一种从红刀豆中提取脲酶的方法
阅读说明：本技术 一种从红刀豆中提取脲酶的方法 (Method for extracting urease from red sword beans ) 是由 李婷婷 朱海 贾玮玮 于 2021-11-10 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物蛋白提取技术领域,具体涉及一种从红刀豆中提取脲酶的方法,方法包括如下步骤：称取红刀豆研磨成粉,筛分后加入提取液,将红刀豆粉末和提取液充分搅拌,在室温下离心,收集上清液A,上清液A滤纸抽滤,得到上清液B；在上清液B加入60％PEG4000,在4℃温度下静置,离心,收集沉淀；将沉淀加入重悬液,重悬溶解后离心,收集上清并抽滤,得到溶液A；先用HCl将溶液A调为pH＝5.1,再用NaOH将溶液调为pH＝6.0,得到溶液B；将溶液B加入至柠檬酸-柠檬酸钠中进行透析,在4℃温度下静置,离心,抽滤,收集上清,冻干。本发明制备流程简单,不需要在提取剂中添加丙酮溶液,反应温和,最终可得到蛋白浓度较高的脲酶。(The invention belongs to the technical field of biological protein extraction, and particularly relates to a method for extracting urease from red sword beans, which comprises the following steps: weighing semen Canavaliae, grinding into powder, sieving, adding extractive solution, stirring, centrifuging at room temperature, collecting supernatant A, and vacuum filtering with filter paper to obtain supernatant B; adding 60% PEG4000 into the supernatant B, standing at 4 deg.C, centrifuging, and collecting precipitate; adding the precipitate into a resuspension solution, carrying out centrifugation after resuspension and dissolution, collecting a supernatant, and carrying out suction filtration to obtain a solution A; adjusting the pH of the solution A to 5.1 by using HCl, and adjusting the pH of the solution to 6.0 by using NaOH to obtain a solution B; adding the solution B into citric acid-sodium citrate, dialyzing, standing at 4 deg.C, centrifuging, vacuum filtering, collecting supernatant, and lyophilizing. The preparation method has simple preparation flow, does not need to add acetone solution into the extractant, has mild reaction, and can finally obtain the urease with higher protein concentration.)
技术领域
本发明属于生物蛋白提取技术领域，具体涉及一种从红刀豆中提取脲酶的方法。
背景技术
脲酶是一种十分重要的生物制剂，广泛分布于植物的种子中，以大豆和刀豆中的含量最高。脲酶是一种寡聚酶，可以催化尿素水解释放氨和二氧化碳，催化效率比无脲酶存在下的速率高出1000多倍，脲酶被广泛的应用于农业，医药行业等领域：在韩国，它被用于治疗呕吐、腹部浮肿、肾脏相关腰痛，在日本，它对治疗脓溢、中耳炎、疖子和癌症、各种炎症性疾病和特应性皮炎有效，在中国，脲酶被用于处理动物排泄物，防止空气污染，同时脲酶还可以处理含有尿素的废水，符合了中国当今绿色化学的要求。随着我国经济发展，固定化脲酶技术的进步，对脲酶的需求越来越大。
我国的豆类资源十分丰富，而目前国内针对脲酶提取的研究报告主要集中在大豆，黄豆等植物中提取和纯化，崔有宏等人在“黄豆脲酶的提取与性质研究”一文中采用醋酸盐缓冲液对黄豆粉进行提取，然后通过亚硫酸钠盐析，其沉淀再经磷酸盐缓冲液溶解，透析，DEAE-纤维素柱色谱分离，洗脱液冷冻干燥后得到脲酶产品。但是该工艺流程复杂，脲酶损失严重，成本较高。Hsien-Yi Sung等人在“A Procedure for Purifying Jack BeanUrease for Clinical Use”中提到了一种纯化尿素酶的方法，采用20％丙酮(含1mM EDTA和1mM巯基乙醇)进行提取，离心，清液调节丙酮浓度至31-35％，然后再经氢氧化钠碱化，再40℃热处理5min，离心，清液用柠檬酸调节至等电点附近，离心收集沉淀，再用磷酸盐缓冲液中和后冷冻干燥即可得脲酶。该方法虽然可以得到纯度较高的蛋白，但是使用了丙酮危险试剂，且实验过程危险。
红刀豆脲酶对比洋豆类脲酶丙酮提取来说，其原材料红刀豆易获得，红刀豆主要分布在中国的南部且产量十分丰富，且实验过程不需要丙酮危险试剂，对比大豆，黄豆脲酶提取来说，提取红刀豆脲酶的优势在于过程路线简单，提取的脲酶纯度较高。目前以红刀豆为原料的提取技术研究较少，使用该种方法提取脲酶，原料、提取试剂易获得，提取的脲酶纯度高，具有工业化生产的前景。
发明内容
本发明的目的在于克服传统技术中存在的上述问题，提供一种从红刀豆中提取脲酶的方法，该方法工艺流程简单，操作时间短，条件温和，无需使用危险试剂，得到的脲酶纯度超过80％，活性好且回收率高，具有稳定的工业前景。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：
一种从红刀豆中提取脲酶的方法，包括如下步骤：
1)提取：称取红刀豆研磨成粉，筛分后加入提取液，28℃下将红刀豆粉末和提取液充分搅拌，使得红刀豆粉末中脲酶全部浸提，然后将浸提液在室温下离心，收集上清液A，上清液A滤纸抽滤，得到上清液B；
2)粗沉淀：在得到的上清液B加入60％PEG4000，在4℃温度下静置，离心，收集沉淀；
3)重悬：将得到的沉淀加入重悬液，重悬溶解后离心，收集上清并抽滤，得到溶液A；
4)调整pH值：先用HCl将得到的溶液A调为pH＝5.1，离心，收集上清，再用NaOH将溶液调为pH＝6.0，得到溶液B；
5)冻干：将得到的溶液B加入至柠檬酸-柠檬酸钠中进行透析，在4℃温度下静置，离心，抽滤，收集上清，冻干。
进一步地，如上所述从红刀豆中提取脲酶的方法，步骤1)中，提取液是50mM柠檬酸-柠檬酸钠+3％PEG4000溶液，红刀豆粉末和提取液按照150-250g:1L的料液比进行混合。
进一步地，如上所述从红刀豆中提取脲酶的方法，步骤1)中，红刀豆研磨成粉后，用振动筛进行筛分，以除去颗粒度较大的不溶性杂质，红刀豆粉末和提取液采用磁力搅拌，搅拌时间为20-40min；离心转速为9000-10000rpm，离心时间为8-12min。
进一步地，如上所述从红刀豆中提取脲酶的方法，步骤2)中，60％PEG4000溶液采用滴加方式缓慢加入，终浓度为10％。
进一步地，如上所述从红刀豆中提取脲酶的方法，步骤2)中，离心温度为3-5℃，离心转速为9000-10000rpm，离心时间为18-22min。
进一步地，如上所述从红刀豆中提取脲酶的方法，步骤3)中，重悬液的成分为50mM柠檬酸-柠檬酸钠、5mg/ml甘氨酸、5mg/ml葡萄糖、30mg/ml山梨醇。
进一步地，如上所述从红刀豆中提取脲酶的方法，步骤3)中，离心温度为7-9℃，离心转速为9000-10000rpm，离心时间为25-35min。
进一步地，如上所述从红刀豆中提取脲酶的方法，步骤4)中，先用10％的HCl将得到的溶液A调为pH＝5.1，离心，收集上清，在用6MNaOH将溶液调为pH＝6.0，得到溶液B。
进一步地，如上所述从红刀豆中提取脲酶的方法，步骤4)中，离心温度为16-20℃，离心转速为9000-10000rpm，离心时间为25-35min。
进一步地，如上所述从红刀豆中提取脲酶的方法，步骤5)中，使用10mM柠檬酸钠进行透析，透析完后离心，离心条件为4℃、9500rpm，30min；上清使用0.45μM滤膜抽滤，抽滤后液体进行冷冻干燥。
本发明的有益效果是：
1、本发明采用红刀豆为原料，红刀豆主产地在中国，原料易获得，以柠檬酸-柠檬酸钠作为缓冲溶液体系，其缓冲能力强，且不影响蛋白质活性，能够保持蛋白质结构稳定。整个工艺流程步骤较少，耗时时间较短，且不需要在提取剂中添加丙酮溶液，反应温和，经过聚乙二醇沉淀、等电点沉淀，使得大部分的杂蛋白被析出，最终得到蛋白浓度为80％的脲酶。
2、本发明方法操作简单，工艺流程短，能耗低，反应温和，解决了反应时间和反应危险的问题，提取过程中采取了常规的固液分离方式，是一种具有工业应用价值的提取方法。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上的所有优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明方法的工艺流程图；
图2为本发明实施例红刀豆脲酶的SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
一种从红刀豆中提取脲酶的方法，包括如下步骤：
1)提取：称取红刀豆研磨成粉，筛分后加入提取液，28℃下将红刀豆粉末和提取液充分搅拌，使得红刀豆粉末中脲酶全部浸提，然后将浸提液在室温下离心，收集上清液A，上清液A滤纸抽滤，得到上清液B；
2)粗沉淀：在得到的上清液B加入60％PEG4000，在4℃温度下静置，离心，收集沉淀；
3)重悬：将得到的沉淀加入重悬液，重悬溶解后离心，收集上清并抽滤，得到溶液A；
4)调整pH值：先用HCl将得到的溶液A调为pH＝5.1，离心，收集上清，再用NaOH将溶液调为pH＝6.0，得到溶液B；
5)冻干：将得到的溶液B加入至柠檬酸-柠檬酸钠中进行透析，在4℃温度下静置，离心，抽滤，收集上清，冻干。
本发明的具体实施例如下：
实施例1
称量500g红刀豆，磨粉并过80目筛3次，得到粗豆粉51.27g及细豆粉440.54g用振动筛进行筛分，以除去颗粒度较大的不溶性杂质，称量300g细刀豆粉倒入2L烧杯中，并加入1.5L的试剂(50mM柠檬酸-柠檬酸钠pH6.0+3％PEG4000)，玻璃棒搅拌均匀后，室温下将红刀豆粉末和提取液采用磁力搅拌，充分混合，搅拌时长为30min，使红刀豆粉末中脲酶全部浸提，然后将浸提液在室温下9500rpm离心15min，收集上清液A，发现溶液有浑浊，使用滤纸抽滤，得1200ml上清液B。
在抽滤完的上清液B中加入120ml 60％PEG4000，使其在溶液中的终浓度为10％，放入搅拌子搅拌10min，混匀后4℃静置1h。将静置后溶液搅拌均匀后，4℃、9500rpm离心20min，收集沉淀(此步骤一定要控干上清，以免影响后续溶解)。
在沉淀中加入200ml 50mM柠檬酸-柠檬酸钠pH6.0(添加5mg/ml甘氨酸，5mg/ml葡萄糖，30mg/ml山梨醇)进行重悬。重悬至完全溶解后，18℃、9500rpm离心1h，收集上清，用0.45μm的滤膜进行抽滤，抽滤后收集上清。
加入9.5ml的10％HCl将上清液调pH＝5.1。在8℃、9500rpm，离心30min，此时杂蛋白在沉淀中，脲酶全部在上清液里。再使用1.3ml6M NaOH将溶液调为pH＝6.0。
透析溶液为10mM柠檬酸钠pH 6.0进行透析，透析2遍，每遍1.5h。透析完后，4℃、9500rpm，30min离心，上清使用0.45μM滤膜抽滤，抽滤后液体放入-80℃冰箱冷冻，上清液冷冻好后，然后放入真空冷冻干燥机上层进行烘干(此过程需尽快，防止样品融化)，得到6.2g的蛋白样品。
实施例2
以实施例得到的蛋白样品作为实验对象。
酶活测定：冻干样品制成10mg/ml的水溶液，精密量溶液30μl试管中，置于干式恒温仪中37℃2min，取125mM尿素120μl反应6min，待反应结束后，加入100ul显色剂1(1％苯酚、0.02％亚硝基亚铁氯化钠)，1min中内加入100ul显色剂2(0.6％氢氧化钠、0.6％次氯酸钠溶液)，立即手动摇匀，置干式恒温器中加盖37℃使用计时器计时反应20min，取200ul放入96孔板中，全自动酶标仪中以波长595nm，测量其吸光度。
根据如下公式计算：
得脲酶活力为37.54，符合脲酶活力标准(≥15U)。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。