NAC转录因子基因VaNAC08及其应用
阅读说明：本技术 NAC转录因子基因VaNAC08及其应用 (NAC transcription factor gene VaNAC08 and application thereof ) 是由 王泽民 晋昕 杨江伟 司怀军 梁振昌 于 2021-07-13 设计创作，主要内容包括：本发明提供了葡萄NAC转录因子基因VaNAC08及其应用。具体提供了葡萄野生种山葡萄和栽培种‘玫瑰香’NAC转录因子基因NAC08序列,NAC转录因子基因NAC08克隆方法并验证了该基因功能,进一步确定该基因在调节葡萄细胞可溶性糖、提高葡萄细胞膜低温耐受能力,最终提高葡萄抗寒能力中的应用。(The invention provides a grape NAC transcription factor gene VaNAC08 and application thereof. Particularly provides a wild grape and cultivated species 'rosewood' NAC transcription factor gene NAC08 sequence of grape, NAC transcription factor gene NAC08 cloning method and verifies the gene function, further determines the application of the gene in regulating the soluble sugar of grape cell, improving the low temperature tolerance of grape cell membrane and finally improving the cold resistance of grape.)
技术领域
本发明属于种质资源培育和分子生物学领域，具体涉及NAC转录因子基因VaNAC08及其应用。
背景技术
葡萄(Vitis vinifera L.)是葡萄科葡萄属多年生落叶藤本植物，是人类最早驯化的水果作物，在我国具有悠久的栽培历史，其漫长的驯化过程早在8000多年前就开始了。葡萄是世界上第二大果树作物，广泛用于鲜食、酿酒、制干等，具有重要的经济价值。2019年国际葡萄酒局(OIV)数据显示，中国目前有847千公顷葡萄园种植面积，葡萄产量达1366.7万吨。我国葡萄产业在国际上具有重要地位，近年来，栽培面积和产量都逐年增加。
转录因子在转录水平上与DNA序列互作调节基因的表达与调控，是基因表达与调控中关键的一步，它结构的多样性决定表达与调控功能的多样性。对植物生长发育和应对生物或非生物胁迫的应答起着重要的调控作用。同时这也是一个信号传导网络，有的交叉存在于各信号传导途径之间，形成调控因子之间的多重组合。植物中大约有7％的编码基因是编码转录因子的，同时研究发现这些基因大多都是在生物与非生物胁迫早期响应的基因。NAC转录因子是在植物生长发育过程中具有多种生物学功能的蛋白家族。NAC家族转录因子不仅调控植物的生长发育，而且在植物逆境胁迫(生物或非生物胁迫)应答等过程中发挥着重要的调控作用，葡萄中关于NAC转录因子抗寒鲜见报道。
现有技术存在的问题：现有技术中未报道关于葡萄NAC转录因子基因VaNAC08及其应用，本发明旨在为基因资源挖掘利用，促进葡萄抗寒培育提供理论和技术依据。
发明内容
本发明要解决的关键技术问题在于提供NAC转录因子基因VaNAC08及其应用。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
1.葡萄NAC转录因子基因NAC08，所述NAC转录因子基因NAC08的CDS序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
2.葡萄NAC转录因子基因NAC08调控葡萄抗寒能力的应用。
3.葡萄NAC转录因子基因NAC08提高葡萄抗寒能力的应用，采用过表达所述NAC08基因的表达予以实现。
4.NAC转录因子VaNAC08提高葡萄细胞可溶性糖中的应用
正常条件下，过表达细胞系和野生型细胞系可溶性糖含量无显著差异；而在低温(4℃， 4h)处理后，35S::VaNAC08(OE-VaNAC08)过表达转基因细胞系可溶性糖显著增加，而NAC08-ED突变的转基因细胞则显著降低。结果预示着VaNAC08跟葡萄可溶性糖含量呈正相关。
5.NAC转录因子VaNAC08降低葡萄细胞相对电导率中的应用
对OE-VaNAC08细胞系、NAC08-ED细胞系和野生型细胞系进行低温处理，并收集样品测定相对电导率。低温能够显著增加野生型和NAC08-ED突变细胞系相对电导率。进一步分析发现，低温(4℃)处理4h后OE-VaNAC08细胞系相对电导率显著低于野生型植株。各结果预示着VaNAC08基因的上调能够在一定程度上保护细胞，防止渗透胁迫引起的离子渗漏，原因是OE-VaNAC08细胞系拥有更强耐受性，而使细胞伤害程度降低。
6.一种载体，所述载体含有如序列表SEQ ID NO.1所示基因。
7.NAC转录因子基因VaNAC08及其克隆方法，具体包括如下步骤：(1)总RNA提取及cDNA的合成；(2)引物设计及基因克隆；(3)克隆载体构建及基因测序。
8.NAC转录因子VaNAC08功能验证方法，具体包括如下步骤：(1)VaNAC08植物过表达载体构建；(2)NAC08-ED(CRISPR/Cas9介导的基因突变)载体构建；3)葡萄遗传转化； (4)外源基因表达量检测；(5)转基因材料生理生化指标测定及抗寒性评价。
有益效果：本申请提供了葡萄野生种山葡萄和栽培种‘玫瑰香’NAC转录因子基因NAC08 序列，NAC转录因子基因NAC08克隆方法并验证了该基因功能，进一步确定该基因在调节葡萄细胞可溶性糖、提高葡萄细胞膜低温耐受能力，最终提高葡萄抗寒能力中的应用。
附图说明
图1为NAC08扩增电泳结果。
图2为NAC08序列比对。
图3为NAC08过表达鉴定。A.VaNAC08和NPTII插入检测；B.VaNAC08表达检测，以Actin和MDH做内参。每个数据为9次重复的平均值，误差线为标准差。*表示与EV之间存在P<0.05的显著性差异(t检验)。
图4为低温胁迫下VaNAC08过表达葡萄细胞抗寒性及生理指标测定。A.过表达VaNAC08细胞的冰点(LTE)，过表达细胞系(OE-VaNAC08)和对照组(空载)的表型鉴定。每个数据为9次重复的平均值，误差线为标准差。*表示与EV之间存在P<0.05的显著性差异(t检验)。B.电解质渗出率；C.可溶性糖含量。每个数据为6次重复的平均值，误差线为标准差。差异表示在P<0.05的显著性差异(Duncan’s multiple range检测)。
图5为CRISPR/Cas9介导的突变材料NAC08-ED鉴定。
图6为CRISPR/Cas9介导的突变材料NAC08-ED的突变分析。A.NAC08基因中编辑位点示意图。蓝框表示外显子，绿线表示内含子。T是靶序列位置。SP-F和SP-R是用于PCR 扩增的引物。B.两种编辑型m3和m4测序峰图展示。C.EV材料编辑测序鉴定。D.30个克隆扩增子的测序结果。同源核苷酸用阴影表示，不同的颜色表示不同的同源水平。同源水平为100％的核苷酸用蓝色表示，同源水平为75％的核苷酸用红色表示。右边的红色数字表示检测到的具有相同突变类型的克隆数量。E.编辑结果(D)中相应突变序列的氨基酸突变。
图7为NAC08-ED材料抗寒性及生理指标测定。A.NAC08-ED葡萄愈伤组织的LTE。数据为9个生物重复的平均值±SE。冷胁迫下NAC08-ED葡萄愈伤组织和空载体愈伤组织的电解质渗漏率(B)和可溶性糖含量(C)，(P<0.05，Duncan’s multiple range检测)。
具体实施方法
本发明专利下述实施例中使用方法和装置，如无特殊说明，均为常规方法和装置；所用器材、试剂均为试剂公司购买的常规器材和试剂。为使本发明专利的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明专利的
具体实施方式
进行详细说明。这些优选实施方式的示例在具体实施例中进行了例示。在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明专利的技术方案，在实施例中仅仅示出了与根据本发明专利的方案密切相关的技术方案和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。
实施例1
本实施例提供葡萄NAC转录因子基因NAC08序列，所述NAC转录因子基因NAC08的CDS序列如序列表SEQ NO.1所示。
实施例2
本实施例提供葡萄NAC转录因子基因NAC08及其克隆方法，具体包括如下步骤：
1.总RNA提取及cDNA的合成
(1)分别取山葡萄和“玫瑰香”组培苗苗幼叶100mg在液氮中研磨成粉末，按照附录I 所述的方法提取葡萄总RNA，经超微量紫外分光光度计测定RNA纯度和浓度，取 OD260/280位于1.9-2.1之间的RNA样品用于逆转录反应。
(2)上述RNA样品置于冰盒中缓慢解冻，1st Strand cDNA Synthesis试剂盒置于冰上解冻后涡旋混匀，再置于碎冰中。
(3)取上述微量离心管(RNase free)加入RNA 1μg(根据浓度计算得到相应体积)、RNase Free ddH2O补足至8μL，65℃加热5min，迅速置于冰冰上静置2min；取出上述离心管，加入5×gDNA Bμffer 2μL。置于PCR仪上42℃反应2min，使样品中的DNA充分降解。
(4)取出上述离心管，加入10×RT Mix 2μL、HiScript III Enzyme Mix 2μL、Oligo(dT) 20VN 1μL、RNase-free ddH2O和5μL RNase Free ddH20补足至20μL。置于PCR仪上37℃反应45min，85℃变性5sec。取出逆转录得到的cDNA稀释10倍用于后续PCR扩增。
2.引物设计及基因克隆
从葡萄基因组数据库(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中下载NAC08的转录本序列(GSVIVG01008839001)，利用Primer5.0软件在5'-UTR和3'-UTR分别设计引物F： 5’-CCGGGAACCAAACATAGCCT-3’，R：5'-CGTCGGATGGAACCTGAAGC-3'，引物送北京擎科生物公司合成。
以葡萄cDNA的第一链为模板采用I5 DNA高保真聚合酶对NAC08基因编码区进行PCR 扩增，反应体系为：cDNA temple 1μL，2×I5mix 25μL，Forward primer(10μM)2μL，Reverse primer(10μM)2μL，ddH2O补至50μL，ddH2O补充至50uL。反应程序为：98℃变性2min，35个循环(98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸1min)，72℃延伸6min，产物经琼脂糖电泳检测特异性，结果如图1所示。
3.克隆载体构建及基因测序
(1)取上述具有清晰条带的琼脂糖凝胶，采用附录Ⅱ所述方法回收NAC08基因片段，并采用超微量紫外分光光度计测定纯度和浓度。
(2)将上述PCR产物连入pLB-T Easy载体，体系如下：在微量离心管中加入加A尾后的PCR产物1.5μL，2×Rapid Ligation Buffer 2.5μL，pLB-T Easy Vector 0.5μL，T4 DNALigase 0.5μL，将离心管置于4℃过夜，产物在-20℃保存备用。
(3)制备LB平板。在适宜温度的灭菌的100mL LB固体培养基中加入适量氨苄青霉素 (Amp，100mg/mL)，将培养基与抗生素混匀后倒入无菌培养皿中待冷却；
(4)在冰上缓慢融化大肠杆菌5α感受态细胞，加入连接好的产物，用移液器轻柔混匀，在冰上放置30min；
(5)42℃水浴60sec，然后立即冰浴2min；
(6)每实验管中加入700μL无抗生素的LB液体培养基，37℃，220rpm振荡培养45～60 min；
(7)吸取适量菌液加到选择性培养基上，用涂布器均匀涂开；
(8)待培养基表面菌液干后，倒置于37℃恒温培养箱中，培养12-16h；
(9)从LB平板挑取正常生长的克隆，接种于1mL含Amp(100mg L-1)的LB液体培养基中，37℃条件下220rpm振荡培养6h，然后取1μL菌液进行PCR检测；
(10)用无菌枪头挑取白色单菌落,加入到1mL LB培养基(含50ng/mL Amp)中， 37℃，220r/min振荡培养16h；
(11)取1μL菌液,采用5.2.3所述的PCR反应条件进行菌液PCR鉴定,并经琼脂糖电泳检测扩增特异性。
(12)将经PCR鉴定含有目的片段的菌液送北京擎科生物测序(测序采用通用引物PLB-F/R)，进一步鉴定基因序列的完整性，并将序列结果与葡萄数据库黑比诺基因组相应序列进行比对。NAC08序列见附图2和附列表。之后将检测正确的阳性克隆送往公司测序，结果如图2所示。
实施例3
本实施例提供VaNAC08基因的应用，具体包括：
1、植物表达载体p2300-VaNAC08的构建
(1)以克隆载体质粒(连有VaNAC08)为模板，用引物NAC08-F/NAC08-R扩增获得VaNAC08基因ORF区，得到的PCR产物纯化后备用。
(2)将pCAMBIA2300载体质粒同样用KpnI进行单酶切，电泳检测，回收载体大片段。用KpnI进行单酶切，配制如下反应：pCAMBIA2300 1μg，KpnI 1μL，10×CutSmart Buffer 5μL，ddH2O补至50μL。置于37℃，8h，然后电泳检测，回收纯化得到线性质粒。
(3)将回收的VaNAC08片段用同源重组酶连入pCAMBIA2300载体，在微量离心管中加入VaNAC08片段3μL，pCAMBIA2300 1μL，2×Sosoo mix 1μL，ddH2O 5μL。将反应液置于50℃连接30min。
(4)将连接产物通过热激法转化大肠杆菌DH5α，将菌液涂于相应的抗性筛选LB培养基上，37℃过夜，倒置培养。
(5)经PCR和测序验证后，将构建好的表达载体命名为p2300-VaNAC08。
2、CRISPR/cas9基因编辑载体构建
(1)将目标基因的NAC08基因gDNA序列输入到targetDesign在线工具 (http://skl.scau.edu.cn/targetdesign/)中，寻找潜在的Cas9靶位点，根据其在基因中的位置和脱靶可能性，选择输出的靶位点设计目标sgRNAs。将20bp sgRNA序列连接到p1C.4(吉锐生物)载体上，方法如下：(1)靶位点引物设计:GCGGAGTTGCAGTTACCTCCAGG；正向通用引物序列如下：U6p.4-F： 5’_CAGGAAACAGCTATGACCATATTCATTCGGAGTTTTTG TATC_3’，反向引物NAC08cas9-R：NAC08cas9-R：5’_GCTATTTCTAGCTCTAAAAC-(GGAGGTAACTGCAAC TCCGC)-AATCACTACTTCGACTCT_3’，将设计后的序列送公司合成，纯化级别为PAGE。
(2)使用限制性内切酶EcoRI、XbaI双酶切pP1C.4载体，酶切后的产物通过凝胶电泳后进行切胶回收。
(3)载体构建和验证。将重组产物通过热激法转化大肠杆菌感受态，转化实验步骤参照 2.1.12，。筛选分为两步：首先使用通用引物U6p.4-F/gRNA-R进行PCR检测，通过凝胶电泳回收目的片段大小为400bp左右。对回收片段限制性内切酶XbaI进行酶切检测，未被内切酶切开的为阳性克隆。然后将阳性克隆送公司测序验证序列的正确性。测序引物为M13F(-47)，对目的片段的测序为反向。阳性克隆验证完毕后，再使用引物Hygjc2-F/R，以及Cas9相关的引物对载体中另外两个元件进行PCR检测，检测阳性即为最终载体。
3、农杆菌介导法转化葡萄愈伤组织
确定阳性克隆载体后，将相应载体分别转入葡萄41B悬浮培养的细胞中，转化空载体作对照。具体操作方法如下：
农杆菌悬浮液的制备：
(1)第1次活化。取-20℃保存的农杆菌菌液活化：取5mL的LB液体(5mL LB pH 7.2+25μL 1M MgSO4+10μL 50g L-1Rif+2.5μL 100g L-1Kan)，接入菌液200-500μL， 28℃，200rpm培养过夜，直到液体变浑浊；
(2)第2次活化。取上述第1次活化后的菌液300μL-500μL加入到25mL的新鲜液体LB中(25mL LB pH 7.2+125μL 1M MgSO4+50μL 50g L-1Rif+12.5μL 100g L-1Kan)， 28℃，200rpm培养过夜，直至菌体重新摇起至OD600为0.6-0.8；
(3)4℃，5000rpm，离心10min，弃上清，收集菌体；
(4)用25mL LB培养基(pH5.6，加125μL 1M MgSO4)重悬，加入25μL 100mM的 AS，28℃，200rpm继续摇3小时以上；
(5)4℃，5000rpm，离心10min收集菌体，加入25mL GM洗涤2次；(注意：洗涤、重悬菌体时，要用手轻摇，切勿用枪头反复吹吸)
(6)加10mL的GM重悬菌体，吸取重悬后的菌液1mL测量OD值x；
(7)侵染时需要加入的菌体细胞悬浮液体积为：(0.2/x)mL。
侵染体系的准备：
(8)在无菌三角瓶中先加入10mL的GM培养基；
(9)加入0.5-1mL的悬浮培养葡萄细胞；
(10)最后加入农杆菌悬浮细胞(体积为7中计算)；
侵染及共培养：
(11)将三角瓶置于28℃，120rpm轻摇30min；
(12)用移液管将三角瓶中的细胞全部吸出，转移到无菌的培养皿中；
(13)将多余液体全部吸出，尽量吸干液体；
(14)将细胞转移到滤纸上；
(15)将细胞轻轻的摊匀，尽量使每个细胞都接触到培养基，但不要过于分散；
(16)将上述培养皿在28℃恒温培养箱中，共培养2-3天(视共培养具体情况定)；
农杆菌洗涤及筛选：
(17)将滤纸上的细胞用25mL GM培养基洗脱到100mL三角瓶中，用手轻轻振荡1-2min；
(18)用25mL GM重复洗涤1次；
(19)用5mL移液管将细胞转移到新的三角瓶中，加50mL GM(含相应抗生素)
(20)25℃，120rpm，黑暗条件下培养，每7天更换液1次培养液，直至新的细胞长出；
(21)选取NAC08 ORF片段、pCAMBIA2300载体新霉素(NPTII/Kan)抗性基因以及pP1C.4潮霉素(Hyg)抗性基因序列，利用引物设计软件Primer 5.0设计鉴定引物 (NAC08-ORF-F：5’-ATGACAGCGGAGTTGCAGTTA-3’，NAC08-ORF-R： 5’-GAAGGGCTT CTGCAGGTACA-3’；NPTII-F： 5’-ATTACCTTATCCGCAACTTCTTTACC-3’，Hyg-R： 5’-AGCCCCTGATGCTCTTCGTC-3’；HPTII-F：5’-CTTCTGCGGGCGATTTGT-3’，Hyg-R：5’-GCCGTGGTTGGCTTGTATG-3’)，选择最优引物由北京擎科新业生物公司进行合成。
(22)按照附录Ⅲ所述方法提取转基因细胞DNA，采用鉴定引物进行PCR检测，反应程序为：预变性98℃2min，30个循环(98℃变10sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min)， 72℃延伸6min)，最后采用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测分析，结果如图3和图5所示。
4、基因表达量分析
(1)截取NAC08 ORF片段避开NAM保守结构域，利用引物设计软件Primer 5.0设计并合成qRT-PCR引物(qNAC08-F：5’-GAGCCCAAGTGGAAGGAGTG-3’，qNAC08-R： 5’-GATTATTCGGGAACTGAGACAAAA-3’)。同时设计合成内参基因葡萄内参基因Actin 基因(GenBankaccession NO.EC969944，Actin-F：5’-CTTGCATCCCTCAGCACCTT-3’， Action-R：5’-TCCTGTGGACAATGGATGGA-3’)和葡萄内参基因MDH(GenBank accession NO.EC921711，MDH-F：5’-CCATGCATCATCACCCACAA-3’，MDH-R： 5’-GTCAACCATGCTAC TGTCAAAACC-3’)的引物序列。
(2)按照附录Ⅰ所述方法提取转基因细胞RNA，采用诺唯赞定量试剂盒，按照反转录实时荧光定量专用反转录试剂q-RT SuperMix进行，具体操作步骤如下：先去除基因组DNA：4×gDNA wiper Mix 2μL，RNA 1μg，RNase-free ddH2O补至16μL置于42℃2 min；然后在上一步的混合液加入5×HiScript II qRT SuperMix II 4μL，置于50℃15min， 85℃5sec产物在-20℃保存备用。
(3)用于荧光定量PCR检测的cDNA按照1:10加ddH2O稀释备用，并按如下建立荧光定量PCR反应体系反应：2×SYBR Green I Master Mix 10μL，引物混合液0.8μL，cDNA 1.0μL，ddH2O 8.2μL。实验仪器使用BIORAD公司的CF96荧光定量PCR仪，反应条件使用标准模式，反应程序为：95℃预变性10min，39个循环(95℃变10sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec)。收集各反应Ct值，采用2-△△Ct法分析基因相对表达量。结果如图3所示。
5、转基因细胞系生理指标测定及抗寒性评价
(1)分别选取过表达相对表达变化最大的三个细胞系和基因突变中Cas基因相对表达量最高的三个细胞系(同时培养野生型细胞系和空载对照细胞系，基因突变系编辑分析结果如图6所示)，每个细胞系3瓶，继代培养7d后采用差热分析系统(DTA)对葡萄悬浮细胞的耐寒性进行了评价。Keithley数据采集系统(DAS)(2700-DAQ-40型)与可编程的冷冻机(Tenney环境测试室(T2C型)相连接，用于测量和收集电压输出。将愈伤组织直接置于热电模块(TEMs)上，以空载体(EV)作为对照。30min降至4℃后冰箱编程：在4℃1h，在10h(2℃h-1)的冷却速率下下降到-16℃，维持在-16℃1h，然后在45分钟内回到4℃。 DAS从每个TEM每隔15秒记录一次信号。通过热敏电阻输出(x轴)与负载TEM输出减去空载TEM输出(y轴)的关系图识别放热。采用低温放热法(LTEs)进行耐寒性评价，结果如图4A和7A所示。
(2)分别选取过表达相对表达变化最大的三个细胞系和基因突变中Cas基因相对表达量最高的三个细胞系(同时培养野生型细胞系和空载对照细胞系)，每个细胞系3瓶，继代培养7d后，在正常生长条件和低温(4℃4h)处理后，收集材料进行相对电导率测定，结果如图4B和7B所示；可溶性糖的测定结果如图4C和7C所示。其中相对电导率使用浸泡法测定，可溶性糖含量使用索莱宝可溶性糖测定试剂盒(BC0030)进行。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
附录Ⅰ：植物总RNA提取方法
按照TIANGEN RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书进行操作(有删改)，具体步骤如下：
1.100mg左右植物材料在液氮中迅速研磨成粉末，加入500μL裂解液SL，立即涡旋震荡混匀。
2.12,000rpm离心2min。
3.将上清液转移到过滤柱CS中，12,000rpm离心2min，吸取收集管中上清至新的RNase-Free的离心管中。
4.缓慢加入0.4倍上清液体积的无水乙醇，混匀后将得到的溶液和沉淀一起转入CR3 中，12,000rpm离心15sec，倒掉废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
5.向吸附柱CR3中加入去蛋白液RW1，350μL，12,000rpm离心15sec，倒掉废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
6.配制DNase I工作液：取DNase I储存液放入新的离心管(RNase-Free)中，每10μL加入70μL缓冲液RDD，轻柔混匀。
7.向吸附柱CR3中加入DNase I工作液80μL，室温下放置15min。
8.向吸附柱CR3中加入去蛋白液RW1，350μL，12,000rpm离心15sec，倒掉废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
9.向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW，12,000rpm离心15sec，倒掉废液，将吸附柱CR3放回收集管中。重复一次。
10.12,000rpm离心2min，将吸附柱CR3放入一个新的离心管(RNase-Free)中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-50μL RNase-Free ddH2O，室温放置2-3min，12,000rpm离心2min，得到RNA溶液。
11.测定RNA浓度，并电泳检测RNA质量，检测合格后，-70℃超低温冰箱保存备用。
附录Ⅱ：琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段
按照北京庄盟微柱浓缩琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书操作(有删改)，具体步骤如下：
1.在含有目的片段的琼脂糖凝胶切出，放入1.5mL离心管中；
2.称量胶块重量，并按0.l g加300μL溶胶液计算，55℃水浴10min，期间上下颠倒混匀几次，以确保胶块充分溶解；
3.将胶溶液加入到吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心30-60sec，弃滤液；
4.向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30-60sec，弃滤液。重复一次；
5.将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min；
6.将吸附柱放到一个新的离心管中，室温放置5分钟，然后向吸附膜中间位置滴加10 μL 65℃预热的ddH2O，室温放置2-3min，12000rpm离心2min，收集DNA溶液，置于 -20℃保存备用。
附录Ⅲ：植物基因组DNA提取方法
按照艾德莱DNA提取试剂盒试剂盒说明书进行(有删改)，具体操作步骤如下：
1.取转基因拟南芥新鲜叶片约100mg，以野生型和空载为对照，加入700μL缓冲液GP1充分研磨；
2.将研磨好的匀浆转移至1.5mL离心管中，65℃水浴20min，水浴过程中颠倒混匀数次。
3.加入700μL氯仿，剧烈振荡使其充分混匀，13523g离心5min；
4.取上清，然后加入700μL缓冲液GP2，充分混匀；
5.将上述混合液转入吸附柱CB3中，13523g离心30sec，弃滤液；
6.向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，13523g离心30sec，弃滤液；
7.向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，13523g离心30sec，弃滤液，重复一次；
8.将吸附柱CB3放回收集管中，13523g离心2min，倒掉滤液，然后将吸附柱CB3置于室温晾干；
9.将吸附柱CB3转入一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加100μL无菌水，室温静置2min，13523g离心2min，将DNA溶液收集到离心管；
电泳检测DNA的质量，合格后以此为模板进行PCR验证。
附录Ⅳ：可溶性糖含量测定
按照索莱宝植物可溶性糖含量检测试剂盒(BC0030)说明书进行操作(有删改)，具体步骤如下：
1.样品中可溶性糖的提取：称取约0.1～0.2g样本，加入1mL蒸馏水研磨成匀浆，倒入有盖离心管中，沸水浴10min(盖紧，以防止水分散失)，冷却后，8000g，常温离心10 min，取上清液于15mL离心管中，用蒸馏水定容至10mL，摇匀备用。
2.测定准备：a、分光光度计预热30min以上，调节波长至620nm，蒸馏水调零。b、调节水浴锅至95℃。c、工作液的配制：在试剂一中加入5mL试剂二，充分溶解后使用，如较难溶解，可加热搅拌。
3.按照加样表加好样混匀，盖紧管盖，置95℃水浴中10min，冷却至室温后，于620nm处，分别读取空白管和测定管吸光值，ΔA＝A测定管-A空白管。标准曲线的建立：620 nm处蒸馏水调零，读标准管吸光值，A＝A标准管-A空白管。以浓度(y)为纵坐标，吸光度A(x)为横坐标建立标准曲线。注意：a、空白管只要做一管。b、如果ΔA大于1，需要将样本用蒸馏水稀释，计算公式中乘以相应稀释倍数。c、.由于浓硫酸具有强腐蚀性，请谨慎操作。
可溶性糖含量计算：a、根据标准曲线，将ΔA带入公式中(x)计算样品浓度y(mg/mL)； b、按样本鲜重计算：可溶性糖(mg/g鲜重)＝(y×V1)÷(W×V1÷V2)＝10×y÷W。
<110> 甘肃农业大学
<120> NAC转录因子基因VaNAC08及其应用
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<210> 1
<211> 899
<212> DNA
<213>葡萄（Vitis vinifera）
<400> 1
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