一种自报告光敏剂及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种自报告光敏剂及其制备方法和应用 (Self-reporting photosensitizer and preparation method and application thereof ) 是由 严秀平 王东辉 于 2021-10-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种自报告光敏剂及其制备方法和应用,属于生物医学工程技术领域。本发明光敏剂在结构上包含一个扭曲的三苯胺(TPA)单元、三个苯环单元和三个氰乙烯基吡啶盐(PyA+)单元；制备方法简单,在水溶液中具有高单线态氧量子产率(124％),抗癌性能显著。同时,本发明光敏剂能够实现双色荧光的活细胞染色,并且发射颜色、强度和细胞内定位能在连续光照射下随着细胞死亡的程度同时变化,使TPA-3PyA+能够在原位实时监测光动力治疗过程。此外,在光动力治疗后,TPA-3PyA+仅能以绿色荧光点亮死细胞的细胞核,通过观察TPA-3PyA+的发光颜色变化可明显地区分活细胞和死细胞。(The invention discloses a self-reporting photosensitizer and a preparation method and application thereof, belonging to the technical field of biomedical engineering. The photosensitizer structurally comprises a twisted Triphenylamine (TPA) unit, three benzene ring units and three cyanovinylpyridine salt (PyA +) units; the preparation method is simple, the yield of singlet oxygen quanta in aqueous solution is high (124 percent), and the anticancer performance is obvious. Meanwhile, the photosensitizer can realize the living cell staining of double-color fluorescence, and the emission color, the emission intensity and the intracellular positioning can be simultaneously changed along with the death degree of cells under continuous light irradiation, so that the TPA-3PyA + can monitor the photodynamic therapy process in situ in real time. In addition, TPA-3PyA + can only light the cell nucleus of dead cells with green fluorescence after photodynamic therapy, and living cells and dead cells can be clearly distinguished by observing the change of the luminescent color of TPA-3PyA +.)
技术领域
本发明具体涉及一种自报告光敏剂及其制备方法和应用，属于生物医学工程技术领域。
背景技术
癌症是威胁人类生命的第二大致死性疾病，仅2020年全球将近有1000万人死于癌症。如今，精准诊疗一体化技术已经逐渐成为癌症治疗中最具吸引力的研究领域之一。光诊疗一体化技术是一种先进的无创性癌症诊疗一体化技术。该技术能在光的激发下同时展现出良好的早期诊断和治疗效果。其中成像引导的光动力疗法由于其非侵入性、可追溯性和低毒性而引起了大家的普遍关注。光动力疗法其基本组成要素为光源、光敏剂和氧气。当光敏剂被一定的光源激发后，能将周围的氧气转换为对癌细胞有毒性的活性氧物种(如单线态氧)而起到杀伤癌细胞的作用。然而，传统的该光疗技术无法实时反馈治疗效果，导致治疗延迟和过度治疗等问题。先进的成像引导的光动力疗法，采用自报告的光敏剂体系，同时具有强的产活性氧的能力和良好的发光性能。利用该模式不仅可以破坏癌细胞，还可以原位实时监测光动力治疗过程，从而显著降低因光照的高辐射强度和药物过量所引起的光毒性和其他副作用。
小分子化合物由于其明确的组成和良好的稳定性，是构建自报告光敏剂的理想选择。自报告光敏剂可以通过将光敏剂和荧光染料以对单线氧敏感的化学基团进行共轭连接形成共轭体并用于杀死癌细胞和实时监测光动力治疗过程。然而，该类光敏剂由于结构复杂和制备过程繁琐，不容易开发成为临床可用的药物。此外制备小分子自报告光敏剂也可无需引入荧光染料并能实现原位追踪细胞凋亡过程的能力。然而该类光敏剂只通过观察单发射光的变化来追踪细胞死亡过程，这种方式的功效会受光敏剂的浓度以及激发光光强度的干扰。
发明内容
技术问题：为了解决现有小分子自报告光敏剂因采用单发射光来追踪光动力治疗过程中所产生的问题，比如追踪治疗的可视化结果易受光敏剂浓度以及激发光光强度的影响，本发明制备了一种可发双色光的小分子自报告光敏剂。通过观察双色光在治疗过程中的动态变化(发光颜色和发光强度)，可避免单色光模式下影响结果的干扰因素，达到了比单色光模式下更有效的诊疗一体化效果。
技术方案：
本发明提供一种具有式(I)所示结构的小分子自报告光敏剂(TPA-3PyA+)：
在本发明的一种实施方式中，TPA-3PyA+在结构上包含一个扭曲的三苯胺(triphenylamine，TPA)单元(电子供体，D)、三个苯环单元(π桥)和三个氰乙烯基吡啶盐(cyanovinyl-pyridinium，PyA+)单元(电子受体，A)。
本发明还提供了一种制备上述光敏剂的方法，包括如下过程：
(1)利用三(4-醛基联苯基)胺(化合物1)与4-吡啶乙腈进行缩合反应，制得缩合产物三联苯胺三乙烯基氰基吡啶(化合物2)；
(2)利用三联苯胺三乙烯基氰基吡啶与碘甲烷发生吡啶的甲基化反应，最终获得式(I)所示的小分子自报告光敏剂；
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述缩合反应中，三(4-醛基联苯基)胺与4-吡啶乙腈的摩尔比为1：(3-6)；具体可选1：4.5。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述缩合反应是指有机溶剂中进行的；所述有机溶剂可选吡啶。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，三(4-醛基联苯基)胺相对有机溶剂的浓度为0.02-0.05mmol/mL；具体可选0.036mmol/mL。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述缩合反应还包括加入醋酸铵和冰醋酸。
在本发明的一种实施方式中，三(4-醛基联苯基)胺与醋酸铵的摩尔比为1：(1-2)；具体可选1:1。
在本发明的一种实施方式中，醋酸铵相对冰醋酸的用量条件为0.1-0.3mmol/mL；具体可选0.18mmol/mL。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述缩合反应的温度为室温(20-30℃)；时间为12-30h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述反应中，三联苯胺三乙烯基氰基吡啶与碘甲烷的摩尔比为1:(30-70)；具体可选1:55。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述反应是以丙酮作为溶剂进行的。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述反应中，三联苯胺三乙烯基氰基吡啶相对丙酮的浓度为2-5mmol/L；具体可选2.9mmol/L。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述反应的温度为55-70℃，时间为10-20h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述反应是在惰性气氛下进行的。具体可选氮气氛围下进行。
在本发明的一种实施方式中，化合物1可通过如下方法制备得到：
以三(4-溴苯基)胺、4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯甲醛作为底物，在四(三苯基膦)钯催化作用下发生偶联反应，制得偶联产物三(4-醛基联苯基)胺(化合物1)。
在本发明的一种实施方式中，所述偶联反应中，三(4-溴苯基)胺与4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯甲醛的摩尔比为1：(3-6)；具体可选1:3.6。
在本发明的一种实施方式中，所述偶联反应的温度为55-70℃，时间为20-30h。
在本发明的一种实施方式中，所述偶联反应是在惰性气氛下进行的。具体可选氮气氛围下进行。
在本发明的一种实施方式中，所述偶联反应是指溶剂环境下进行的；所述溶剂为四氢呋喃和水的混合体系。进一步的，四氢呋喃与水的体积比为(1-4)：1；具体可选3:1。
在本发明的一种实施方式中，所述偶联反应中，溶剂相对三(4-溴苯基)胺的用量为10-20mL/mmol；具体可选12mL/mmol。
在本发明的一种实施方式中，所述偶联反应中，还包括加入碱试剂，碱试剂选自如下任意一种或多种：碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯。
在本发明的一种实施方式中，所述偶联反应中，三(4-溴苯基)胺与碱试剂的摩尔比为1:(20-40)。具体可选1:30。
在本发明的一种实施方式中，光敏剂的制备步骤具体包括如下：
首先三(4-溴苯基)胺与4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯甲醛以及金属催化剂四(三苯基膦)钯混匀后，在氮气保护60℃下加热反应24小时，得到偶联产物三(4-醛基联苯基)胺；将该三(4-醛基联苯基)胺与4-吡啶乙腈混匀后，在室温下反应24小时，生成缩合产物三联苯胺三乙烯基氰基吡啶；最后将该三联苯胺三乙烯基氰基吡啶与碘甲烷混匀，在氮气保护60℃下反应12小时，发生吡啶的甲基化反应，最终获得本发明所描述的可发双色光的小分子自报告光敏剂。
本发明还提供了上述小分子自报告光敏剂在制备用于区分蛋白质与DNA的荧光探针中的应用。
本发明还提供了上述小分子自报告光敏剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供了上述小分子自报告光敏剂在制备用于实时监测细胞死亡的药物中的应用。
本发明还提供了上述小分子自报告光敏剂在制备用于区分细胞活性状态的药物中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述细胞活性状态包括活细胞、死细胞。
有益效果：
1.本发明自报告光敏剂TPA-3PyA+能够在动态的双颜色模式下同时实现光动力治疗和实时监测光诊疗过程。本发明自报告光敏剂具有高的单线态量子产率，以光敏剂孟加拉红为参照(水中单线氧量子产率为75％)，测得本发明光敏剂在水中的单线态氧量子产率为124％，可高效杀伤癌细胞。本发明光敏剂制备方法简单，抗癌性能显著，在精准癌症治疗领域具有一定的应用前景。
2.本发明自报告光敏剂在与蛋白质和DNA作用时能发射不同颜色的荧光，因此可作为一种检测和区分蛋白质和DNA的探针。
3.本发明光敏剂TPA-3PyA+除了能高效杀灭癌细胞之外，还能进入活细胞的细胞质并实现双色荧光的活细胞染色。此外，TPA-3PyA+的发射颜色、强度和细胞内定位能在连续光照射下随着细胞死亡的程度同时变化，使TPA-3PyA+能够在原位实时监测光动力治疗过程。更重要的是，在光动力治疗后，TPA-3PyA+仅能以绿色荧光点亮死细胞的细胞核，这表明通过观察TPA-3PyA+的发光颜色变化可以明显地区分活细胞和死细胞。TPA-3PyA+的这种独特的光学特性可以有效避免传统单色模式下通过观察荧光强度的变化来跟踪细胞死亡的干扰。本发明光敏剂可实现动态双颜色模式下的可视化实时追踪细胞死亡过程的功能，这种方法的可视化效果不受光敏剂浓度以及激发光光强度的影响。
4.本发明所制备的光敏剂在与活/死细胞结合后能发出不同颜色的荧光，因此通过简单观察本光敏剂的发光颜色便可实现对活/死细胞的鉴别。
附图说明
图1是小分子自报告光敏剂TPA-3PyA+的结构与性能示意图。
图2是光敏剂TPA-3PyA+的核磁共振氢谱。
图3是光敏剂TPA-3PyA+的核磁共振碳谱。
图4是光敏剂TPA-3PyA+的高分辨质谱。
图5是光敏剂TPA-3PyA+的水溶液中(含1％DMSO)加入不同浓度BSA(0、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275μg/mL)后的光致发光谱图。激发波长：488nm；TPA-3PyA+的浓度：20μmol/L。
图6是光敏剂TPA-3PyA+的水溶液中(含1％DMSO)加入不同浓度DNA(0、1、5、10、15、20、25、30、35、40μg/mL)后的光致发光谱图。激发波长：488nm；TPA-3PyA+的浓度：20μmol/L。
图(7a)是孵育不同浓度光敏剂TPA-3PyA+的HeLa细胞在黑暗条件下的细胞生存率；图(7b)是孵育不同浓度光敏剂TPA-3PyA+的HeLa细胞在不同光照条件下的细胞生存率；所用白光光源波长范围：400-800nm。
图8是光敏剂TPA-3PyA+与活HeLa细胞共培养后的双通道共聚焦成像图：图(8a)为近红外光通道成像图(采集波长范围：＞600nm)；图(8b)为绿光通道成像图(采集波长范围：500-600nm)；图(8c)明场图；图(8d)为图8a、8b和8c的成像重叠图；激发波长：488nm；TPA-3PyA+的浓度：40μmol/L；比例尺：15μm。
图9是孵育光敏剂TPA-3PyA+的HeLa细胞在连续光照射下的实时共聚焦成像图：图9a-e为不同光照时间点时近红外光通道处的细胞成像图；图9f-j为不同光照时间点时绿光通道处的细胞成像图；图9k-o为不同光照时间点时明场通道处的细胞成像图；激发波长：488nm；TPA-3PyA+的浓度：40μmol/L；比例尺：15μm。
图10是死的HeLa细胞被光敏剂TPA-3PyA+沾染后的共聚焦成像图：图10a为绿色通道成像图(采集波长范围：500-558nm)；图10b为近红外通道成像图(采集波长范围：＞600nm)图10c为明场通道成像图；图10d为图10a、10b和10c的成像重叠图；激发波长：488nm；TPA-3PyA+的浓度：40μmol/L；比例尺：15μm。
具体实施方式
实施例1：
光敏剂TPA-3PyA+的制备路线：
(1)化合物1的合成：
将三(4-溴苯基)胺(500mg,1.04mmol)，4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯甲醛(868mg,3.74mmol)，碳酸钾(4.30g,31.20mmol)，四氢呋喃/水(9mL/3mL)和四(三苯基膦)钯(109mg，0.094mmol)加入到35mL的耐压反应瓶中，液氮冷冻除氧后，在氮气保护60℃下反应24小时。反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去四氢呋喃后，依次用二氯甲烷和水洗，并用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得粗产物。柱层析(洗脱剂：石油醚/二氯甲烷＝1/10,v/v)分离得到黄绿色化合物1(530mg)，产率92％。
1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm)of Compound 1:δ10.05(s,3H,CHO),7.96(d,J＝8.4Hz,6H,ArH),7.76(d,J＝8Hz,6H,ArH),7.61(d,J＝8.8Hz,6H,ArH),7.28(d,J＝8.4Hz,6H,ArH).
(2)化合物2的合成：
将化合物1(0.20g,0.36mmol)，4-吡啶乙腈(0.19g,1.62mmol)，醋酸铵(0.028g,0.36mmol)，2mL冰醋酸和10mL吡啶加入到50mL圆底烧瓶中，室温下搅拌反应24小时。反应结束后，往体系中加水，析出橘红色固体。抽滤并用水洗后收集粗产物。柱层析(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝45/1,v/v)分离得到橘红色化合物2(0.27g)，产率87％。
1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ8.72(dd,J＝1.6Hz,J＝4.8Hz,6H,ArH),8.05(d,J＝8.4Hz,6H,ArH),7.76(s,3H,CH),7.75(d,J＝8.0Hz,6H,ArH),7.63(d,J＝8.4Hz,6H,ArH),7.60(dd,J＝1.6Hz,J＝4.4Hz,6H,ArH),7.30(d,J＝8.8Hz,6H,ArH).13C NMR(100MHz,CDCl3,ppm):δ150.6,147.4,144.6,143.6,142.0,134.4,131.5,130.6,128.2,127.2,124.7,119.9,117.2,108.5.HRMS(ESI):m/z for C60H40N7 +([M+H]+):calc.858.3340；found858.3401.
(3)化合物TPA-3PyA+的合成：
将化合物2(0.050g,0.058mmol)，碘甲烷(0.2mL，3.2mmol)和丙酮(20mL)加入到50mL圆底烧瓶中，在氮气保护60℃下反应12小时。反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去丙酮，将粗产物依次用乙酸乙酯和甲醇洗涤，抽滤得紫黑色产物TPA-3PyA+(0.070g)，产率94％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)(如图2所示):δ9.06(d,J＝6.8Hz,6H,ArH),8.77(s,3H,CH),8.44(d,J＝6.8Hz,6H,ArH),8.23(d,J＝8.4Hz,6H,ArH),8.03(d,J＝8.4Hz,6H,ArH),7.89(d,J＝8.8Hz,6H,ArH),7.28(d,J＝8.4Hz,6H,ArH),4.35(s,9H,CH3).13C NMR(100MHz,DMSO-d6,ppm)(如图3所示):δ151.0,149.0,147.0,145.8,143.7,133.3,131.5,131.1,128.4,126.9,124.5,123.1,116.5,104.5,47.4.HRMS(ESI)(如图4所示):m/z forC63H48N7 3+([M]3+):calc.300.7985；found 300.7984.
实施例2：TPA-3PyA+作为区分蛋白质与DNA的荧光探针
该光敏剂TPA-3PyA+在结构上由一个扭曲的三苯胺单元(电子供体，D)、三个苯环单元(π桥)和三个氰乙烯基吡啶盐单元(电子受体，A)构成，具有扭曲的D–π–A结构。分子中包括一个扭曲的D-π-A体系，可赋予分子扭曲的分子内电荷转移效应。该效应能使分子在不同的介质中具有灵活的发射行为，例如产生不同的发射颜色和强度。另外阳离子吡啶基团能使TPA-3PyA+与带负电的生物大分子(如蛋白质或DNA)进行相互作用。本光敏剂在水溶液中几乎无荧光，当体系中不断加入蛋白质(以牛血清白蛋白BSA为例)时，在734nm处的近红外光不断增强(如图5所示)。而当体系中不断加入DNA(以小牛胸腺DNA为例)时，在547nm处的绿色荧光不断增强(如图6所示)。因此，本光敏剂可作为区分蛋白质和DNA的荧光探针。
实施例3：光敏剂(TPA-3PyA+)作为抗癌药
该光敏剂TPA-3PyA+在结构上由一个扭曲的三苯胺单元(电子供体，D)、三个苯环单元(π桥)和三个氰乙烯基吡啶盐单元(电子受体，A)构成，具有扭曲的D–π–A结构。D-π-A结构能使分子具有小的单线态-三线态能隙，有利于单线态氧的产生。以光敏剂孟加拉红为参照(水中单线氧量子产率为75％)，测得本光敏剂在水中具有高的单线态氧量子产率(124％)。
基于此，在考察本光敏剂对癌细胞的杀伤效果之前，首先考察本光敏剂的生物相容性(如图7a所示)。通过经典的MTT试验发现，当癌细胞与不同浓度的本光敏剂(0μmol/L，10μmol/L，20μmol/L，30μmol/L，40μmol/L)在暗处共培养24小时之后，细胞均保持高的存活率(大于90％)，说明本光敏剂具有良好的生物相容性。而当本光敏剂与癌细胞共培养8小时，并给予30分钟不同强度的白光照射后(白光波长范围：400-800nm；强度：50mW/cm2，70mW/cm2，90mW/cm2)，细胞生存率随着光敏剂浓度以及光照强度的增加而不断降低(如图7b所示)，说明本光敏剂具有好的抗癌作用，有望作为一种有效的光动力抗癌药物。
实施例4：光敏剂(TPA-3PyA+)作为实时监测细胞死亡的药物
在进行共聚焦细胞成像时，本光敏剂主要进入细胞的细胞质并能产生双色荧光(绿色光和近红外光)(如图8所示)。而在连续的蓝色激光照射下(波长：488nm)，细胞形态发生改变，逐渐失去完整性，同时由光敏剂产生的近红外光逐渐减弱，而绿色荧光不断增强，且光敏剂在细胞中的定位从最初的细胞质逐渐转移至细胞核，并最终点亮细胞核(如图9所示)。以上说明本光敏剂不但能够在光照条件下有效杀灭癌细胞，并能通过观察双颜色荧光的颜色变化、强度变化以及细胞内定位变化，实现对细胞死亡的实时追踪。
实施例5：光敏剂(TPA-3PyA+)作为区分活/死细胞的药物
本光敏剂能够有效沾染活细胞并产生双色荧光(绿光和近红外光)，而对死细胞沾染时只产生绿色荧光(如图10所示)，因此本发明光敏剂可作为一种区分活/死细胞的探针。
对比例1现有报道过的其他不同D-π-A型光敏剂的对比
对比现有报道的其他不同结构的光敏剂，结果如下表所示。
表1不同D-π-A型的光敏剂的性能对比结果
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