮肤多肽凝胶来修复兔的皮肤损伤。结果表明，林蛙皮多肽凝胶可减轻家兔皮肤炎症反应，促进创面愈合，提高肉芽组织中新生血管密度和成纤维细胞数量。林蛙皮多肽还能够显著降低HaCaT死亡，抑制炎性细胞增殖，提高新生毛细血管和成纤维细胞数目，利于创面的增生修复。高闪闪等对羊胎盘多肽进行了体内动物实验，证明其很好的抗氧化活性。姜惠敏等将制备的羊胎盘多肽进行人体实验，评价其在抗衰老化妆品中的抗衰老性能，结果表明，它对改变角质层含水量、皮肤水分损失和弹性方面均有较好的效果。叶兴洁等对猪皮、鸡皮和鱼皮胶原蛋白多肽进行了小鼠衰老模型实验，分析血液生化指标、皮肤生化指标和皮肤特征RNA，结果表明，不同来源的胶原肽能延缓D-半乳糖致衰老小鼠的衰老，提高其抗氧化能力。
目前，对于新开发的活性肽仍有较大的需求，特别是能够有效的用于治疗皮肤美白或者抗皱抑制黑色素细胞增殖的化妆品或者药物的开发。
发明内容
本发明申请人前期已经研发并获得了一种透皮肽，所述透皮肽是非细胞穿透肽，能打开皮肤细胞旁路屏障，从而存进药物快速透皮并且对皮肤无损伤，所述透皮肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体序列为DNVFIGKNSSSYG。
另外一方面，B-16黑素瘤细胞株的基本结构，特别是黑色素合成功能与人正常的皮肤黑色素细胞基本一致，在筛选美白剂的过程中，广泛采用该细胞株作为美白化学物功效测定的受试细胞。为此我们采用B-16黑素瘤细胞株，对皮肤美白剂的功效进行检测。
进一步的，本发明从鱼皮中分离制备得到了活性肽，所述活性肽的序列为CLM-1：Ac-PYEMTCVMMWRYYFMWD(如SEQ ID NO：2所示)，该活性肽由17个氨基酸组成，平均分子量为2352.79KD，具有N末端乙酰化修饰。该多肽分子量不大，具有潜在的渗透性和生物学活性。
另外一方面，本发明还提供一种具有透膜效果的偶联活性肽，所述偶联肽的序列为Ac-PYEMTCVMMWRYYFMWDDNVFIGKNSSSYG(如SEQ ID NO：3所示)。
进一步的，本发明还提供一种偶联活性肽纳米柔性脂质体，具体的，所述脂质体的制备方法为：
向50mL的圆底烧瓶中加入162.5mg的卵磷脂、25mg的胆酸钠和7mL甲醇与三氯甲烷的混合液(V(甲醇)∶V(三氯甲烷)＝1:1)；将溶液置于超声仪中超声10min使溶质分散(功率为50W)；将装有超声分散后溶液的烧瓶置于旋转蒸发仪中，在37℃和真空条件下得到磷脂膜；向含磷脂膜的烧瓶中加入15mL配制的偶联物多肽溶液，并将烧瓶置于摇床中，30℃下震荡3h得到水合磷脂膜；随后，从烧瓶中取出4mL的混合溶液置于6mL的离心管中，用细胞粉碎超声仪在200W功率下超声7s、停3s、处理45个循环，从而形成偶联活性肽纳米柔性脂质体悬浮液。
更进一步的，本发明提供一种药物组合物，所述药物由SEQ ID NO：3所示的偶联活性肽或者SEQ ID NO：2所示的活性肽组成，所述药物能够促进成纤维细胞增殖以及抑制黑色素细胞增殖。
更进一步的，本发明提供一种化妆品，所述化妆品由SEQ ID NO：3所示的偶联活性肽或者SEQ ID NO：2所示的活性肽组成，所述药物能够促进成纤维细胞增殖以及抑制黑色素细胞增殖。
SEQ ID NO：3所示的偶联活性肽或者SEQ ID NO：2所示的活性肽在制备促进成纤维细胞增殖以及抑制黑色素细胞增殖的药物中的用途。
SEQ ID NO：3所示的偶联活性肽或者SEQ ID NO：2所示的活性肽在制备抗衰老和美白的化妆品中的用途。
更进一步的，所述药物还含有药学上可接受的载体。
更进一步的，所述化妆品还含有药学上可接受的载体。
另外，本发明的偶联活性肽通过小鼠实验也证实具有较好的安全性。通过前期的溶血实验也证明具有较好的安全性。
有益效果
本发明通过从鱼皮中通过羟自由基清除能力以及对黑色素细胞增殖抑制能力二项指标，筛选并鉴定获得了活性肽，所述活性肽能够较好的美白特性以及抗衰老功能，制备成为美白抗衰老化妆品或者药物后具有较好的应用前景和应用价值。
附图说明
图1透皮效果验证结果图
图2活性肽促进成纤维细胞增殖效果图
图3活性肽抑制B16细胞增殖效果图
图4活性肽对细胞内酪氨酸酶活性的抑制效果图
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：下述实施例中所用材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径获得。
实施例1活性肽的分离及筛选和鉴定
取包头鱼鱼皮10g，然后用10倍体积的0.2％氢氧化钠溶液浸泡并不断搅动，50min后用流动水冲洗至中性；再用7倍体积的0.2％硫酸溶液浸泡并不断搅动，40min后用流动水冲洗至中性；最后将鱼皮加10倍蒸馏水匀浆，用50％热水恒温搅拌提取12h，离心(5000r/min，20min)收集上清液。
将上述上清液先在中蛋白酶的最适条件下pH8.0、水解时间5h、酶与底物比5％和水解温度35℃水解后，再加入碱性蛋白酶水解时间4.5h、pH9.0、酶与底物比5％和水解温度55％进行二次水解后，将制备的水解液进行浓缩、冻冻，于-2O℃冻存备用。
将冻存粉末溶解于蒸馏水后，先用SephadexG-25凝胶柱进行分离，洗脱液为超纯水，流速0.5mL/min，每6min收集一管，在220nm检测吸光值。收集各峰，检测其羟自由基清除能力以及对黑色素细胞增殖抑制能力后，将具有最高清除能力和抑制能力的组分浓缩。然后将该组分用SP SephadexC-25阳离子交换柱进行再次分离纯化，平衡液为0.15mol/L的醋酸缓冲液(pH4.0)，并用含有终浓度为0～1.0moL/L的NaC1的醋酸缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为0.7mL/min，每5min收集一管，在220nm检测吸光值，收集各峰并检测活性；最后将活性最高组分用SephadexG-15凝胶柱脱盐并纯化，洗脱液为超纯水，流速0.5mL/min，收集各峰，并测定活性，活性最高组分冻干备用。
将Sephadex G-15凝胶柱脱盐纯化得到的最高活性组分进一步用反相高效液相色谱Zorbax SB—C18半制备柱纯化.用5％～30％的乙腈(含0.1％三氟乙酸)线性梯度洗脱40min，流速为2.0mL/min，柱温35℃，检测波长为220nm.收集主要峰，反复冻干除去三氟乙酸和乙腈，并进行活性检验，然后将最高活性组分再用SB—C18半制备柱以5％～20％的乙腈(含0.1％三氟乙酸)多次线性梯度洗脱，流速为2.5mL/min，柱温30℃，纯化主峰，并检验活性.最后用反相高效液相色谱Zorbax SB—C18分析柱检验和纯化，以含0.1％三氟乙酸的乙腈(5％～25％)线性梯度洗脱20min，流速为1.0mL/min，柱温30℃，检测波长为220nm.多次重复并收集主要峰，反复冻干除去三氟乙酸和乙腈。利用电喷雾四极杆正交加速一飞行时间串联质谱仪Q—TOF测定抗氧化肽的分子量和氨基酸序列。
结果获得了一个主要的活性肽序列CLM-1：Ac-PYEMTCVMMWRYYFMWD，该活性肽由11个氨基酸组成，平均分子量为2352.79KD，具有N末端乙酰化修饰。该多肽分子量不大，具有潜在的渗透性和生物学活性。
实施例2活性肽修饰
将活性肽Ac-PYEMTCVMMWRYYFMWD与透皮肽DNVFIGKNSSSYG在C端偶联，采用化学合成的方式获得了偶联物Ac-PYEMTCVMMWRYYFMWDDNVFIGKNSSSYG。称取200mg多肽溶解于50ml缓冲液(0.1M PB，0.15M NaCl)中，配成4mg/ml的偶联物多肽溶液。
向50mL的圆底烧瓶中加入162.5mg的卵磷脂、25mg的胆酸钠和7mL甲醇与三氯甲烷的混合液(V(甲醇)∶V(三氯甲烷)＝1:1)；将溶液置于超声仪中超声10min使溶质分散(功率为50W)；将装有超声分散后溶液的烧瓶置于旋转蒸发仪中，在37℃和真空条件下得到磷脂膜；向含磷脂膜的烧瓶中加入15mL配制的偶联物多肽溶液，并将烧瓶置于摇床中，30℃下震荡3h得到水合磷脂膜；随后，从烧瓶中取出4mL的混合溶液置于6mL的离心管中，用细胞粉碎超声仪在200W功率下超声7s、停3s、处理45个循环，从而形成偶联活性肽纳米柔性脂质体悬浮液。
使用激光粒度仪测量了制备的活性肽纳米脂质体的粒径：活性肽纳米脂质体平均粒径为(98.92±1.03)nm，基于葡聚糖凝胶法测得的偶联活性肽纳米柔性脂质体的包封率为(71.2±3.4)％，具有较好的包封效果。
实施例3透皮效果验证
用1mL 20％的乌来糖将SD雄性大鼠麻醉并将其断颈处死，用剪刀剪去其腹部的毛发(3cm×3cm，长×宽)并涂上脱毛膏，7min后，去掉脱毛膏，用37℃的生理盐水清洗脱毛的皮肤4次。用刀片和镊子取下老鼠皮肤并用生理盐水清洗4次，剥离皮肤上的脂肪组织，将处理好的皮肤置于生理盐水中放于4℃冰箱以备后用。处理好的皮肤固定于Franz池的中间，将5mL的生理盐水和磁力转子加入到Franz池的接收槽(下槽)，超声5min除去下槽生理盐水中的空气后将其置于透皮吸收仪中。打开透皮吸收仪的水循环系统，温度调至37℃，转速调至200r/min。分别将0.5mL 0.1g/L的活性肽溶液、0.5mL 0.1g/L的偶联活性肽纳米柔性脂质体溶液溶液加入到Franz池的给药槽(上槽)，用封口膜封住给药槽，记录实验开始时间。分别在4、12h时取样，从接收槽中取出150μL的样品，放置于EP管中，向接收槽中加入150μL的生理盐水。分别将70μL上述样品加入到96孔板中，用酶标仪测量吸光值检测多肽的透过情况。每组实验至少重复3次。结果如图1所示。
结果表明(如图1所示)，在透皮肽的作用下，活性肽的透皮量显著增加，这是因为透皮肽能打开皮肤屏障，从而提高多肽的透过率。纳米柔性脂质体也能促进达多肽的透皮，这是因为脂质体和皮肤表层的细胞结构相似，能与磷脂膜形成疏水结构，扰乱皮肤的结构，从而促进药物透过皮肤。因此，在透皮肽和脂质体的双重作用下，活性肽的透皮量进一步增加(如图1所示)。
实施例4活性肽促进成纤维细胞增殖
将皮肤成纤维细胞混悬液加人到96孔板中，每孔100μL；将96孔板放人细胞培养箱培养，当细胞贴壁且占90％或布满孔底时，换一次液并按实验设计梯度分别加入活性肽，使活性肽终浓度为0、10、20、50μg/L，每个浓度至少设置3个复孔。药物作用时间48h后取出，将孔内的液体全部甩出，再向每孔加人100μL的DMS0,振荡器上震荡5min，使用紫外分光光度仪在490nm波长处测定吸光度(0D)值，依照公式计算细胞生长率，细胞生长率＝(0D药物/0D对照)X100％。
从图2的结果可以看出，不同浓度的活性肽作用于皮肤成纤维细胞后48h，各浓度多肽作用的皮肤成纤维细胞生长率均逐渐升高，且相比于其他浓度，50μg/L的多肽对皮肤成纤维细胞的生长促进情况作用更为明显。
实施例5活性肽美白性能检测
(1)活性肽抑制B16细胞增殖实验
将小鼠黑色素瘤B16细胞接种于含有体积分数为10％的FBS、100U/mL青霉素和0.1g/L硫酸链霉素的RPMI-1640培养基中，于37℃、饱和湿度、CO2＝5％的细胞培养箱中培养。取对数生长期的小鼠黑色素瘤B16细胞并用2.5g/L胰蛋白酶消化，再以细胞培养液制备成4×104个/mL单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔加入100μl单细胞悬液，接种24h后再向每孔加入100μl含活性肽的培养液或相应对照液。实验设空白对照组和7个实验组，各组设3个平行复孔，实验组活性肽终质量浓度分别为0，10，20，50μg/L，将各组样品置于37℃、饱和湿度、CO2＝5％的细胞培养箱培养48h作用时间。
将作用时间已到的小鼠黑色素瘤B16细胞弃上清液后每孔中加入终质量浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于培养箱继续作用4h，轻轻吸去孔中上清液，再加入80μl DMSO，振荡10min，在酶标仪490nm处测定吸光度(A490)。细胞增殖抑制率计算公式为：细胞增殖抑制率＝(1-实验组A490/空白对照组A490)×100％。
结果如图3所示。随着浓度的增加，其抑制作用增加；在活性肽的质量浓度达到50μg/L时，与空白对照组对比其抑制作用较明显，抑制率达到(12.9±1.8)％。
(2)活性肽对细胞内酪氨酸酶活性的影响
采用多巴氧化法对酪氨酸酶活性进行测定。将作用时间已到的细胞弃上清液，加入PBS荡洗2次，每孔加5g/L脱氧胆酸钠溶液100μl，振荡10min，在0℃下保持30min，后升温至37℃，加入1g/L L-DOPA(左旋多巴)溶液10μl，孵育30min后在475nm波长处测吸光度(A475)。酪氨酸酶活性抑制率计算公式为：酪氨酸酶活性抑制率＝(1-实验组A490/空白对照组A490)×100％。
从图4的结果可以看出，活性肽具有较好的酪氨酸酶抑制效果，在浓度达到50μg/L时，抑制率达到(93.4±2.8)％。
实施例6小鼠模型检测
SPF级雄性BALB/c小鼠适应性饲养3d后，进行编号称重，并按体重随机分为六组，分别为正常组、模型组、活性肽组(100mg/kg)、偶联活性肽纳米柔性脂质体组(100mg/kg)、VE对照组(100mg/kg)，每组10只小鼠。除正常组小鼠给予等量生理盐水外，其余组的小鼠均在颈背部皮下注射D-半乳糖(1000mg/kg·d)溶液进行造模，连续8周。在造模的第4周开始，除正常组及模型组给予等量蒸馏水外，其余组的小鼠给予灌胃相应剂量的肽或维生素E。实验结束后，眼眶取血，分离血清用于检测血清GSH-Px活力、CAT检测。同时，采用本领域常规的皮肤羟脯氨酸含量检测方法，来检测实验各组小鼠背部皮肤中的羟脯氨酸含量，结果表1所示。
表1各组血清GSH-Px活力、CAT以及皮肤羟脯氨酸含量结果
由表1可知，模型组小鼠的GSH—Px、CAT、和羟脯氨酸含量较正常组小鼠而言，呈现显著降低态势。而VE对照组和活性肽组以及偶联活性肽纳米柔性脂质体组均表现出较好的抗衰老和提高皮肤羟脯氨酸含量的效果，特别是偶联活性肽纳米柔性脂质体相对于活性肽而言，能够具有更好的吸收和利用以及功效，具有更好的效果。此外，通过分析活性肽组和偶联活性肽纳米柔性脂质体组的小鼠脏器指标以及体重可以发现，所述多肽具有较好的安全性，没有致病或者致畸现象。
应当理解，以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京戴域生物技术有限公司
<120> 包含活性多肽的化妆品或药品及其制备方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Asn Val Phe Ile Gly Lys Asn Ser Ser Ser Tyr Gly
1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Pro Tyr Glu Met Thr Cys Val Met Met Trp Arg Tyr Tyr Phe Met Trp
1 5 10 15
Asp
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Pro Tyr Glu Met Thr Cys Val Met Met Trp Arg Tyr Tyr Phe Met Trp
1 5 10 15
Asp Asp Asn Val Phe Ile Gly Lys Asn Ser Ser Ser Tyr Gly
20 25 30
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种环孢素聚合物胶束制剂及其制备方法