具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

本发明所述的所有试剂并不仅限于液体形式，只要能够实现相应功能均可。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

本发明中携带修饰的小RNA的建库方法也称为APR-seq或APR。

如图1a所示，本申请一实施例提供的携带修饰的小RNA的建库方法，至少包括如下步骤：

1)利用去甲基化试剂去除携带修饰的小RNA的甲基化修饰；

2)利用第一转化剂使携带修饰的小RNA的5’端的5’-OH转化为5’P，3’P端转化为3’-OH；

3)利用第二转化剂使携带修饰的小RNA的5’端的5-cap转化为5’P；

4)将携带修饰的小RNA上连接测序接头；

5)利用包括逆转录酶在内的逆转录试剂将携带修饰的小RNA反转录成cDNA；

6)将cDNA纯化后进行PCR扩增，获得携带修饰的小RNA的测序文库。

进一步的，所述甲基化修饰是指m1A、m1G、m3C的一类甲基化修饰。

所述携带修饰的小RNA是指所述小RNA所携带的修饰基因选自m1A、m1G、m3C及5’-OH、3’-P、5’-cap中的一种或多种。携带此类修饰的小RNA用本发明所述方法进行建库测序其检测效率会显著提高。

可选的，所述携带修饰的小RNA为末端及内部携带修饰的小RNA。

所述携带修饰的小RNA的核苷酸长度为15-40nt。

进一步的，步骤1)中，所述甲基化修饰包括N1-甲基腺苷(m1A)，N3-甲基胞嘧啶(m3C)和N1-甲基鸟苷(m1G)甲基化修饰。克服了甲基化在反转录过程中的阻碍。

在一种实施方式中，步骤1)中，所述去甲基化试剂选自大肠杆菌衍生的AlkB及其D135S突变株的混合物。

Alkb和Alkb D135S突变株的筛选方法可参考Zheng,G.et al.Efficient andquantitative high-throughput tRNA sequencing.Nat Methods 12,835-837,doi:10.1038/nmeth.3478(2015).

步骤2)和步骤3)有利于末端接头的有效连接。

进一步的，步骤2)中，所述第一转化剂能够将小RNA3端的3’-P或2’，3’-cP去磷酸化基团以转化为3’-OH及5’端的5’-OH转化为5’P。

在一种实施方式中，步骤2)中，所述第一转化剂选自T4多核苷酸激酶(T4PNK)。

在一种实施方式中，步骤3)中，所述第二转化剂选自RNA5'焦磷酸水解酶。(RppH)。

其中，T4PNK能够将5'-OH转化为5'-P，RppH能够将RNA 5'-cap转化为5'-P。

进一步的，步骤4)中，所述测序接头中包含UMI片段。UMI的使用很大程度降低了由于PCR扩增而导致的序列丰度的偏好性，进而使得数据分析更加真实可靠。

在一种优选的实施方式中，所述UMI片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示，具体的：

5'-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC(N:25:25:25:25:25:25)(N)(N)(N)(N)(N)(N)-3'；(SEQ ID NO：1)

此序列为5端接头，其中(N)(N)(N)(N)(N)(N)代表UMI(N＝A U C G等比例)。

5'-P-(N:25:25:25:25:25:25:25:25:25)(N)(N)(N)(N)(N)(N)(N)(N)(N)AGATCGGAAGAGCACACGTC-3ddC-3'；(SEQ ID NO：2)

此序列为3端接头，其中(N)(N)(N)(N)(N)(N)(N)(N)(N)代表UMI(N＝A T C G等比例)。

进一步的，步骤5)中，所述逆转录酶选自热稳定的II类内含子逆转录酶(TGIRT)。用热稳定的II类内含子逆转录酶(TGIRT)来替代传统的反转录酶(AMV或MMLV来源的反转录酶)，在结构复杂和重修饰RNA的逆转录过程中具有优越的持续性和保真度。

前述的携带修饰的小RNA的建库方法可以用于基因测序领域。

实施例1

以在人胚胎肾细胞系HEK293T细胞中的分析为例：

APR组：

步骤1)用mirVana miRNA Isolation(Life Technologies)试剂盒将小RNA进行分离纯化，

步骤2)取2ug小RNA与去甲基化酶AlkB和AlkB(D135S)混合物在去甲基化酶反应缓冲液(300mM KCl,2mM MgCl2,50μM of(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O,300μM 2-ketoglutarate(2-KG),2mM l-ascorbic acid,50/ml BSA,50mM MES buffer，pH [email protected]℃)及RNase抑制剂条件下37℃孵育2小时充分去除相应甲基化修饰；

步骤3)往反应体系中加入5mM EDTA终止该酶促反应并用酚氯仿和乙醇对RNA进行纯化；

步骤4)纯化后的RNA用20U T4PNK(NEB)在其反应缓冲液及1mM ATP(NEB牌)条件下37℃孵育90分钟对小RNA末端进行修复并用酚氯仿和乙醇对RNA进行纯化；反应缓冲液的成分如下：(70mM Tris-HCl，10mM MgCl2，5mM DTT，pH [email protected]℃)

步骤5)用RppH(NEB)在Thermopol Buffer(NEB)反应缓冲液中37℃孵育2小时将RNA 5'-cap的焦磷酸键水解产生末端为5'-P的RNA；

步骤6)用酚氯仿和乙醇对RNA进行纯化。

步骤7)以上三步酶促反应后纯化的RNA，用T4 RNA ligase 2 truncated KQ(NEB)和T4 RNA Ligase 1(NEB)分别连接包含UMI的3′接头和5′接头；

步骤8)用200units TGIRT-III在NaCl、dNTPs、二硫苏糖醇、RNase抑制剂混合条件下57℃孵育2h进行反转录；

步骤9)RNA在含8M尿素15％的聚丙烯酰胺变性胶中进行跑胶分离并对相应RNA 15至50nt区间进行切胶纯化；

步骤10)配制NEBNext Ultra II Q5Master Mix、SR Primer、Index(13-24)Primer及补充nuclease-free水至终体积50μL的反应体系在98℃10s、61℃30s及72℃延伸15s的条件下进行15轮PCR扩增。PCR产物在6％的聚丙烯酰胺胶中进行电泳并将140bp至200bp区间大小的片段进行切胶纯化；

步骤11)进行Illumina HiSeq X10paired-end 2x 150bp测序。

步骤12)Illumina测序后用Bowtie(1.0.0)对小RNA种类进行注释、不同酶处理差异性分析等相关生物信息学分析。

AlKB mix RppH组：与APR组的区别在于，不包括步骤4)，其余皆相同；

AlKB mix T4PNK组：与APR组的区别在于，不包括步骤5)和步骤6)，其余皆相同；

AlKB mix组：与APR组的区别在于，不包括步骤4)、步骤5)和步骤6)，其余皆相同；

Untreated组：与APR组的区别在于，不包括步骤2)-步骤6)，其余皆相同；

NEBNext组：根据根据NEB公司生产的NEBNext Multiplex Small RNA LibraryPrep Set for Illumina试剂盒中的说明书进行建库。

如图1b所示，结果表明不同的建库方法对各种小RNA的捕获能力不同。miRNA的比例从20.7％(NEBNext标准小RNA-seq)显著下降到0.15％(APR-seq)。这是由于从其他小RNAs(如tRNAs和snRNAs等衍生的小RNAs)的检测显著增加所导致的。这表明本发明的APR-seq方法能够检测到更加丰富的之前未被捕获的小RNAs。

由于tRNA及其来源的小RNA具有丰富的甲基化修饰，为了评估APR-seq对携带甲基化修饰的小RNA的检测性能，本发明在此集中分析tRNA来源的小RNA。如图1所示，得益于TGIRT优越的持续性和保真度，与传统的NEBNext-seq方法相比，TGIRT处理组读取到的tRNA来源的小RNA比例从4.52％上升至15.19％，AlkB及其D135S突变体的混合物处理进一步将比例增加到48.73％。如图2中的a图所示，AlkB及其D135S突变体的混合物处理显著增加了tRNA 3’-fragment的检测。T4PNK处理则进一步促进了tRNA 5’-fragment的检测。RppH处理对tRNAs的测序没有明显的影响，这与tRNAs缺乏5-cap结构有关；从图2中的b图中，我们可以看到APR-seq方法可以对携带m1A，m1G和m3C的tRNA片段进行有效的检测；图2中的c图中，可以观察到T4-PNK处理对由ANG加工产生的3'-P或5'-OH的tRNA halves的检测也显著增加。

本发明发现用NEBNext标准方法无法检测到snRNAs来源的小RNAs(图3a)。当使用更为高效的逆转录酶TGIRT时，TGIRT处理组读取到的snRNAs来源的小RNAs显著增加，但是如图3a中所示，snRNAs来源的5'端小RNA仍然基本无法检测到。在APR-seq中，本发明使用RppH介导小RNA的去帽反应后可以显著检测到来自snRNAs 5'端的小RNA(图3a，b)。该分析结果进一步被Northern blot所验证(图3c)。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 上海科技大学

<120> 一种携带修饰的小RNA的建库方法及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 33

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

guucagaguu cuacaguccg acgaucnnnn nnn 33

<210> 2

<211> 33

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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