LncRNA-063及其用途
阅读说明：本技术 LncRNA-063及其用途 (LncRNA-063 and use thereof ) 是由 孙诚 于 2021-08-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种LncRNA-063在制备促进机体能量代谢、抵抗肥胖制剂中的应用。本发明效果确切,LncRNA-063通过促进米色脂肪细胞向棕色脂肪细胞分化有效促进机体能量代谢、抵抗肥胖；而且具有降低血糖、提高胰岛素敏感性的作用。(The invention discloses an application of LncRNA-063 in preparing a preparation for promoting body energy metabolism and resisting obesity. The invention has exact effect, and the LncRNA-063 effectively promotes the energy metabolism of the organism and resists obesity by promoting the differentiation of beige fat cells to brown fat cells; and has effects of reducing blood glucose and improving insulin sensitivity.)
技术领域
本发明涉及一种LncRNA-063及其用途。
背景技术
肥胖是机体能量代谢失调的一种生理状态，表现为多余能量以脂肪的形式在体内大量积累。肥胖严重威胁着人类健康，它会诱发多种代谢性疾病，如脂肪肝、2型糖尿病、心血管疾病、特定类型的癌症等。机体的脂肪组织主要分为两类，即白色脂肪组织和棕色脂肪组织。在能量代谢方面，白色脂肪细胞内含有大量甘油三酯，因此白色脂肪组织主要作为储存机体能量的器官；与此相反，棕色脂肪细胞内含有大量线粒体，并高表达解偶联蛋白UCP1，可通过解偶联作用将储存的能量转化成热能散发出去，因此BAT被认为是消耗能量的器官。因此可以合理推测，若通过某种方法使白色脂肪向棕色脂肪转化，消耗机体多余能量，无疑将可延缓体重增加，减轻肥胖症的发展，并对肥胖相关疾病(如2型糖尿病)具有治疗作用。
长链非编码RNA(long noncoding RNAs,LncRNAs)是指一类长度大于200bp，没有编码蛋白功能的RNA分子。早期认为这些LncRNAs只是基因转录的副产物，没有特定的生理功能。但是，最近研究发现，很多LncRNAs具有非常重要的生理功能，其水平异常可导致发育缺陷及多种疾病的发生与发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种效果确切的LncRNA-063及其用途。
本发明的技术解决方案是：
一种LncRNA-063在制备促进机体能量代谢、抵抗肥胖制剂中的应用。
所述促进机体能量代谢、抵抗肥胖制剂为促进米色脂肪细胞向棕色脂肪细胞分化的制剂。
所述促进机体能量代谢、抵抗肥胖制剂是降低血糖、提高胰岛素敏感性的制剂。
本发明效果确切，LncRNA-063通过促进米色脂肪细胞向棕色脂肪细胞分化有效促进机体能量代谢、抵抗肥胖；而且具有降低血糖、提高胰岛素敏感性的作用。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是LncRNA-063序列示意图。
图2是LncRNA-063诱导前体脂肪细胞向棕色脂肪分化示意图。
其中：(A)脂肪细胞油红染色；(B)定量PCR检测UCP1基因表达水平。***p<0.001，Student's t test分析。
图3是LncRNA-063处理促进小鼠腹股沟米色脂肪组织向棕色脂肪组织转变示意图。
(A)脂肪形态图；(B)定量PCR检测UCP1基因表达水平。***p<0.001，Student's ttest分析。
图4是LncRNA-063对2型糖尿病小鼠血糖水平的影响示意图。**p<0.01，Student'st test分析。
图5是LncRNA-063对2型糖尿病小鼠血清胰岛素水平的影响示意图。*p<0.05，Student's t test分析。
图6是LncRNA-063对2型糖尿病小鼠葡萄糖耐受能力的影响示意图。**p<0.01，***p<0.001，Student's t test分析。
图7是LncRNA-063对2型糖尿病小鼠胰岛素耐受能力的影响示意图。*p<0.05，***p<0.001，Student's t test分析。
具体实施方式
一种LncRNA-063在制备促进机体能量代谢、抵抗肥胖制剂中的应用。
所述促进机体能量代谢、抵抗肥胖制剂为促进米色脂肪细胞向棕色脂肪细胞分化的制剂。
所述促进机体能量代谢、抵抗肥胖制剂是降低血糖、提高胰岛素敏感性的制剂。
LncRNA-063序列如图1所示((http://feb2014.archive.ensembl.org/Mus_ musculus/Transcript/Exons？db＝core；g＝ENSMUSG00000075391；r＝2:35340361- 35341316；t＝ENSMUST00000179063))。为研究LncRNA-063对米色脂肪棕色化的诱导作用，我们构建了表达LncRNA-063的腺病毒(Ad-LncRNA-063)，用所构建好的表达LncRNA的腺病毒转导前体脂肪细胞，然后进行棕色脂肪细胞定向诱导，油红染色及qRT-PCR结果表明LncRNA-063可显著诱导前体脂肪细胞向棕色脂肪细胞分化(图2A)，并且棕色脂肪细胞特异性基因UCP1也呈高表达趋势(图2B)。在活体动物水平上，我们将表达LncRNA-063的腺病毒(Ad-LncRNA-063)直接注射于肥胖小鼠(2型糖尿病模型小鼠)腹股沟米色脂肪组织。病毒注射3周后，发现腹股沟米色脂肪组织向棕色脂肪组织转变(图3A)，UCP1的表达也显著升高(图3B)。另外，LncRNA-063可以显著降低2型糖尿病模型小鼠血糖(图4)及血清胰岛素水平(图5)。LncRNA-063还可以显著提高肥胖小鼠的葡萄糖耐受(图6)和胰岛素耐受能力(图7)，说明LncRNA-063可提高2型糖尿病模型小鼠体内葡萄糖清除能力，并能提高其胰岛素敏感性。
实验步骤
1、LncRNA-063过表达病毒构建
过表达病毒制备：本研究中基因敲除是采用Invitrogen公司的Gateway系列试剂盒，首先用PCR扩增出LncRNA的完整序列，然后连入中间载体pENTR3C-Entry Vector后送往公司测序，测序正确的载体通过重组的方法(LR)连入到目标载体(pAd-CMV-DEST Vector)中，测序检测正确后，将阳性质粒中抽，并经核酸内切酶PacI单切后用Invitrogen公司的Lipofectamine2000脂质体转染293A细胞。一周左右观察病毒斑形成情况，待绝大部分病毒斑出现后收集293A细胞并进行-80℃和37℃的反复冻融使细胞破碎，离心收集上清即获得第一代病毒，将第一代病毒继续感染293A细胞后同样方法获得第二代病毒，第二代病毒进行病毒滴度检测后可保存于-80℃低温冰箱用于后续实验。
2、前体脂肪细胞培养、诱导分化及LncRNA-063处理
原代前体脂肪细胞培养：8周龄雄性C57BL/6J小鼠，取腹股沟白色脂肪组织于离心管中，胶原酶消化液(胶原酶1mg/ml溶于分离缓冲液-----包括0.123M NaCl,5mMKCl,1.3mMCaCl2,5nM葡萄糖,100mMHepes,4％BSA)37℃水浴锅消化30min，间隔5min振荡一次，100μm尼龙筛网过滤，离心，200g x 5min。去上清液，加入2ml分离缓冲液充分悬浮细胞，离心，200g x 5min。去上清液，加入2ml培养液(DMEM高糖培养基，20％胎牛血清，20mMHepes,100U/ml青霉素/链霉素)充分悬浮细胞，种于培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
棕色脂肪细胞定向诱导分化：诱导培养基组成包括DMEM高糖培养基，10％胎牛血清，20mM胰岛素，1nM T3，0.5mM IBMX，125μM吲哚美辛，1μM地塞米松。诱导2天后加入罗格列酮。2天后换用基础诱导培养基(DMEM高糖培养基，10％胎牛血清，20mM胰岛素，1nM T3)诱导3-4天，其间隔天换新鲜培养基。
为检测LncRNA-063对脂肪前体细胞向棕色脂肪细胞的转化，在加诱导培养基之前，前体脂肪细胞分别用过表达(Ad-LncRNA-063)处理，24小时后吸取培养基，换棕色脂肪细胞诱导培养基。
3、油红染色
细胞处理结束后，去除上清培养基，加PBS清洗一次，移除PBS，加4％多聚甲醛固定，室温20-30min。随后，用PBS清洗1-2次，彻底移除PBS，加入油红工作液，将细胞置于低速摇床上孵育50-60min(室温)，移除油红工作液，加下PBS清洗3次，倒置显微镜拍照。
4、定量PCR检测基因表达水平
使用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取细胞总RNA，再经cDNA合成试剂盒(Bio-Rad公司产品)转录成cDNA。以此cDNA为模板，用SYBR Green Supermix(Bio-Rad公司产品)分析基因表达水平。检测仪器为iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad公司产品)。结果2-ΔCt方法计算mRNA水平。以18S持家基因来校准mRNA的水平。所使用的引物序列如下：
18S rRNA正向引物:5’-AGTCCCTGCCCTTTGTACACA-3’；
18S rRNA负向引物:5’-CGTTCCGAGGGCCTCACT-3’；
UCP1正向引物:5'-AGGCTTCCAGTACCATTAGGT-3'；
UCP1负向引物:5'-CTGAGTGAGGCAAAGCTGATTT-3'.
5、血糖水平检测
小鼠禁食12小时后，采用尾静脉取血，血糖水平用血糖仪(Bayer,Mishawaka,IN)进行定量。
6、血清胰岛素水平检测
小鼠血清胰岛素水平用试剂盒(Rat/mouse insulin ELISA kit,Mercodia,2758702)进行测定。
7、葡萄糖耐受能力检测
小鼠过夜禁食，给小鼠腹腔注射D-葡萄糖(0.5g/kg)。分别在注射葡萄糖后的0，15，30，60，90min取尾静脉血用血糖仪(Bayer)测定各时间点的血糖。
8、胰岛素耐受能力检测
小鼠禁食6小时(从8am到2pm)，给小鼠腹腔注射重组人胰岛素(0.75IU/kg)(购于Eli Lilly，Indianapolis，IN)。分别在注射葡萄糖后的0，15，30，60，90min取尾静脉血用血糖仪(Bayer)测定各时间点的血糖。