一种可高效用于黏细菌原核转录组建库测序的方法
阅读说明：本技术 一种可高效用于黏细菌原核转录组建库测序的方法 (Method for efficiently sequencing viscobacteria prokaryotic transcriptome library ) 是由 董红红 朱红惠 董义杰 姚青 于 2021-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种可高效用于黏细菌原核转录组建库测序的方法。它包括样品准备、RNA提取、mRNA富集及片段化,将mRNA反转录第一链cDNA,再合成第二链cDNA、构建文库、上机测序和对数据进行分析,其特征在于,所述的将mRNA反转录第一链cDNA,其使用的逆转录酶是Uni Reverse Transcriptase逆转录酶。本发明通过实验的手段证明了利用耐高温的逆转录酶可以显著提升转录的效率,有效提升高GC含量细菌的原核转录组测序成功率。(The invention discloses a method for efficiently sequencing a myxobacteria prokaryotic transcriptome library. The method comprises the steps of sample preparation, RNA extraction, mRNA enrichment and fragmentation, reverse transcription of mRNA into first strand cDNA, synthesis of second strand cDNA, library construction, sequencing on a computer and data analysis, and is characterized in that the mRNA is reverse transcribed into the first strand cDNA, and reverse transcriptase is used)
技术领域
：本发明属于分子生物学及高通量测序领域，具体涉及一种能够用于黏细菌原核转录组建库测序的方法。
背景技术
：黏细菌是一类在土壤中广泛分布的、具有捕食特性的细菌类群，大多数黏细菌能够通过狼群式的(wolf-pack)群体运动行为对土壤中的真菌、细菌、小型藻类和原生动物等进行捕食。此外，黏细菌作为位于土壤微生物食物链顶端的捕食者，能够通过捕食作用调控土壤微生态平衡，被认为是一类具有多重生防特性的新型微生物类群。
通常认为，在有猎物存在的情况下，黏细菌的细胞以协同的方式运动，形成swarms，当swarms与猎物接触时，黏细菌可以侵入菌群内部并通过分泌胞外裂解因子，例如抗菌物质、次级代谢产物、胞外酶等，作为攻击的武器杀死和裂解猎物细胞，并能利用猎物细胞裂解后释放的蛋白作为营养供自身生长。由于黏细菌捕食行为的高度复杂性，目前对黏细菌捕食相关的研究主要是集中在行为特征的描述方面，已确定的黏细菌捕食因子只有前述的黏菌霉素A和外膜型水解酶GluM，不同的捕食体系中介导猎物细胞裂解的黏细菌捕食因子尚未被完全鉴定，而鉴定特定捕食体系中黏细菌的捕食因子，分析其作用方式，才是解析黏细菌捕食机制的关键。
通过组学分析可能鉴定出一些参与捕食的胞外裂解因子。采用转录组学分析手段在组学水平探讨“捕食者响应猎物”而启动的或提高表达的基因谱和分泌的捕食酶谱，可以全面快速的获取特定微生物在特定状态下的所有转录本信息，对mRNA的表达量和差异表达基因及其相应功能进行分析，揭示微生物不同表型形成的分子调控机制和功能。
到目前为止，利用原核转录组测序手段研究黏细菌发育过程及捕食机制的研究仅有5篇报道，其中黏细菌捕食细菌之后的转录组学研究仅1篇报道。而国内外还没有建立起一种有效的黏细菌捕食猎物细菌之后的混合样品的原核转录组建库测序方法。
发明内容
：为了克服现有的各大生物公司广泛采用的标准化原核转录组测序技术的缺陷，本发明所解决的技术问题在于提供一种可以高效实现黏细菌这类高GC含量的细菌原核转录组构建特定的链特异性cDNA文库的方法，利用本发明的方法可以构建高质量的测序文库，保证测序下机数据与参考基因组的高mapping率(90％以上)，所使用的耐高温的逆转录酶相比进口试剂成本低、效果优良，为今后开展黏细菌这类高GC含量的原核生物转录组测序提供了新的技术方法。
本发明通过实验发现利用目前国内各大生物公司的原核转录组测序标准流程对黏细菌进行转录组测序时普遍存在测序下机数据与参考基因组mapping率低的问题。对整个实验过程包括样品准备、RNA提取、去核糖体RNA富集mRNA和ncRNA、链特异性文库构建及上机测序等进行分析，发现样品准备和RNA提取过程不存在污染，测序过程中也没有污染。因此推测可能现有的建库不适合黏细菌这类高GC含量的细菌。
M-MuLV逆转录酶是从E.coli菌株提取出来，此菌株含有一个克隆有M-MuLV RT基因的质粒，M-MuLV基因被删去了RNAase H核心部分。M-MuLV Rtase是一个依赖RNA的DNA聚合酶，在引物存在的条件下，可以以单链的RNA或DNA为模板合成互补DNA链，它缺少RNAse H活性。MMuLV的主要特点是RNase H活性超低，cDNA得率高，是目前国内各大生物公司原核转录组建库过程中广泛使用的一款逆转录酶。
本发明的可高效用于黏细菌原核转录组建库测序的方法，其包括样品准备、RNA提取、mRNA富集及片段化，将mRNA反转录第一链cDNA，再合成第二链cDNA、构建文库、上机测序和对数据进行分析；所述的将mRNA反转录第一链cDNA，其使用的逆转录酶是Uni Reverse Transcriptase逆转录酶，
本发明中提及的Uni Reverse Transcriptase逆转录酶是北京全式金生物科技有限公司生产的一款耐高温的逆转录酶，相比国外进口的耐高温逆转录酶，使用该酶能够成功实现黏细菌这类高GC含量的原核生物的链特异性文库的构建，且能够极大降低实验成本。
进一步优选，第一链cDNA合成的最佳反应体系为：片段化的mRNA 500ng，Uni Reverse Transcriptase Enzyme Mix 1μL,0.1μg/μL Random Primer 1μL，2×TS-Uni Reaction Mix 10μL，RNase-free Water up to 20μL；最后的反应条件为25℃孵育10min后，52℃孵育30min，降温至10℃结束反应。
优选地，为了提高逆转录效率，先将片段化的mRNA、RNase-free Water与RandomPrimer混合，65℃反应5min后冰浴2min，再加入2×TS-Uni Reaction Mix和Uni Reverse Transcriptase Enzyme Mix，25℃孵育10min，52℃孵育30min，降温至10℃结束反应。
本发明的可高效用于黏细菌原核转录组测序的方法，可用于黏细菌捕食不同猎物细菌后的样品的链特异性文库的构建，提高了原核转录组测序结果的准确性和可靠性。本发明旨在实现对黏细菌这类高GC含量的原核生物成功进行转录组学测序分析，为从组学水平研究黏细菌的捕食机制奠定基础。
与现有技术相比，本发明的优点是：
本发明通过实验的手段证明了利用耐高温的逆转录酶可以显著提升转录的效率，有效提升高GC含量细菌的原核转录组测序成功率。本发明针对黏细菌这类具有捕食特性的新型微生物类群在进行转录组测序过程中出现的mapping率低这一现状，通过大量预实验，探索和优化构建链特异性文库过程中的逆转录酶和逆转录的温度，建立了能够对黏细菌及其捕食猎物细菌后的样品进行转录组学测序研究的技术方法，该方法具有成功率高、成本低等优点。
具体实施方式
为更好说明本发明的目的、技术方案和优点。下面结合具体实施对本发明进一步说明。应注意，以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：
本发明的用于黏细菌原核转录组建库测序的方法，包括以下步骤：
1、样品采集
收集在TPM寡营养平板(MgSO4·7H2O 1.97g/L，1M Tris-HCl pH 7.6 10mL/L，1MK2HPO4 1mL/L，琼脂15g/L，PH 7.2)上单独生长的黏细菌M.xanthus e-3-1和番茄青枯菌R.solanacearum RS04以及e-3-1捕食RS04的样品(仅收集捕食边界处的样品)，液氮速冻后置于-80℃冰箱用于后续实验。
2、样品RNA的提取和质控
用标准的Trizol法从收集的菌体中提取RNA，随后通过Agilent 2100bioanalyzer对RNA样品进行严格质控，精确检测RNA完整性及RNA总量。
3、mRNA的富集及片段化
提取到的RNA经检测合格后，通过去除Total RNA中的核糖体RNA(rRNA)，获得mRNA。
4、建库
用北京诺禾致源生物科技有限公司的标准原核转录组建库程序进行建库，具体步骤为：
合成第一链cDNA：以片段化的mRNA为模板，随机寡核苷酸为引物，在M-MuLV逆转录酶体系中合成第一链cDNA(以Uni Reverse Transcriptase替换M-MuLV逆转录酶作为实验组)，随后用RNaseH降解RNA链，并在DNA polymerase I体系下，以dNTPs为原料合成第二链cDNA，纯化后的cDNA进行末端修复、加A尾、连接测序接头，再用AMPure XPbeads筛选370-420bp左右的cDNA，然后先使用USER酶降解含U的cDNA第二链，进行PCR扩增并再次使用AMPure XP beads纯化PCR产物，最终获得文库。
所述的合成第一链cDNA(用Uni Reverse Transcriptase)的反应体系为：片段化的mRNA 500ng，Uni Reverse Transcriptase Enzyme Mix 1μL,0.1μg/μLRandom Primer 1μL，2×TS-Uni Reaction Mix 10μL，RNase-free Water up to 20μL；最后的反应条件为25℃孵育10min后，52℃孵育30min，降温至10℃结束反应。具体是先将片段化的mRNA、RNase-free Water与Random Primer混合，65℃反应5min后冰浴2min，再加入2×TS-Uni Reaction Mix和Uni Reverse Transcriptase Enzyme Mix，25℃孵育10min，52℃孵育30min，降温至10℃结束反应。
文库构建完成后，先使用Qubit2.0 Fluorometer进行初步定量，稀释文库至1.5ng/ul，随后使用Agilent 2100bioanalyzer对文库的insert size进行检测，insertsize符合预期后，qRT-PCR对文库有效浓度进行准确定量(文库有效浓度高于2nM)，以保证文库质量。
5、上机测序
库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina测序。
6、测序下机数据质控
测序片段被高通量测序仪测得的图像数据经CASAVA碱基识别转化为序列数据(reads)，通过去除待接头的reads、含N(N表示无法确定碱基信息)的reads及低质量reads(Qphred<＝20的碱基数占整个read长度的50％以上的reads)对测序得到的原始测序序列进行过滤获得cleanreads，进一步对测序错误率分布及GC含量进行分析。
7、参考基因组序列比对分析
用Bowtie2(Langmead,B.2012)软件将过滤后的测序列进行基因组定位分析。
表1为利用北京诺禾致源生物科技有限公司的标准原核转录组建库测序流程对黏细菌Myxococcus xanthus e-3-1捕食番茄青枯菌Ralstonia solanacearum RS04前后的样品进行建库测序后的样本与参考基因组的比对情况统计。
表2为将北京诺禾致源生物科技有限公司的标准原核转录组建库测序流程中链特异性文库构建中用于合成第一链cDNA的M-MuLV逆转录酶更换为本发明中的耐高温的逆转录酶Uni Reverse Transcriptase后，其他同原先的标准流程，对黏细菌Myxococcusxanthus e-3-1捕食番茄青枯菌Ralstonia solanacearum RS04前后的样品进行建库测序后的样本与参考基因组比对情况统计。
在相关实验不存在污染的情况下，用Uni Reverse Transcriptase逆转录酶合成第一链cDNA来构建链特异性文库，实验所产生的测序reads成功比对到基因组的比例均高于90％(Total Mapped Reads or Fragments)，解决了用传统的方法构建链特异性文库对黏细菌这类高GC含量的细菌进行转录组测序分析时的低mapping率的问题。
表1样本与参考基因组比对情况统计
表2样本与参考基因组比对情况统计
Total reads：测序序列经过测序数据过滤后的数量统计(Clean data)
Total mapped：能定位到基因组上的测序序列的数量的统计；一般情况下，如果不存在污染并且参考基因组选择合适的情况下，这部分数据的百分比大于70％
Multiple mapped：在参考序列上有多个比对位置的测序序列的数量统计；这部分数据的百分比一般会小于10％
Uniquely mapped：在参考序列上有唯一比对位置的测序序列的数量统计
Read-1：测序序列Read-1比对到基因组上的数量统计，Read-2含义与Read-1类似
positive_map,negative_map：测序序列比对到基因组上正链和负链的统计
Reads mapped in proper pairs,Proper-paired reads map to differentchrom：成对的测序序列比对到参考基因组和成对的测序序列对比到不同个染色体的统计。
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