G6pc及其所在基因组在制备肾透明细胞癌诊断或预后评估系统中的应用
阅读说明：本技术 G6pc及其所在基因组在制备肾透明细胞癌诊断或预后评估系统中的应用 (Application of G6PC and genome thereof in preparation of renal clear cell carcinoma diagnosis or prognosis evaluation system ) 是由 徐文浩 张海梁 叶定伟 田熙 瞿元元 艾合太木江·安外尔 刘王睿 宿佳琦 于 2021-06-25 设计创作，主要内容包括：本发明涉及医学生物检测技术领域,提供了G6PC及其所在基因组在制备肾透明细胞癌诊断或预后评估系统中的应用,该联合基因组为ADCY10、AMY2A、CA8、CEL、CYP26A1、CYP3A4、G6PC、HAO1、HK3、HMGCS2、ITPKA、NOS1、P4HA3、PFKFB1、PSAT1、RDH8、RRM2、TYR、UGT1A7以及UROC1的联合；进一步提供了透明细胞肾癌诊断或预后评估试剂盒,还提供了一种肾透明细胞癌预后评估系统。本发明首次鉴定并验证出G6PC将其编码蛋白葡萄糖6磷酸激酶可以作为预测预后和免疫细胞异常浸润的分子标志物,在中位随访时间超过72个月的380例来自复旦肿瘤队列的ccRCC标本和来自ICGC、TCGA、TCPA、CTPAC、RECA-EU的转录组和蛋白组学中进行验证,明确G6PC对于肾透明细胞癌的疾病进展至关重要,为新型靶向药物开发提供新的证据。(The invention relates to the technical field of medical biological detection, and provides application of G6PC and a genome thereof in preparation of a renal clear cell carcinoma diagnosis or prognosis evaluation system, wherein the combined genome is the combination of ADCY10, AMY2A, CA8, CEL, CYP26A1, CYP3A4, G6PC, HAO1, HK3, HMGCS2, ITPKA, NOS1, P4HA3, PFKFB1, PSAT1, RDH8, RRM2, TYR, UGT1A7 and UROC 1; further provides a kit for diagnosing or prognostically evaluating clear cell renal cancer and a system for prognostically evaluating clear cell renal cancer. The invention identifies and verifies that G6PC can be used as a molecular marker for predicting prognosis and abnormal infiltration of immune cells by using glucose 6 phosphate kinase as an encoding protein, and verifies 380 cases of ccRCC specimens from a double-denier tumor cohort and transcriptome and proteomics from ICGC, TCGA, TCPA, CTPAC and RECA-EU with median follow-up time of more than 72 months for the first time, so that the G6PC is clear to be important for disease progression of renal clear cell carcinoma, and provides new evidence for development of novel targeted drugs.)
技术领域
本发明属于医学生物检测
技术领域
，涉及G6PC在肾透明细胞癌诊断、预后评估以及治疗中的应用，还涉及包含G6PC在内的20个基因在代谢预测模型中的应用。背景技术
肾细胞癌是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，约占所有成年男性新发病例的5％，占女性新发病例的3％。据美国统计，2019年全美约有73,820例肾癌新发病例和14,770例死亡病例，我国每年新发肾癌患者约6.68万例，居泌尿系统肾透明细胞癌发病率的第二位。透明细胞肾癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)是最常见的、恶性程度较高的肾癌病理类型，约占全部肾癌患者的70-85％，约25-30％的ccRCC患者初诊即出现转移，而转移性ccRCC的5年生存率仅为32％。此外，即使是最初治疗有效的ccRCC患者，经过一段时间后也会出现疾病进展，此时大部分患者将缺乏后续有效治疗。
近年来，以PD-1/PD-L1、CTLA4抑制剂为代表的新型免疫疗法在ccRCC治疗领域迅速兴起，并在晚期难治性疾病患者中显示出令人鼓舞的效果。2020年，ASCO GU公布了CheckMate 025研究的5年随访结果，显示单克隆抗体二线治疗的5年生存率高达26％，充分体现了免疫治疗的生存获益和优势，ccRCC高危患者治疗策略开始出现新篇章。
免疫检查点抑制剂联合TKI从诱导抗肿瘤免疫正常化、抑制晚期ccRCC发展和调节肿瘤微环境(TME)等方面发挥多种作用，它的成功很大程度上取决于对肿瘤细胞和TME相互作用的深入了解。随着研究的深入，更多的证据表明，免疫治疗的疗效不仅取决于肿瘤免疫微环境的激活，靶向治疗等传统治疗的疗效还取决于个体抗肿瘤免疫反应的强弱。因此，探索TME驱动的肿瘤发生发展的潜在机制，提高各种现有治疗的效率，发现ccRCC治疗的新精准靶点具有重要意义。
在TME中，肿瘤细胞和免疫细胞重新编程其代谢模式以适应缺氧、酸性和低营养的微环境。例如，肿瘤细胞表现出增强的有氧糖酵解(Warburg效应)但降低了氧化磷酸化，这对T细胞介导的抗肿瘤免疫反应和肿瘤浸润骨髓细胞活性有很大影响；巨噬细胞趋向于M2型极化，显示出上调的脂肪酸合成和β-氧化。肿瘤细胞促癌信号的激活不仅影响其自身的恶性生物学行为，而且促进了肿瘤的发生发展，还可以通过改变肿瘤细胞的代谢分泌谱和TME来偏转肿瘤浸润免疫细胞的功能表型，诱导肿瘤免疫逃逸的形成。因此，肿瘤细胞和免疫细胞的代谢重编程对于理解肿瘤细胞的邪恶行为、肿瘤免疫反应和肿瘤免疫逃逸的博弈过程至关重要，为调控肿瘤免疫提供了新的方向。
基于回顾性数据构建临床预测模型的方法有助于研究实现多预后因素对临床结局的预测，更可能改变我们的临床实践，具有很强的临床指导价值。2018年，RCClnc4已被证明在早期ccRCC中具有精确的预后意义。本研究旨在首先建立和验证一个有效的预后代谢预测模型，该模型为ccRCC患者注册了大规模转录组代谢基因。我们假设代谢预测模型(MPMs)分类器可以促进ccRCC患者的风险管理和治疗策略，并在MPMs协同网络中识别新的目标。
发明内容
本发明是为解决上述技术问题而进行的，提供了G6PC在肾透明细胞癌诊断、预后评估以及治疗中的应用，还涉及包含G6PC在内的20个基因在代谢预测模型中的应用，用于进行免疫治疗。
发明人试图建立代谢特征以改善术后风险分层并确定ccRCC患者预测模型中的新目标，共鉴定出58个代谢差异表达基因(MDEG)，具有显著的预后价值。而后采用LASSO回归分析，在来自TCGA以及CTPAC两个队列的ccRCC患者中构建了20-mRNA特征模型、代谢预测模型(MPM)。MPM的风险评分显著预测TCGA(p<0.001，HR＝3.131，AUC＝0.768)和CTPAC队列(p＝0.046，HR＝2.893，AUC＝0.777)中ccRCC患者的预后。该20-mRNA包括ADCY10、AMY2A、CA8、CEL、CYP26A1、CYP3A4、G6PC、HAO1、HK3、HMGCS2、ITPKA、NOS1、P4HA3、PFKFB1、PSAT1、RDH8、RRM2、TYR、UGT1A7以及UROC1。
进一步分析，G6PC是MPM的PPI网络中的枢纽基因，在来自多个队列的718名ccRCC患者中显示出显著的预后价值；接下来，检测到G6PC的编码蛋白葡萄糖6-磷酸酶(G6Pase)在正常肾组织中的表达高于ccRCC组织。通过实际验证，在FUSCC队列的322名ccRCC患者中，低G6Pase表达与不良预后(p<0.0001，HR＝0.316)和侵袭性进展(p<0.0001，HR＝0.414)显著相关；同时，在具有侵袭性进展状态的ccRCC样本中，G6PC的启动子甲基化水平显著更高。
由此可知，G6PC显著参与ccRCC微环境的异常免疫浸润，与检查点免疫特征、树突状细胞、Th1细胞等呈显著负相关。使用大规模ccRCC转录组数据对MPM进行建模，并确定G6PC作为来自多个队列的1,040名ccRCC患者的潜在预后目标。这些发现有助于管理风险评估，并为ccRCC的治疗策略提供宝贵的见解。
本发明所采用的技术方案如下：
本发明的第一方面，提供了检测G6PC表达量的试剂在制备透明细胞肾癌诊断或预后评估试剂或试剂盒中的应用。
优选的，该检测G6PC表达量的试剂为检测G6PC基因mRNA表达水平的试剂、检测G6PC基因编码的G6Pase蛋白葡萄糖6-磷酸酶的表达水平、或检测G6PC基因的启动子甲基化水平的试剂。
进一步优选，检测G6PC基因mRNA表达水平的试剂包括对G6PC具有检测特异性的PCR引物，引物序列如SEQ ID NO:13～14所示。
Kaplan-Meier生存分析表明，低G6PC mRNA表达水平与不良预后显著相关(图5I-J)；在正常组织中发现G6Pase表达显著升高(图6B)，低G6Pase表达与不良预后和侵袭性进展显著相关(图6C-D)；G6PC的启动子甲基化水平在初级ccRCC样品中显著低于正常样品(图7C)，随着个体癌症阶段的升高而显著攀升，并且在阶段4的样本中最高(图7D)。与pN0患者相比，具有淋巴结转移的ccRCC样本中G6PC的启动子甲基化水平显著更高(图8F-G)。
本发明的第二方面，提供了一种透明细胞肾癌诊断或预后评估试剂盒，该试剂盒包含了检测G6PC基因mRNA表达水平的试剂、检测G6PC基因编码的G6Pase蛋白葡萄糖6-磷酸酶的表达水平、或/和检测G6PC基因的启动子甲基化水平的试剂。
本发明的第三方面，提供了促进或提高G6PC表达量的试剂在制备治疗透明细胞肾癌药物中的应用，通过靶向G6PC实现透明细胞肾癌治疗。
优选的，促进或提高G6PC表达量的试剂为提高G6PC基因mRNA表达水平或提高G6PC基因编码的G6Pase蛋白葡萄糖6-磷酸酶的表达水平的试剂。
本发明的第四方面，提供了联合基因组在制备肾透明细胞癌预后评估试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，该联合基因组为ADCY10、AMY2A、CA8、CEL、CYP26A1、CYP3A4、G6PC、HAO1、HK3、HMGCS2、ITPKA、NOS1、P4HA3、PFKFB1、PSAT1、RDH8、RRM2、TYR、UGT1A7以及UROC1的联合。
优选的，预后评估试剂为检测生物样品中所述联合基因组中各基因表达量的试剂；预后评估试剂盒包含了检测生物样品中所述联合基因组中各基因表达量的的试剂。
进一步，所述的检测生物样品中联合基因组各基因表达量的试剂，选自：对各个基因具有检测特异性的PCR引物，该PCR引物的序列如SEQ ID NO.1～40所示，具体参见表1：
表1联合基因组PCR引物汇总
本发明的第五方面，提供了一种肾透明细胞癌预后评估系统，包括上述预后评估试剂盒以及安装在终端载体上的亚群分类模型。
所述免疫亚群分类模型基于各基因表达量，根据如下公式进行样本分值计算，并根据分值确定当前样本的代谢分型，样本分值＝
0.02108354×ADCY10+0.055415221×AMY2A+(-0.039834066)×CA8+0.030574711×CEL+0.073959631×CYP26A1+(-0.099395461)×CYP3A4+(-0.029400148)×G6PC+0.002392772×HAO1+0.08863801×HK3+(-0.00986571)×HMGCS2+0.073210921×ITPKA+(-0.045158291)×NOS1+0.041592301×P4HA3+0.108183411×PFKFB1+0.032215715×PSAT1+0.032054991×RDH8+0.018262536×RRM2+0.028898214×TYR+0.02533731×UGT1A7+0.142174067×UROC1。
本发明的第六方面，提供了一种采用上述预后评估系统进行肾透明细胞癌预后辅助评估的方法，包括以下步骤：
A.提取待检样本总RNA；
B.对步骤A中的总RNA进行逆转录，得到cDNA；
C.采用实时定量PCR技术分别对联合基因组中各基因的表达量进行定量检测，检测过程中所用引物如SEQ ID NO:1～40所示；
D.基于每个基因的表达量，根据上述公式进行预后评估分值计算，根据分值确定当前样本的代谢分型，并基于代谢分型制定治疗策略。
本发明的有益保障及效果如下：
本发明首次基于来自TCGA、CTPAC两个队列的共计超过1000例ccRCC患者的转录组数据，探索代谢相关基因参与ccRCC发生发展的独特模式，发现了影响ccRCC预后的20个关键代谢相关分子标志物。
本发明首次通过多层逻辑算法和拟合回归森林树等严谨算法，成功建立了代谢相关临床预测模型，风险得分的预测效能显著高于传统临床病理学特征(AUC＝0.768TCGA，ACU＝0.777CTPAC)，这在国际上是尚未见到的。
本发明首次鉴定并验证出G6PC将其编码蛋白葡萄糖6磷酸激酶可以作为预测预后和免疫细胞异常浸润的分子标志物，在中位随访时间超过72个月的380例来自复旦肿瘤队列的ccRCC标本和来自ICGC、TCGA、TCPA、CTPAC、RECA-EU的转录组和蛋白组学中进行验证，明确G6PC对于肾透明细胞癌的疾病进展至关重要，为新型靶向药物开发提供新的证据。
技术实现方面，联合基因组中的各基因检测检测本质上是血液等体液基因组的定量检测，如采用PCR技术，具有操作简便、检测灵敏、特异性好、重复性高等特点，现今已越来越多地被应用于临床检验技术中。这一技术在现代实验诊断学中已被证实是高灵敏度、高准确度的检测方法，试验技术已经十分成熟，并且我们采用的是这一技术中的标准曲线定量法，可以准确地对各种样品中特点核酸分子做精确定量。
附图说明
图1为TCGA和CPTAC队列中MDEG的识别：(A)在905个代谢基因中使用Limma包识别重要的MDEG；(B)从基于TCGA队列的DNA微阵列中获得重要MDEG的分层分区，这些基因的mRNA表达在534名ccRCC患者和72名正常人中进行，红色高，绿色低；(C)TCGA队列中58个显著MDEG(p<0.05)的单变量Cox回归分析在森林图中进行；(D)使用LASSO回归分析计算ccRCC患者的20-mRNA特征模型(MPM)，Kaplan-Meier生存分析显示风险评分的显著预测价值取决于TCGA队列中的MPM；(E)Kaplan-Meier生存分析显示风险评分的显著预测价值取决于CTPAC队列中的MPM，高危组用红色标记，低危组用蓝色标记。
其中，MDEGs，代谢差异表达基因；MPMs，代谢预测模型；ccRCC，透明细胞肾癌；TCGA，癌症基因组图谱；CTPAC，临床蛋白质组学肿瘤分析联盟。
图2显示MPM的生存风险评估由TCGA和CTPAC队列中的代谢20-mRNA特征组成。在TCGA队列中显示了肿瘤和正常样本中20个特征的生存时间、生存状态(A)、风险评分(B)和分层划分(C)的分布。CTPAC队列中显示了肿瘤和正常样本中20个特征的生存时间、生存状态(D)、风险评分(E)和分层划分(F)的分布。
图3为ccRCC患者独立预后因素和MPM的Cox回归分析、ROC分析和列线图。(A-D)使用森林图在TCGA和CTPAC队列中说明了纳入临床病理参数和MPM的单变量和多变量Cox回归分析。MPM的风险评分显著预测TCGA(p<0.001，HR＝3.131)和CTPAC队列(p＝0.046，HR＝2.893)中ccRCC患者的预后。(E-F)ROC分析显示MPM在TCGA(AUC＝0.768)和CTPAC(AUC＝0.777)队列中具有强大的预测价值。(G)基于5个独立预后因素构建列线图，包括ccRCC患者的ISUP分级、病理M分期、病理T分期、AJCC分期和MPM风险评分。
图4为GSEA根据ccRCC患者中MPM的差异风险评分显示了显著改变的KEGG通路，并具有来自TCGA和CTPAC队列的可用转录组学数据。(A)前5名显著改变了TCGA队列中高风险或低风险ccRCC患者的KEGG通路。(B)在CTPAC队列的高风险或低风险ccRCC患者中，前5名显著改变了显著的KEGG通路。(C)使用ESTIMATE算法测量肿瘤环境纯度，显示与来自TCGA队列的ccRCC患者的MPM风险评分显著相关(r2＝0.2373，p<0.0001)。(D)ccRCC环境中的免疫纯度与MPM的风险评分显著相关(r2＝0.3007，p<0.0001)。
图5显示G6PC是MPM的PPI网络中的枢纽基因，在来自TCGA、CTPAC和RECA-EU队列的699名ccRCC患者中显示出显著的预后价值。(A)PPI网络是在MPM中的20个代谢mRNA特征中构建的。(B-C)G6PC mRNA表达与ccRCC中的肿瘤环境纯度(r2＝-0.1012,p<0.0001)和免疫纯度(r2＝-0.1205,p<0.0001)呈负相关。(D-F)基于TCGA、CPTAC和RECA-EU(ICGC的公开数据)队列显示了ccRCC和邻近正常组织中G6PC的差异mRNA表达。(G-H)Kaplan-Meier生存分析表明低G6PC mRNA表达水平与较差的OS(p<0.0001，HR＝0.35)和PFS(p<0.0001，HR＝0.35)显著相关。(I-J)低G6PCmRNA表达水平与CTPAC(p＝0.0035，HR＝0.218)和ICGA(p＝0.0443，HR＝0.446)队列的不良预后显著相关。
图6显示G6Pase差异表达预测来自FUSCC队列的322名ccRCC患者的结果。(A)在正常肾组织中检测到G6Pase高表达(特别是在小管细胞而不是肾小球细胞中)，而在来自人类蛋白质图谱的ccRCC组织中未检测到。(B)与来自FUSCC队列的ccRCC组织相比，在正常组织中发现G6Pase表达显著升高。(C-D)在来自FUSCC队列的322名ccRCC患者中，低G6Pase表达与不良预后(p<0.0001，HR＝0.316)和侵袭性进展(p<0.0001，HR＝0.414)显著相关。
图7显示ccRCC中G6PC的大多数共表达基因和启动子甲基化水平。(A-B)提取了与G6PC共表达的前50个基因，并显示在ccRCC的热图中。(C)初级ccRCC样品中G6PC的启动子甲基化水平显著低于正常样品(p<0.0001)。(D)G6PC的启动子甲基化水平随着个体癌症分期的升高而显著攀升，并且在第4阶段的样本中最高。(E)G6PC的启动子甲基化水平随着个体肿瘤等级的升高而显著攀升，并且在第4阶段的样本中最高。(F)与pN0患者相比，具有淋巴结转移的ccRCC样本中G6PC的启动子甲基化水平显著更高(p<0.05)。
图8显示G6PC在泛癌和ccRCC微环境中的潜在作用。(A)作为肝脏葡萄糖生成的主要调节剂，在肝脏和肾脏组织中发现高G6PC活性表达。与肾细胞癌(KIRC、KIRP、KICH)相比，正常组织中G6PC的表达显著升高，而与肝细胞癌和胆管癌相比，正常组织中的G6PC表达显著降低；(B)G6PC的拷贝数改变与环境免疫细胞浸润水平显著相关.与正常样品相比，G6PC升高的臂水平缺失导致劣质B细胞、CD8+细胞、CD4+细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞浸润(p<0.05)。(C)G6PC显著参与ccRCC细胞和微环境的异常免疫浸润，与检查点免疫特征、树突细胞、Th1细胞、MHC I类、溶细胞活性、炎症促进、HLA、APC共抑制和共刺激活动(cor.<-0.7)。(D-G)GSEA表明G6PC显著参与了几种信号通路，包括胆汁酸代谢、脂肪酸代谢、上皮间质转化和ccRCC中的E2F靶标。
图9显示共有100个上调和下调基因与ccRCC中的差异G6PC表达相关。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
一、材料和方法
1、原始数据收集和处理
本研究使用了来自ccRCC队列的公开可用的mRNA表达和临床数据。入组患者的同意和伦理批准可在发布数据集的相关原始文章中获得。来自在线数据集的总共718名ccRCC患者，包括从癌症基因组图谱(TCGA)数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)获得的534份ccRCC样本和72份正常样本；从临床蛋白质组学肿瘤分析联盟(CPTAC)获得的93份ccRCC样本和20份正常样本；还包括从RECA-EU(可在国际癌症基因组联盟(ICGC)获得)的91个ccRCC样本。
2、代谢差异表达基因的鉴定
根据KEGG通路图谱筛选出41条代谢通路。使用Limma R包(版本3.6.3)与FDR<0.05和|logFC|>0.5对911个代谢基因进行显著代谢差异表达基因(MDEG)的鉴定。选择TCGA和CPTAC队列之间的交叉代谢基因进行进一步分析。
3、代谢预测模型(MPM)的开发和生存分析
单变量Cox回归分析用于识别重要MDEG的预后影响，并使用生存R包在从林图中呈现。然后，在来自TCGA和CTPAC队列的ccRCC患者中，使用glmnet和生存R包进行LASSO回归分析以构建20-mRNA特征模型、代谢预测模型(MPM)。根据MPM计算每个ccRCC患者的风险评分，从而将ccRCC患者分为低风险组和高风险组。
对于生存分析，选择TCGA和CTPAC队列，这些队列具有手术切除时患者的相关长期生存数据并且病理诊断为ccRCC。生存数据有两种类型：总生存期和无进展生存期。单独曲线中的对数秩检验和具有95％置信区间(95％CI)的Kaplan-Meier方法用于执行后续持续时间分析。同时，在来自TCGA或CTPAC队列的患者中显示了MPM的生存风险评估和层次聚类。
4、Cox回归分析和接受者操作特征曲线构建
来自TCGA和CTPAC队列的所有具有完整转录组信息和相关临床病理参数的ccRCC患者都包括在内用于后续分析。使用带有生存R包的从林图，使用单变量和多变量Cox回归分析来评估代谢簇的独立预后价值。使用生存ROCR包，针对传统临床病理参数和TCGA和CTPAC队列中MPM的风险评分构建受试者工作特征曲线(ROC)。曲线下面积(AUC)用于评估这些预后特征的预测价值。此外，诺模图是在TCGA队列中所有独立预后因素的基础上开发的。
5、基因集富集分析
基因集富集分析(GSEA)使用1000次置换测试进行，以找到最富集的信号通路和涉及分子特征数据库v4.0(MSigDB，P<0.01,FDR<0.25)的代谢通路的显著参与代谢途径。
6、肿瘤微环境纯度评估
使用估计包(http://r-forge.rproject.org；repos＝rforge，dependencies＝TRUE)评估来自TCGA队列的患者的总评分和免疫评分。使用Pearson's r检验评估肿瘤微环境(TME)纯度与MPM或G6PC表达的风险评分之间的相关性。
7、G6PC mRNA差异表达和存活分析
使用用于检索相互作用基因的搜索工具(STRING；http://string-db.org，10.0版)在线数据库构建了MPM中20个特征的蛋白质-蛋白质相互作用网络。使用Student t检验评估来自TCGA、CPTAC和RECA-EU队列的ccRCC和正常样本之间的差异表达G6PC水平。使用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php###)对来自TCGA队列的患者进行G6PC预测预后能力的生存分析。具有95％置信区间(95％CI)和对数秩检验的Kaplan-Meier方法用于CPTAC、RECA-EU和FUSCC的生存分析。
8、ccRCC和正常样本中的葡萄糖6-磷酸酶(G6Pase)表达
由G6PC基因编码的G6Pase蛋白表达在来自人类蛋白图谱(https://www.proteinatlas.org/)和免疫组织化学(IHC)数据的ccRCC和正常样本中检测到，包括染色数量、强度、位置和患者的数据可在线获得。福尔马林固定、石蜡包埋的ccRCC组织和人肾组织在FUSCC队列中使用ab243319(Abcam，美国)以1/3000稀释进行抗G6Pase染色，然后由两名经验丰富的病理学家独立评估。如前所述，基于染色强度和程度得分的乘积，测量了从0到12的整体IHC得分。低G6Pase表达组评分从0到2，高G6Pase表达组评分从3到12。
9、ccRCC中G6PC的免疫细胞浸润
TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)评估系统的各种免疫细胞浸润和临床意义。在这项研究中，进行了免疫细胞浸润与G6PC拷贝数变异和表达水平之间的相关性。
10、统计分析
所有分析均在R(版本3.6.0)和RStudio(版本1.2.1335)和GraphPad Prism 7中进行。除非另有说明，否则当p值小于0.05时，结果被认为具有统计学意义。在所有测试中，两侧和p值小于0.05被视为显著。
二、结果分析
1、在TCGA和CPTAC队列中鉴定代谢差异表达基因(MDEG)
从TCGA队列中的534个ccRCC和72个正常样本中收集了911个代谢基因的表达。同时，CTPAC队列的56例ccRCC患者和47例正常人的911个代谢基因中的905个也被发现。
随后将这905个代谢基因用于进一步分析。在905个代谢基因中鉴定了133个重要的MDEG，并在火山图中进行了可视化(图1A)；从基于TCGA队列的DNA微阵列中获得了重要MDEG的分层分区(图1B)；这些基因的mRNA表达在534名ccRCC患者和72名正常人中进行，红色高，绿色低。同时，在森林图中对TCGA队列中的58个显著MDEG(p<0.05)进行了单变量Cox回归分析(图1C)，值得注意的是，LASSO回归分析在TCGA或CTPAC队列的ccRCC患者中构建了20-mRNA特征模型、代谢预测模型(MPM)。Kaplan-Meier生存分析显示风险评分的显著预测价值取决于TCGA(图1D)或CTPAC队列(图1E)中的MPM，高危组用红色标记，低危组用蓝色标记。
2、TCGA或CTPAC队列中MPM的生存风险评估
MPM的生存风险评估由代谢20-mRNA特征组成，在TCGA或CTPAC队列中进行。在TCGA队列中显示了肿瘤和正常样本中MPM的生存时间、状态(图2A)、风险评分(图2B)和分层划分(图3C)的分布。同时，在CTPAC队列中显示了肿瘤和正常样本中MPM的生存时间、状态(图2D)、风险评分(图2E)和分层划分(图2F)的分布。
3、ccRCC患者独立预后因素和MPM的Cox回归分析、ROC分析和列线图
使用森林图在TCGA和CTPAC队列中说明了纳入临床病理参数和MPM的单变量和多变量Cox回归分析(图3A-D)。MPM的风险评分显著预测TCGA(p<0.001，HR＝3.131)和CTPAC队列(p＝0.046，HR＝2.893)中ccRCC患者的预后。此外，ROC分析表明MPM在TCGA(AUC＝0.768)和CTPAC(AUC＝0.777)队列中具有强大的预测价值(图3E-F)。基于ccRCC患者的5个独立预后因素构建列线图，包括ISUP分级、病理M分期、病理T分期、AJCC分期和MPM风险评分(图3G)。
4、GSEA进行KEGG通路分析
根据ccRCC患者中MPM的差异风险评分，GSEA表明KEGG通路发生了显著改变，并具有来自TCGA和CTPAC队列的可用转录组学数据。高风险或低风险ccRCC患者中前5条显著改变的KEGG通路在TCGA(图4A)或CTPAC(图4B)队列中进行。使用ESTIMATE算法测量肿瘤环境纯度，该算法显示与来自TCGA队列的ccRCC患者的MPM风险评分显著相关(r2＝0.2373，p<0.0001)(图4C)。同时，ccRCC环境中的免疫纯度与MPM的风险评分显著相关(r2＝0.3007，p<0.0001)(图4D)。
5、MPMs PPI网络中的hub基因
G6PC是MPM的PPI网络中的枢纽基因，在来自TCGA、CTPAC和ICGC队列的699名ccRCC患者中显示出显著的预后价值。PPI网络构建于MPM中的20个代谢mRNA特征中(图5A)。G6PCmRNA表达与ccRCC中的肿瘤环境纯度(r2＝-0.1012，p<0.0001)和免疫纯度(r2＝-0.1205，p<0.0001)呈负相关(图5B-C)。基于TCGA、CPTAC和ICGC队列显示了ccRCC和邻近正常组织中G6PC的差异mRNA表达(图5D-F)。此外，Kaplan-Meie生存分析表明，低G6PC mRNA表达水平与TCGA队列中较差的OS(p<0.0001，HR＝0.35)和PFS(p<0.0001，HR＝0.35)显著相关(图5G-H)。在CTPAC(p＝0.0035，HR＝0.218)和ICGA(p＝0.0443，HR＝0.446)队列中，低G6PC mRNA表达水平与不良预后显著相关(图5I-J)。
6、G6Pase差异表达可预测FUSCC队列的结果
G6Pase在正常肾组织(特别是在肾小管细胞而不是肾小球细胞)中高表达，而在ccRCC组织中未检测到人类蛋白质图谱(图6A)。同时，与来自FUSCC队列的ccRCC组织相比，在正常组织中发现G6Pase表达显著升高(图6B)。此外，在来自FUSCC队列的322名ccRCC患者中，低G6Pase表达与不良预后(p<0.0001，HR＝0.316)和侵袭性进展(p<0.0001，HR＝0.414)显著相关(图6C-D)。
7、ccRCC中G6PC的大多数共表达基因和启动子甲基化水平
提取了与G6PC共表达的前50个基因，并在ccRCC的热图中显示(图7A-B)。G6PC的启动子甲基化水平在初级ccRCC样品中显著低于正常样品(图7C，p<0.0001)。G6PC的启动子甲基化水平随着个体癌症阶段的升高而显著攀升，并且在阶段4的样本中最高(图7D)。G6PC的启动子甲基化水平随着个体肿瘤等级的升高而显著攀升，并且在4级样本中最高(图7E)。与pN0患者相比，具有淋巴结转移的ccRCC样本中G6PC的启动子甲基化水平显著更高(图7F，p<0.05)。
8、G6PC在ccRCC免疫微环境中的潜在作用
作为葡萄糖产生的主要调节剂，G6PC在肝肾组织中高度表达。与肾细胞癌(KIRC、KIRP、KICH)相比，正常组织中的G6PC表达显著更高，而与肝细胞癌和胆管癌相比，正常样本中的G6PC表达显著降低(图8A)。同时，G6PC的拷贝数改变与环境免疫细胞浸润水平显著相关(图8B)。与正常样品相比，G6PC升高的臂水平缺失导致劣质B细胞、CD8+细胞、CD4+细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞浸润(p<0.05)。
此外，G6PC显著参与ccRCC细胞和微环境的异常免疫浸润，与检查点免疫特征、树突状细胞、Th1细胞、MHC I类、溶细胞活性、炎症促进、HLA、APC共抑制和共刺激活动(cor.<-0.7，图8C)。此外，GSEA表明G6PC显著参与了几种信号通路，包括胆汁酸代谢、脂肪酸代谢、上皮间质转化和ccRCC中的E2F靶标(图8D-G)。
然后在ccRCC中可视化总共100个与差异G6PC表达相关的上调和下调基因(图9)。使用TIMER在KIRC患者中显示G6PC表达与相关基因和免疫细胞标志物之间的Spearman相关性和估计的统计显著性。
三、结果讨论
人体能量代谢的控制是一个复杂而谨慎的过程，代谢紊乱可能导致多种疾病的发生和发展，例如脂质代谢异常可能会降低生长速度并损害生育能力，而葡萄糖代谢紊乱可导致糖尿病和高血压。重要的是，近年来代谢重编程与肿瘤发生之间的关系越来越受到关注。史蒂文L.Gonias等声称脂质代谢的激活促进胰腺癌中的肿瘤细胞存活和肿瘤进展，研究发现异常的葡萄糖代谢在肿瘤发生中起关键作用。一方面，代谢变化促进了肿瘤的增殖，另一方面也有助于我们更好地了解癌症的特征。例如，PI3K/AKT/mTOR等致癌途径的激活与糖酵解、脂肪酸和谷氨酰胺代谢等生物能量途径的变化有关，为肿瘤治疗提供了新的靶点。
ccRCC是世界上最常见的肾细胞癌类型之一，由于其高转移和复发率而与预后不良有关。ccRCC中的代谢重编程最常与VHL突变相关，这种突变发生在约90％的病例中。在VHL突变疾病中，由HIF介导的代谢途径的激活导致与常氧环境中缺氧的影响相反的途径的激活。以往研究发现ccRCC主要通过乳酸的积累产生能量，称为Warburg效应或有氧糖酵解。HIF-1α作为ccRCC中Warburg效应背后的明显驱动力，会增加GLUT-1的表达，从而促进细胞内葡萄糖的摄取。有趣的是，在ccRCC中GLUT-1表达的增加与浸润的CD8+T细胞数量的减少有关，这表明葡萄糖代谢可能通过肾细胞癌中的另一种机制抑制免疫系统。因此，代谢重编程与ccRCC之间的关系值得进一步探索。
G6PC(Glucose-6-Phosphatase Catalytic Subunit)是一种蛋白质编码基因，与糖原贮积病和低血糖症密切相关。本发明发现，在TCGA、CPTAC、ICGC和FUSCC等多个队列中，ccRCC中G6PC的表达远低于正常组织的表达。生存分析表明G6PC的表达水平与患者的预后呈正相关，表明G6PC在ccRCC中可能具有肿瘤抑制特性。
总之，本发明首先提供了全面阐明预后MDEG格局的机会，使用大规模ccRCC转录组数据建立了新的预后模型MPM，并将G6PC确定为来自多个队列的1040名ccRCC患者的潜在预后目标。这些发现有助于管理风险评估，并为ccRCC的治疗策略提供宝贵的见解。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。