具体实施方式

下面对本发明作详细的说明。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

材料与方法

材料与试剂：

茵红李：宜宾市市购；FX10酵母：法国LAFFORT公司；EX-V果胶酶：法国 LALLEMAND公司；焦亚硫酸钾(食品级)：法国OENOFRANCE公司；碳酸钙(食品级)：德兴市明缘化工材料有限责任公司；白砂糖：市售。

仪器

LB80T手持糖度仪：广东市速为电子科技有限公司；LHS-250SC恒温恒湿箱：上海齐欣科学仪器有限公司；FA2204B分析天平：上海佑科仪器仪表有限公司； MJ-WBL2531H搅拌机：广东美的生活电器制造有限公司；0～40％Vol酒精计：河北省武强县华欧仪器仪表厂；1260infinity II高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；0.22μm水系滤膜：天津市津腾试验设备有限公司。

方法

工艺流程及操作要点

茵红李→挑选、清洗→打浆→果胶酶酶解→调酸、调糖→添加焦亚硫酸钾→酵母活化→发酵→残糖发酵→陈酿→澄清过滤→灌装→检验→成品。

挑选无虫害、无霉烂的茵红李，清洗、打浆。加入0.03g/L果胶酶45℃下酶解2小时，2.0g/L的碳酸钙和碳酸氢钾的混合降酸剂调酸，用市售白砂糖调节糖度，加入一定量的焦亚硫酸钾抑菌剂。将活化后的酵母接种到发酵液中于恒温箱中发酵7d。主发酵结束后进行残糖发酵时间20d左右。将发酵好的酒体密封满罐陈酿2～3个月后，在陈酿好的酒液中加入皂土进行澄清，并再次过滤，得到清澈、透亮的酒体。

茵红李果酒发酵单因素试验

确定发酵时间，初始糖度，发酵温度，焦亚硫酸钾添加量，酵母添加量作为因素进行单因素实验。以上各因素的水平梯度见表1。

表1茵红李果酒单因素试验因素和水平表

茵红李果酒发酵工艺优化正交试验

在茵红李果酒发酵单因素试验的基础上，分别选用发酵时间(A)，初始糖度(B)，发酵温度为(C)，焦亚硫酸钾添加量(D)，酵母添加量(E)5个因素，每个因素选择3个水平，以酒精度作为指标，选用L₁₈(3⁷)进行正交设计来优化最佳茵红李果酒发酵工艺条件。

指标测定

酒精度、还原糖：参照GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》酒精计法测定酒精度、还原糖运用直接滴定法；糖度：采用手持折光仪测定。

有机酸测定

色谱条件：取5mL原酒液临用前经0.22μm尼龙滤膜过滤后进样分析。依照有机酸测定方法，HPLC条件为：Agilent ZORBAX SB-Aq(4.6mm×250mm， 5μm)色谱柱，检测波长：210nm，流动相A为磷酸二氢钾(pH＝2.4)95％，并用H₃PO₄调节pH值，流动相B为甲醇5％，进样量15μL，流速0.4mL/min，柱温25℃。

溶液配制：配置0.05mol/L的KH₂PO₄溶液，用H₃PO₄调节pH值至2.4作为流动相，抽滤后超声备用。单一标准储备液：精确称取适量丙酮酸、苹果酸、莽草酸、草酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸、酒石酸标准品分别置于5mL容量瓶中，用超纯水溶解稀释至刻度，得到质量浓度分别为1.1、0.66、 0.46、0.78、0.98、0.92、0.44、0.46、0.46、0.40mg/mL的标准品溶液，置于4℃条件下避光保存备用。混合标准工作液：由于丙酮酸、莽草酸、富马酸、草酸的峰值较大，将其混合成一组母液，另外6种混合成一组母液，分别移取适量的各单一标准储备液混合，分别取母液200、400、600、800、1000uL，加超纯水到1mL,得到梯度混合标准液。

茵红李果实前处理：取一定量茵红李果肉打浆，取10g匀浆，转移到50mL 容量瓶中，加入超纯水，于75℃水浴加热浸提45min，冷却至室温后定容。超声提取30min后过滤。取一定量的滤液，以4000r/min离心30min，分离沉淀蛋白质、果胶等干扰物质，取上清液用0.45μm孔径的滤膜过滤，滤液即为样液，进样前再过一次0.22μm尼龙滤膜。

数据统计分析：应用Microsoft Office Excel 2016软件进行数据处理， SPSS 24进行显著性分析，采用Origin 2017进行图表的绘制；所有试验均重复 3次。

结果与分析：发酵时间对茵红李果酒酒精度和还原糖的影响

如图1中所示，在不同的发酵时间下，酒精度随发酵时间的推移呈现先上升然后趋于平衡的趋势，在发酵前5d酒精度随时间增加而上升，而5d后酒精度趋于稳定(P>0.05)。当发酵时间为7d的时候，酒精度达到最大，为12.8％。随着时间的延长，发酵后的果酒中的还原糖的含量逐渐减少，其中9～11d的还原糖趋于稳定(P>0.05)，而3～7d的还原糖含量变化较大。由此初步而确定最适宜的发酵时间为7d。发酵时间影响果酒酒精度主要是因为随着时间的延长酵母菌能够得到充分的生长与繁殖，待无氧条件后开始进行酒精发酵，而当酒精到达一定的量时会对酵母的酒精发酵产生抑制作用，因此酒精度在一段时间后会趋于稳定。同时发酵初期酵母菌的生长和无氧呼吸都要消耗糖类物质，利用还原糖的量也就越多，还原糖的含量会出现初期急剧下降，而后缓慢下降的趋势。

初始糖度对茵红李果酒酒精度和还原糖的影响

如图2中所示，当初始糖度增加时酒精度先升高在下降。当初始糖度为23° Bx的时候酒精度最高为13.7％。糖能够为酵母菌的生长必需的营养物质，在一定浓度范围内酵母菌处于繁殖阶段，能很快的将糖转化为酒精，对酒精度的发酵起到一定的促进作用。过高的糖分会影响酵母菌的代谢，甚至造成酵母死亡，由此酒精度有所降低。同时，初始糖度的增加，还原糖含量逐渐增大，在23° Bx时，还原糖含量相对较低为6.875g/L。这是由于适合的糖含量会对酵母菌的生长有一定的促进作用，而高糖会造成的渗透压的升高会在一定程度上抑制酵母的生长繁殖，不利于发酵，所以还原糖的含量会增加显著(p<0.05)。由此确定最适宜的初始糖度为23°Bx。

发酵温度对茵红李果酒酒精度和还原糖的影响

如图3中所示，在不同的温度下，酒精度随温度的上升呈现先后稳定的趋势，当温度在24℃时酒精度的值达到11.1％。随着温度的增加，酵母菌的代谢的能力增强，导致酵母菌的发酵速度加快，过高的温度会造成酵母的早衰现象，对果酒的风味影响较大，导致在27℃之后酒精度变化不大(P>0.05)。同时，温度对还原糖的影响很大，温度在18～24℃，还原糖有个骤减的趋势(P<0.05), 这是由于温度较低时，酵母生产缓慢，对糖的需求量减少，当温度在24℃时，达到该酵母所合适的温度，因此把大部分的糖转化成了酒精，还原糖的含量急剧下降，当温度过高时，大部分酵母菌停止生长，所以残留的还原糖趋于稳定 (P>0.05),由此初步确定最适宜的发酵温度为24℃。

焦亚硫酸钾对茵红李果酒酒精度和还原糖的影响

如图4中所示，在不同的偏重亚硫酸钾的添加量下酒精度变化不大(P>0.05), 当焦亚硫酸钾添加量为0.09g/L时，酒精度最高为12.8％；还原糖随焦亚硫酸钾量的增加先减少后增加，当焦亚硫酸钾的添加量为0.09g/L时，还原糖的含量最少，而当偏重亚硫酸钾的添加量大于0.09g/L时，还原糖的含量有所增加，由此初步确定最适宜的焦亚硫酸钾添加量为0.09g/L。这是由于焦亚硫酸钾在一定的条件下会分解成SO₂，由于SO₂具有杀菌作用，造成此现象的原因是当游离的SO₂达到一定的量时，不仅会杀死其他微生物，对酵母菌也有一定的杀伤能力，甚至会杀灭一些较弱的酵母菌，因此果酒中的还原糖被利用的就少。

酵母添加量对茵红李果酒酒精度和还原糖的影响

如图5中所示，随着酵母添加量的增加，酒精度呈现先上升在下降的趋势，当酵母添加量为0.4g/L时酒精度最高为14.05％。酵母的添加量过少会导致营养物质的利用降低，自身繁殖代谢慢，杂菌生长快，产酒精量少；接种量过大，酵母菌繁殖过旺，需要消耗大量的糖分用于自身生长，代谢为的酒精含量反而降低。同时，当酵母的添加量逐渐增加时，还原糖的含量逐渐减小。当酵母的添加量为0.7g/L的时候，还原糖的含量达到最低。酵母的添加量越多果酒发酵中对营养物质的需求越大，剩余的还原糖的含量就越小，所以还原糖的含量随着酵母菌的添加量的增加而减小。虽然酵母的添加量越多会影响其生长，但对还原糖的消耗仍然会继续。由此选0.4g/L做为酵母最适宜的添加量。

正交试验结果

在茵红李果酒发酵单因素试验的基础上，选出以上因素的较优范围，以酒精度作为指标，选用L₁₈(3⁷)进行正交设计来优化茵红李果酒发酵工艺条件。因素和水平表见表2，试验方案和分析结果见表3。

表2正交试验水平因素

由表3知，影响酒精度得因素大小关系依次为发酵时间(A)＞发酵温度(C) ＞初始糖度(B)＞焦亚硫酸钾添加量(D)>酵母添加量(E)。最佳工艺参数为A₂B₂C₃D₃E₂，即发酵时间为7d，初始糖度23°Bx，发酵温度为24℃，焦亚硫酸钾添加量为0.09g/L，酵母添加量为0.4g/L。由于最佳试验组未出现在试验设计内，因此按此条件进行了重复验证试验，在此优化条件下发酵7d后，茵红李果酒的酒精度(以体积分数计)为14.5％，高于其它各发酵组，可见该工艺结果可靠，由此确定茵红李果酒最佳发酵工艺组合为A₂B₂C₃D₃E₂。

表3正交试验结果

有机酸测定结果

有机酸标准品混合溶液色谱图及有机酸含量结果如图6和表4中所示。由图6可知，10种混合有机酸能较好地分离，峰形较好，没有重叠和拖尾现象，表明本试验色谱条件适用于茵红李果实和果酒中有机酸的测定。由表4可知，茵红李果实中一共检出7种酸，分别是苹果酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、莽草酸、丙酮酸、富马酸。最多的有机酸是苹果酸，达到6.976g/kg，其次是草酸含量为0.409g/kg，最少的酸是富马酸含量为0.004g/kg，其余4种酸含量均在0.1g/kg以下。茵红李果酒残糖发酵结束后对10种有机酸进行检测，共检出9种，未检出莽草酸，检出的有机酸分别为草酸、丙酮酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、富马酸。其中苹果酸、乳酸、琥珀酸的含量较高，最高含量分别达到4.503g/L、3.37g/L、0.832g/L，而草酸、乙酸、柠檬酸、丙酮酸、酒石酸、富马酸的含量均保持在0.5g/L以下，表明苹果酸、乳酸、琥珀酸是茵红李果酒中的主要有机酸。

茵红李果实中的主要有机酸为苹果酸，含量最高。残糖发酵过程会触发苹果酸乳酸发酵，苹果酸会转化成乳酸，最终乳酸含量增加，乳酸还来源于酵母的酒精发酵，成为除苹果酸以外含量最高的酸；琥珀酸是酵母菌的三羧酸循环 (TCA)的中间产物；丙酮酸由糖酵解途径产生。乙酸含量较低为0.023g/L，它是酒精发酵过程中乙醛经氧化还原作用产生，也是极少量的醋酸菌进行了醋酸发酵产生了少量的乙酸。

茵红李果酒中柠檬酸比果实中多，这是由于柠檬酸在酵母有氧和无氧状态都会产生，在有氧条件下，经TCA循环生成；无氧条件，由草酰乙酸还原得到。外界条件对柠檬酸代谢有很大的影响，因此柠檬酸在酒中含量比果实中含量多或少都是有的。与茵红李果实相比茵红李果酒中草酸的含量降低，草酸经过氧化、脱羧和乙酰化作用生成了CO₂；在茵红李果酒中莽草酸未检出，莽草酸是经过莽草酸途径被分解为苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸被酵母所利用。

表4有机酸测定结果

表4中，N.D表示未检测出。

由以上可知：通过单因素试验，在茵红李果酒发酵过程中，酵母添加量、初始糖度、发酵温度、发酵时间、焦亚硫酸钾添加量对酒精度、还原糖均有影响，通过正交设计优化得茵红李果酒发酵最优工艺为发酵时间7d，初始糖度 23°Bx，发酵温度24℃，焦亚硫酸钾添加量0.09g/L，酵母添加量0.4g/L。

采用HPLC，对茵红李果实及其发酵果酒中有机酸进行测定。在果实中定量检测出来7种酸，其中苹果酸含量最高占果实检出总酸的92.5％，其他6种有机酸含量都不超过0.5g/kg；在茵红李果酒中定量检测出了9种有机酸，苹果酸含量最高，占检出酸总和的47.2％，其次是乳酸占35.3％，琥珀酸占8.7％，其他 6种酸检出量均低。茵红李果实经发酵成茵红李果酒后，苹果酸含量降低，乳酸含量增加，但苹果酸相较于其他种类水果果酒中含量还是较多的。

以上，针对茵红李果实的果酒酿造工艺还可以应用于其他李子品种中。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。