同时检测tcr和hla基因分型的方法及应用

文档序号：336628 发布日期：2021-12-03 浏览：39次 >En<

阅读说明：本技术 同时检测tcr和hla基因分型的方法及应用 (Method for simultaneously detecting TCR and HLA genotyping and application ) 是由杨凡林莉娅张伟于 2021-08-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种同时检测TCR和HLA基因分型的方法及应用,属于基因检测技术领域。该方法包括以下步骤：样品提取：取待测生物样本,提取其中DNA；PCR扩增：取上述DNA,同时加入TCR扩增引物和HLA扩增引物,对TCR目标区域和HLA目标区域进行同时扩增,所述HLA目标区域为HLA基因的2,3,4号外显子区域；文库构建：取上述扩增产物,构建文库；上机测序：取上述文库,上机进行高通量测序；数据分析：对上述测序数据进行处理分析,获得TCR和HLA基因分型情况。采用上述方法可在不增加建库步骤的情况下,在同一PCR反应体系内的HLA引物组扩增HLA-I型基因进行分型鉴定,获取TRB信息的同时提供HLA的分型结果,从而获取免疫组库信息评估样本提供者的健康状态。(The invention relates to a method for simultaneously detecting TCR and HLA genotyping and application thereof, belonging to the technical field of gene detection. The method comprises the following steps: sample extraction: taking a biological sample to be detected, and extracting DNA in the biological sample; and (3) PCR amplification: taking the DNA, simultaneously adding a TCR amplification primer and an HLA amplification primer, and simultaneously amplifying a TCR target region and an HLA target region, wherein the HLA target region is an exon region 2,3 or 4 of an HLA gene; library construction: taking the amplification product to construct a library; and (3) machine sequencing: taking the library, and performing high-throughput sequencing on the library; and (3) data analysis: and processing and analyzing the sequencing data to obtain the TCR and HLA genotyping conditions. By adopting the method, the HLA primer group in the same PCR reaction system can amplify HLA-I type genes for typing identification without increasing the step of establishing the library, and the typing result of HLA is provided while TRB information is obtained, so that the health state of the immune repertoire information evaluation sample provider is obtained.)

同时检测TCR和HLA基因分型的方法及应用

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，特别是涉及一种同时检测TCR和HLA基因分型的方法及应用。

背景技术

T淋巴细胞表面受体(T Cell Receptor，TCR)是T细胞特异性识别和结合抗原肽-MHC分子的分子结构的异源二聚体，由两个不同的亚基所构成。95％～99％的T细胞受体由α亚基和β亚基构成，1％～5％由γ和δ亚基构成，该比例会随着个体的发育及身体的健康状态而产生变化。

TRB(T细胞受体β基因座，T Cell Receptor Beta Locus)是编码TCR分子中β肽链的基因座。TRB的CDR3由V(Variable)、D(Diversity)、J(Joining)和C(Constant)四个基因区域组成，每个区域中各包含有若干等位基因。在淋巴细胞成熟过程中的基因重排形成了各种重组序列片段，再加上DNA碱基的插入、突变，形成了T细胞的多样性。TCR中β链按等位排斥的方式优先于TCR的α链，能较好的反映T细胞TCR的特征。因此对于TRB多样性的研究具有非常重要的意义。TCR的α和β肽链各由可变区(Variable)，恒定区(Diversity)跨膜区和胞质区等。可变区由三个互补决定区(Complementarity Determining Region，CDR)CDR1、CDR2、CDR3组成，其中CDR3变异最大，直接决定了TCR的抗原结合特异性。

以T/B淋巴细胞表面受体为研究目标的免疫组库(Immune Repertoire)测序技术，可深入评价机体的免疫状态，探索人体免疫状态与疾病之间的关系。随着高通量测序的发展，使免疫组库等大规模测序分析得以实现。通过对T细胞中TRB的CDR3区域进行测序，可以获得与人类健康相关的TRB多样性等参数。

此外，人类白细胞抗原系统HLA(human leukocyte antigen,HLA)基因位于人类第6号染色体短臂，是人类基因组中多样性最高，且最重要的免疫遗传系统，是调控人体特异性免疫应答和决定疾病易感染性个体差异的主要基因系统。HLA的多样性决定了机体对感染性疾病、自身免疫性疾病、遗传病及各种肿瘤的抵抗能力。HLA系统在抗原识别、抗原递呈、免疫应答与调控、破坏外来抗原靶细胞等方面发挥重要作用，是引起免疫排斥反应的主要物质基础。

HLA基因分成三类：I类，II类和III类基因，其中I类包括：HLA-A,HLA-B,HLA-C基因。移植物细胞表面I类和II类抗原都是强移植抗原，体液免疫和细胞免疫都参与了对移植物的排斥反应，无论是异种基因器官，还是组织或细胞的移植，供受体间HLA相配是成功地关键。随着医学的发展，像白血病、地中海贫血等能用新的基因技术进行分型检测，再寻找合适的供体进行移植治疗。

目前通过HLA高分辨的分型，外周血干细胞移植技术能大大提高配型效果，供体和受体双方的HLA相关基因匹配程度越高，分别率越高，移植成功率也会增大，使患者的康复更快，更有保障。

此外HLA分型还能辅助诊断某些疾病，预防严重药品不良反应。现已发现有200多种疾病的发生与HLA相关，其中包括一些自身免疫疾病和感染类疾病，越来越多的研究发现HLA和癌症的易感性相关。

HLA的多样性与机体对感染性疾病、自身免疫性疾病、遗传病及各种肿瘤的抵抗能力有着密切的联系，因此HLA分型信息可供辅助诊断疾病，以及预防严重药品不良反应，成为了一项基本的疾病治疗和溯源配型的参考依据。

HLA分型方法包括血清学分型法、细胞学分型法和分子生物学分型法。随着分子生物学和DNA测序技术的发展，传统的血清学和细胞学分型法已逐步被分子生物学方法替代。目前，HLA分子分型方法主要有：聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)，聚合酶链式反应-序列特异性引物(PCR-SSP)，聚合酶链式反应单链构象多态性分析(PCR-SSCP)，聚合酶链式反应寡核苷酸探针杂交法(PCR-SSO)和测序分型(PCR-SBT)等。

其中血清学方法主要是通过HLA微量淋巴细胞毒实验方法来分析受试者的HLA型别，从全血或淋巴组织中分离出淋巴细胞，与HLA-特异性抗体包被的微孔板孵育，加入补体，使能与淋巴细胞表面HLA抗原结合的特异性抗体通过经典途径激活补体，导致靶细胞水解(淋巴细胞毒性)。该方法存在很多限制，例如在确定HLA特异性抗体需要大量的筛查工作，一些HLA抗原很难用血清学方法鉴定，HLA的交叉反应影响了分型结果的准确性，在进一步亚型的确定带来困难。

细胞学分型法主要是通过纯合分型细胞和致敏淋巴细胞实验检测，靓妆方法的基本原理均是判断淋巴细胞在识别非己HLA抗原决定簇后发生的增值反应。由于分型细胞来源困难及操作手段繁琐该方法正逐步淘汰。

PCR-FRLP(Restriction fragment length polymorphism)是指在限制酶性内切酶的作用下将DNA切成大小不同的片段，利用电泳迁移率的差异，经电泳分离、印迹、探针杂交等技术处理分析目的基因。

PCR-SSP(Sequence-specific primer)为设计一套等位基因组特异引物，通过PCR扩增得到的DNA片段，在电泳下过程中因分子量不同进行区别。

PCR-SSCP(Single strand conformational polymorphism)中，PCR产物经过变性成为DNA单链，用凝胶电泳分离，只有一个核苷酸发生变异，其电泳迁移发生干煸，因此可做为多态性分析。

PCR-SSO(Sequence specific oligonucleotide)使用人工合成的HLA型别特异的寡核苷酸序列作为探针与经过PCR扩增的HLA基因片段进行杂交，从而确定HLA型别。

PCR-SBT(Sequence based typing)为通过PCR获取HLA基因的目标序列，经过测序分析获得HLA型别结果，随着NGS的发展该方法是也被广泛的使用，并且也是目前世界卫生组织推荐的“金标准”。

在上述的技术方案中血清法和细胞法的操作繁琐已经逐步淘汰，PCR-FRLP、PCR-SSP以及PCR-SSCP均以凝胶电泳分离实验结果作为分型依据此过程中会带来较大的不确定性，对于HLA分型的准确性会有较大影响。因此在SBT方法上需要进一步的优化HLA引物通过第二代测序分析获得准确的分型结果。

另外，常规建库方案均是将TRB和HLA分开来建库，在测序结果中只能分析到其中一种结果，在需要HLA来辅助诊断的时候需要增加一步建库测序及分析，因此会造成时间的浪费和成本的提高。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种同时检测TCR和HLA基因分型的方法，使用该方法可以一次性获取TCR多样性以及HLA信息，结合HLA分型结果和TCR免疫状态，有利于全面评估，为后续辅助治疗提供更为精准到位的关键信息。

一种同时检测TCR和HLA基因分型的方法，包括以下步骤：

样品提取：取待测生物样本，提取其中DNA；

PCR扩增：取上述DNA，同时加入TCR扩增引物和HLA扩增引物，对TCR目标区域和HLA目标区域同时进行扩增，所述HLA目标区域为HLA基因的2，3，4号外显子区域；

文库构建：取上述扩增产物，构建文库；

上机测序：取上述文库，上机进行高通量测序；

数据分析：对上述测序数据进行处理分析，获得TCR和HLA基因分型情况。

本发明人在前期调研中发现，常规技术中虽也有单独针对TRB以及单独针对HLA的建库检测方案，但是，将TRB和HLA在同一反应中建库，面临较多困难，例如多重引物之间的相互影响，以及HLA对于A、B、C三种基因的覆盖度等问题。

在HLA分型研究中，HLA的全长为3.9kb左右，较为保守的内含子无分型的参考价值，主要以多样性丰富的外显子研究为主。HLA-I型外显子共有7个，在分型过程中主要以多样性最高的2,3,4号为主，因此以2,3,4号外显子作为分型基因具有更准确的参考价值。

在此基础上，本发明人通过反复摸索和尝试，将HLA基因的扩增引物设计为仅针对多样性最丰富的2，3，4号外显子区域，在不影响HLA分型的情况下减少了HLA基因的目标区域，缩短了HLA外显子的扩增长度，得以实现在免疫组库TRB文库测序中同时获取HLA型别信息。

在其中一个实施例中，所述PCR扩增步骤中，所述TCR目标区域为TRB中CDR3的V区域和J区域；

所述HLA目标区域为HLA-A基因2-4号外显子，HLA-B基因2-4号外显子和HLA-C基因2-4号外显子，且目标产物片段长度为200-500bp。

通过选定特定的TCR目标区域和HLA目标区域，并将HLA基因的目标产物大小控制在200bp-500bp(优选296bp-360bp)，进一步提高了多重PCR扩增效果，为后续进行高质量建库奠定了基础。

在其中一个实施例中，所述PCR扩增步骤中，所述TCR扩增引物包括SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.41所示序列；所述HLA扩增引物包括SEQ ID NO.42-SEQ ID NO.60所示序列。

本发明的引物设计必须包括几乎所有HLA型别的扩增，以适用于不同人的HLA型别确认；引物结合位点须避开非保守区域，最大可能的在A、B、C外显子上下游附近寻找合适的特异引物位点；由于使用PE150的读长设计，因此在扩增大于300bp的产物中未能通过测序获取序列的gap区域的多态性应当较少，才能提高HLA分型的分辨率。在此基础上，采用上述引物序列，能够达到较好的分型分辨率。

在其中一个实施例中，所述PCR扩增步骤中，所述TCR扩增引物按照以下比例使用：

所述HLA扩增引物按照以下比例使用：

考虑到各个外显子之间存在由样本个体的之间的差异以及HLA-I型外显子自身的丰度造成的差异，多重PCR中可能出现的扩增覆盖范围偏小等问题，可能导致后续分型所需数据不足或失真，本发明人经过反复实验对引物比例进行调整，经过引物比例的调整HLA各个外显子的有效数据已达到了可用做分型的数据量；已经成功解决了以上问题，且经测试在TRB建库的引物与HLA建库引物之间无相互影响，且HLA建库过程中A、B、C三种基因数据量得到了适当的分布，实现更广范围的覆盖以及多样性扩增体系的建立。

在其中一个实施例中，所述PCR扩增步骤中，所述TCR扩增引物与所述HLA扩增引物的总摩尔比为8-12:1。

在同一DNA测序文库中为了使TRB引物组获取数据量高于HLA且达到HLA分型数据量，达到更好的分型效果，可适当调整两组引物的比例，最终确定以8-12:1的比例可得到较为理想的数据占比。

在其中一个实施例中，所述PCR扩增步骤中，所述TCR扩增引物和所述HLA扩增引物的总浓度为0.3-0.5mM。

由于上述多重PCR反应体系中引物组中的不同引物数量较多，为了获得较为理想的PCR产物，反应体系中的引物量需提高至0.3-0.5mM，具有较好的扩增效果。

本发明还公开了上述的同时检测TCR和HLA基因分型的方法在制备用于TCR和HLA分型的试剂和/或设备中的应用。

本发明还公开了一种同时检测TCR和HLA基因分型的试剂盒，包括同时扩增TCR目标区域和HLA目标区域的TCR扩增引物和HLA扩增引物。

在其中一个实施例中，所述TCR目标区域为TRB中CDR3的V和J区域；所述HLA目标区域为HLA-A基因2-4号外显子，HLA-B基因2-4号外显子和HLA-C基因2-4号外显子。

本发明还公开了一种同时检测TCR和HLA基因分型的系统，包括：

检测装置，用于按照上述的方法进行检测，获得测序数据；

分析装置，用于获取上述测序数据进行分析处理，获得TCR和HLA基因分型情况；

输出装置，用于将所述TCR和HLA基因分型情况输出。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种同时检测TCR和HLA基因分型的方法，可在不增加建库步骤的情况下，通过在同一PCR反应体系内的HLA引物组扩增HLA-I型基因进行分型鉴定，在获取TRB信息的同时提供HLA的分型结果，可作为疾病溯源以及器官移植的信息参考等，从而获取免疫组库信息。

使用该方法可以一次性获取TCR多样性以及HLA信息，降低HLA的分型成本，结合HLA分型结果和TCR免疫状态中筛查此样本中的疾病来源，可更好的进行免疫检测评估，为后续辅助治疗提供更为精准到位的关键信息。

并且，本发明经过设计和实验验证，得到了两套在各自的目标区域互不影响的多重PCR引物组，可采用多重PCR的方法，在一个反应中实现多种不同的TRB以及HLA基因的扩增，快速富集建立TRB和HLA文库，使用NGS测序技术，分析样本中TRB的组成和HLA的分型，在揭示人体健康和疾病分析中具有重要的意义。

附图说明

图1为实施例1中技术路线图；

图2为实施例1中HLA-I型基因A、B、C各外显子引物比例调整前有效数据率统计图；

图3为实施例1中HLA-I型基因A、B、C各外显子引物比例调整后有效数据率统计图；

图4为实施例1中TRB引物比例调整前的偏好性差异图；

图5为实施例1中TRB引物比例调整后的偏好性差异图；

图6为实施例1中同一多重PCR反应下获得的HLA(上)和TRB(下)基因片段凝胶电泳图；

图7为实施例1中TRB基因的CDR3长度分布图；

图8为实施例1中TRB基因的CDR3丰度分布图；

图9为实施例1中CDR3频率分布图(左)Top10 CDR3频率分布图(右)；

图10为实施例1中TRB基因的V-J pairing三维分布图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

以下实施例所用试剂，如非特别说明，均为市售可得；以下实施例所用方法，如非特别说明，均为常规方法可实现。

实施例1

一种同时检测TCR和HLA基因分型的方法，技术路线流程如图1所示，包括以下步骤：

1、样本收集

使用EDTA管抽取外周血液5ml，上下颠倒管子数次，防止凝血。

2、样品提取

取血液2ml至EP管，使用血液DNA提取试剂盒(Hipure Blood DNAMidi Kit I，D312-02，Magen)并按照说明书操作，得到该样本的DNA，使用Q-bit定量，用作DNA文库构建。

3、PCR扩增

取上述DNA1.2μg，按照下表1比例，同时加入TCR扩增引物和HLA扩增引物，使用多重PCR的方法捕获和富集TCR VJ区域和HLA-A、B、C的2、3、4号外显子区域。

前期工作中，在此步骤中对引物投入量进行调整优化，以下机数据进行BWA比对，确定各内标序列引物比例调整前及调整后所占比例。图2-3分别为引物比例调整前TRB和HLA扩增分布示例，图4-5分别为引物比例调整后TRB和HLA扩增分布示例。

将扩增引物按照摩尔比均为1的方式等量投入，在多重PCR过程中存在较为严重的扩增偏差，如图2所示，图中横坐标分别为不同样本及不同基因(相同深浅度为同一样本，即各组数据由左至右依次为样本1-4)，纵坐标为各基因扩增后的有效数据占比，图3横坐标为分别为不同样本及不同基因，纵坐标为各基因扩增后的有效数据占比，从图2-3中可以看出，如按照等量投入的方式，存在较为严重的扩增偏差。

通过使用内标序列对引物体系进行不断的优化调整，按照下表1所示优化比例投入引物，最终使得绝大部分扩增偏差下降至一倍以内，如图4-5所示，更为精确的反应样本的真实分布情况。

表1.TRB引物组及调整比例

表2.HLA-I型A、B、C扩增引物组

由于此多重PCR反应体系中引物组中的不同引物数量较多，为了获得较为理想的PCR产物，经实验得出反应体系中的引物量需提高至0.4mM，按照下表3进行反应体系配置，震荡混匀，瞬时离心后置于PCR仪，按照下表4反应。

表3.多重PCR反应体系

表4.多重PCR反应体系

4、文库构建

取上述扩增产物，经过磁柱纯化回收，进行第二轮PCR，引入测序接头及文库标签的Index，PCR体系配置如下表5所示。

表5.文库添加接头反应体系

震荡混匀，瞬时离心后置于PCR仪，按照下表6条件运行。

表6.添加测序标签的PCR反应条件

反应完成后通过凝胶电泳检测，如图6所示，对于同一泳道中250bp-500bp出现明显不同明的多条条带样本进行磁珠纯化，即为上机测序文库。

5、上机测序

将以上构建的测序文库NGS平台上机(此处为Illumina,Novaseq6000)，测序类型为PE150。

6、数据分析

对上述测序数据进行免疫组库数据分析，使用IMonitor软件进行处理，分析流程可参考已发表文章(IMonitor:A Robust Pipeline for TCR and BCR RepertoireAnalysis."Genetics201(2015).DOI:10.1534/genetics.115.176735)。

其中，TRB分析处理方法如下：

将经过分析流程处理的测序数据，以健康人样本为例进行说明，数据使用IMonitor进行标准数据分析后部分图表结果展示，如图7-10所示，图7为CDR3长度分布示意图，图8为CDR3丰度分布，图9为CDR3频率分布示意图和Top10 CDR3频率分布示意图，图10为TRB V-J pairing三维分布示意图。再结合Reads插入片段分布，饱和曲线，CDR3 V(D)J基因长度分布，V(D)J基因deletion长度分布，V(D)J基因insertion长度分布，V(D)J基因高频突变率(碱基)分布，J基因usage分布，V基因usage分布等信息。可以反映出该样本的免疫组库TRB的多样性，评估该样本的免疫力情况。如图7-10所示样本数据为健康人血液，因此该样本的CDR3组成丰富，免疫组库TRB多样性较高。

HLA分析处理方法如下：

将HLA数据首先通过bwa软件把各个外显子的测定结果都定位在相应的参考序列上(参考序列来源IMGT/HLA数据库)并且构建各个数据库的同源性序列，在对数据库中的DNA进行筛选和测序错误的矫正，最后经过矫正的DNA序列和数据库中的比对结果并结合A、B、C基因每个2，3，4号外显子的频率信息，综合分析排名结果，即可得到该样本的HLA型别信息。

该示例样本之前通过基因组测序等技术获取到的HLA-A、B、C型别信息在此次实验中视为准确的目标型别，即已知型别(A*24:02:01，B*35:01:01以及C*03:03:01/C*03:04:01)作为对照，通过本发明中的TRB和HLA同一体系建库方法通过NGS测序获取DNA序列信息，HLA分型结果如下表7所示。

表7.示例样本分型结果

注：“READS”指测序得到reads数，“RATIO”指所有归类型别中的占比，“RANK(*Fre)”指分型排名(RATIO×亚洲人型别频率)，“EX2”指2号外显子reads数，“EX3”指3号外显子reads数，“EX4”指4号外显子reads数。

结果显示，使用bwa软件比对获取到该样本同源性最高的Top10的型别信息，列表中排名第一或第二的型别信息均与示例样本中的已知型别信息一致，因此可判断本发明的实验体系中HLA引物组可准确无偏号等的扩增该样本的HLA-A、B、C基因的2，3，4号外显子的目标区域且通过NGS测序获得HLA-I型基因序列信息，通过生物信息软件处理分析得到正确的HLA型别结果。

上述示例样本的分型结果结合TRB免疫组库信息在可健康状态和疾病分析以及同源移植等起到重要的参考作用。

实施例2

一种同时检测TCR和HLA基因分型的试剂盒，包括实施例1中的TCR扩增引物和HLA扩增引物。

实施例3

一种同时检测TCR和HLA基因分型的系统，包括：

检测装置，用于按照实施例1所述的方法进行检测，获得测序数据；

分析装置，用于获取上述测序数据进行分析处理，获得TCR和HLA基因分型情况；

输出装置，用于将所述TCR和HLA基因分型情况输出。

实施例4

同时检测TCR和HLA基因分型方法的验证。

选取通过全基因组测序检测，获得已知HLA基因分型的样本，按照实施例1的方法进行检测分型，与已知结果进行对比，结果如下表所示。

表8.验证对比试验

上述结果说明，通过本发明的同时检测TCR和HLA基因分型的方法，能够实现在同一反应体系内扩增TCR和HLA基因，采用同一测序文库对二者进行检测，且与HLA单独建库相比，其分型结果准确、可靠。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 深圳泛因医学有限公司

<120> 同时检测TCR和HLA基因分型的方法及应用

<160> 60

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA