经呼吸道递送氧化铁纳米颗粒的生物安全性评价方法
阅读说明：本技术 经呼吸道递送氧化铁纳米颗粒的生物安全性评价方法 (Biosafety evaluation method for delivering iron oxide nanoparticles through respiratory tract ) 是由 孙夕林 李迎波 郑利敏 王凯 吴丽娜 杨洁 徐佐宇 杨丽丽 方芳 于 2021-09-13 设计创作，主要内容包括：本发明提出了一种经呼吸道递送氧化铁纳米颗粒的生物安全性评价方法,包括对纳米颗粒进行细菌内毒素检测；使用不同浓度纳米颗粒处理肺上皮细胞和巨噬细胞,测定细胞存活率；健康小鼠体内经呼吸道递送纳米材料后不同时间点采血进行血生化分析、肺泡灌洗液分析、组织标本切片染色以及各重要器官进行RT-PCR炎症细胞因子表达水平检测。本发明为经呼吸道递送氧化铁纳米颗粒的安全性检测提供了方法,也为其他纳米颗粒经呼吸道递送的安全性评价提供了参考。(The invention provides a biosafety evaluation method for delivering iron oxide nanoparticles through a respiratory tract, which comprises the steps of detecting bacterial endotoxin of the nanoparticles; treating lung epithelial cells and macrophages by using nanoparticles with different concentrations, and determining the cell survival rate; blood is collected at different time points after nanometer materials are delivered through respiratory tracts in healthy mice for blood biochemical analysis, alveolar lavage fluid analysis, tissue specimen section staining and RT-PCR inflammatory cytokine expression level detection of various important organs. The invention provides a method for detecting the safety of the iron oxide nanoparticles delivered through the respiratory tract, and also provides a reference for evaluating the safety of other nanoparticles delivered through the respiratory tract.)
技术领域
本发明涉及经呼吸道途径递送纳米颗粒的生物安全性评价方法，特别是指超顺磁性氧化铁纳米颗粒经呼吸道递送的生物安全性评价方法。
背景技术
近年来，随着肺癌等呼吸道系统疾病发病率的不断上升，肺部疾病的诊疗面临着巨大的挑战。传统治疗方式如静脉给药或者口服药物均存在肝脏首过消除、病变部位药物浓度低等缺点。由于肺的独特生理学结构，经呼吸道递送药物表现出较大的临床应用潜力。与人体其他器官相比，肺直接与外界相通，为无创性药物递送提供了便利；并且该器官具有极大的表面积、极薄的气血屏障、高血流量和较少的酶活性，通过呼吸道给药也为药物的全身递送提供了非侵入性新方法。呼吸道递送可利用低剂量药物实现肺部疾病的高浓度蓄积，避免了首过效应，并且在靶器官外的浓度低，具有较高的生物安全性。
近年来随着纳米技术的发展，越来越多的纳米颗粒用于生物医学领域，尤其是疾病的诊断和治疗。其中超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIONs)由于其良好的生物相容性以及优异的表面化学性质，广泛应用于磁共振成像(MRI)、磁性粒子成像(MPI)等，还可作为化疗药物、光热材料、光敏剂以及核酸等药物的递送载体用于疾病的治疗，尤其是靶向治疗、化学动力学治疗、光动力治疗、光热治疗、磁热疗、免疫治疗等方面。但是在肺部疾病的诊断及治疗中研究报道十分有限，尤其是经呼吸道途径递送SPIONs。
虽然纳米颗粒已经广泛应用于疾病的诊断和治疗等研究领域，但是鲜有临床应用的纳米颗粒被批准上市。究其原因为纳米颗粒的生物安全性研究严重不足，难以进入临床研究，尤其是经呼吸道途径递送的纳米颗粒。以往研究制备的纳米颗粒的生物安全性评价均通过静脉途径给药后评估生物安全性问题，未进行呼吸道递送后的生物安全性评价，无法真实反映经呼吸道途径递送后对生物体带来的影响及安全性问题。
发明内容
本发明针对以上现有技术存在的不足之处，提供一种经呼吸道途径递送SPIONs的生物安全性评价方法，该方法通过系统性的评价经呼吸道递送纳米颗粒后的生物安全性，有利于经呼吸道途径递送的纳米颗粒在临床应用中的转化。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案实现：
经呼吸道递送氧化铁纳米颗粒的生物安全性评价方法，包括以下步骤：
(1)内毒性检测：使用鲎试剂对SPIONs进行凝胶法内毒素检测；内毒素是一种由革兰氏阴性菌产生的磷脂多糖-蛋白质复合物，可引起发热、内毒素休克及血管内凝血等，对SPIONs进行检测可以评估有无内毒素污染；
(2)细胞活性测定：分别将不同浓度的SPIONs与巨噬细胞和人肺上皮细胞共孵育24-48小时后，使用MTT法测定细胞存活率；纳米颗粒的生物安全性首先体现在对细胞增殖能力的影响，通过体外与细胞共孵育并观察细胞的的活性可以初步判定SPIONs的生物安全性；由于本发明旨在建立经呼吸道途径递送纳米颗粒的安全性评估，在此选用人肺上皮细胞和巨噬细胞，观察SPIONs对以上两种细胞活性的影响；
通过步骤(1)和(2)可以在体外条件下初步、快速的评估拟用于经呼吸道递送的纳米颗粒的生物安全性，指导经呼吸道途径递送的SPIONs的浓度、剂量，筛选安全性高的纳米颗粒；
(3)血液分析：在健康BALB/c小鼠体内经呼吸道递送SPIONs后，不同时间点行静脉采血，对肝肾功能、血常规指标进行血生化分析；纳米颗粒进入生物体内可经肝肾的器官代谢排出体外，在此生物过程中可能蓄积在器官内对包括肝、肾脏器造成损伤，影响其正常的生理功能，表现为血生化指标的异常，通过血生化分析可以评估SPIONs对各器官是否存在毒性作用；
(4)肺泡灌洗液分析：在健康BALB/c小鼠体内经呼吸道递送SPIONs后，不同时间点进行肺泡灌洗，对肺泡灌洗液进行组织炎症因子检测、细胞涂片分析；
(5)炎症细胞因子检测：在健康BALB/c小鼠体内经呼吸道递送SPIONs后，不同时间点取各主要器官，抽取组织信使核糖核酸(mRNA)，进行炎症细胞因子mRNA的RT-PCR检测；
TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β、IL-13炎性细胞因子在多种肺部炎症性疾病的肺泡内高表达；与正常组织对比，炎性组织表现出显著上调的上述细胞因子的mRNA转录升高，以上各指标均是受损组织的炎症和病理标志物；通过评估经呼吸道递送SPIONs后肺泡灌洗液以及各组织的炎症因子表达情况以及对肺泡灌洗液进行涂片观察细胞类别，可以评估SPIONs是否诱导肺组织产生炎性反应；
步骤(3)、(4)、(5)可评估经呼吸道递送的SPIONs对生物体主要的各器官是否存在急性、亚急性及慢性的毒副作用，鉴别其生物安全性；
(6)纳米颗粒生物分布：在健康BALB/c小鼠体内经呼吸道递送SPIONs后，不同时间点取各主要器官，处理后使用ICP-MS检测各组织内铁离子含量；纳米颗粒在生物体内的分布，即代谢动力学，对SPIONs的体内毒副作用强度和持续性以及体内代谢过程密切相关，通过研究SPIONs的生物分布可以鉴别其在体分布状态，评估其安全性；
(7)纳米颗粒肺内分布：在健康BALB/c小鼠体内经呼吸道递送SPIONs后，不同时间点取肺组织，切片后进行铁染色，观察纳米颗粒在肺泡及各级支气管部位的分布情况；通过特异性研究经呼吸道递送SPIONs后不同时间点的肺内分布，可以有效地评估其在包括肺泡及各级支气管内的分布状态及停留时间，指导SPIONs安全性递送方案的实施；
步骤(6)、(7)可通过对经呼吸道途径递送SPIONs后的体内分布特点，评估其代谢方式及途径，指导其成像、治疗等生物学应用，指引其安全、有效的递送方案；
(8)组织病理损伤分析：在健康BALB/c小鼠体内经呼吸道递送SPIONs后，不同时间点取各主要器官进行病理学切片并用光学显微镜观察；组织病理学是临床中常用的分析组织结构病理变化的方法，通过分析经呼吸道递送SPIONs后各组织器官的病理学切片可以直观的判断其在体生物安全性；
(9)肺纤维化分析：在健康BALB/c小鼠体内经呼吸道递送SPIONs后，不同时间点取肺组织，切片后进行马松(Masson)特异性染色，观察肺部纤维化情况；以往研究证实部分纳米颗粒经肺吸入后，可引起肺组织的急慢性炎症反应，并逐渐演变为肺组织的纤维化；因此评估经呼吸道途径递送SPIONs后肺组织是否存在纤维化也是判断其生物安全性的指标之一；
步骤(8)、(9)通过评估各主要器官的组织切片的组织学形态，精准、有效的评估经呼吸道递送SPIONs是否对生物体产生组织损伤、病理状态，直观的评估其生物安全性。
进一步地，步骤(2)中，与巨噬细胞和人肺上皮细胞共孵育的SPIONs的浓度为0～1000μg/mL。
进一步地，步骤(3)-(9)中，经呼吸道途径递送的SPIONs的浓度为1mg Fe/mL，体积为0～100μL。
本发明具有以下优点：
1、通过对SPIONs的细菌内毒素、细胞存活率等生物学性能的检测方法进行研究，探索SPIONs在离体及细胞水平的生物安全性，具有灵敏度高、低成本、结果迅速可靠的优点。2、通过经呼吸道递送SPIONs后的生物分布、组织病理损伤分析及炎症细胞因子的检测，监测时间长、评价指标综合全面，有助于系统性的在体评价经呼吸道递送纳米颗粒的组织水平生物安全性。3、本发明所用评价方法均具有方法简便、可重复性高等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明使用方法的技术路线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，经呼吸道递送氧化铁纳米颗粒的生物安全性评价方法，包括以下步骤：
(1)采用凝胶法进行SPIONs的内毒性检测。配制内毒素标准溶液，分别进行鲎试剂灵敏度复合试验、干扰预实验以及干扰正式试验，最后进行SPIONs的内毒素检测。
(2)将人肺上皮细胞BEAS-2B细胞和巨噬细胞RAW264.7在细胞培养基中培养，取对数期生长的细胞接种到96孔板中，以1×105个细胞/mL(每孔200μL)的密度接种，孵育过夜后，添加不同浓度(0～1000μg Fe/mL)的SPIONs与细胞共孵育24小时或48小时，除去SPIONs后PBS清洗三次，在每个孔中加入不含FBS的MTT(3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2-H-溴化四唑)溶液(1mg/mL)。孵育4小时后，弃上清后PBS清洗三次。加入150μL DMSO提取反应生成的Formazan，使用多功能微孔板检测器在560nm波长处测量吸光度值(OD)。通过以下公式计算细胞存活率：
细胞存活率＝[(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)]×100％。
通过测定不同浓度SPIONs对肺上皮细胞及巨噬细胞的细胞存活率的应用，监测SPIONs是否具有细胞毒性以及SPIONs对细胞增殖的影响。
(3)健康BALB/c小鼠麻醉后经呼吸道递送0～100μg SPIONs，在第1、7、30天时自小鼠眶后静脉窦取血，室温下离心并分离血清。对血样进行分析白细胞计数、红细胞计数、红细胞压积、血小板计数、血红蛋白、白细胞分类各项血常规指标，以及AST、ALT、LDH、总蛋白、总胆红素、白蛋白、球蛋白、肌酐、尿素氮各项肝肾功能指标。检测比较经呼吸道途径递送不同浓度SPIONs后，各项指标的变化趋势，确定SPIONs是否对以上生理学指标产生影响。
(4)健康BALB/c小鼠麻醉后经呼吸道递送0～100μg SPIONs后，在第1、7、30天时麻醉小鼠后处死小鼠，体表消毒后暴露气管，气管切开后插入带针头的注射器并细线固定，抽取无菌生理盐水1ml缓慢注入肺泡进行灌洗，缓慢抽吸2～4次后收集肺泡灌洗液，共灌洗5ml。将收集的肺泡灌洗液4℃离心后，取上清进行细胞因子检测，取细胞沉淀进行细胞计数、涂片并HE染色后进行细胞分类。
(5)健康BALB/c小鼠麻醉后经呼吸道递送0～100μg SPIONs后，在第1、7、30天时麻醉小鼠后处死小鼠，取肺组织及各重要器官(心、肝、脾、脑、肾、肠及骨骼肌)，提取组织mRNA进行RT-PCR检测。以GAPDH或者beta-actin(Actb)cDNA作为管家基因，以TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β、IL-13各炎性细胞因子为目的基因，分析炎性细胞因子的mRNA表达水平。
(6)健康BALB/c小鼠麻醉后经呼吸道递送0～100μg SPIONs后，在第1、7、30天时麻醉小鼠后处死小鼠，取肺组织及各重要器官(心、肝、脾、脑、肾、肠及骨骼肌)，采用湿法消解将组织溶解并赶酸处理后，使用ICP-MS检测各组织内铁离子含量。通过短期、中期及长期观测经呼吸道途径递送SPIONs在生物体内的分布情况，确定SPIONs的代谢途径。
(7)健康BALB/c小鼠麻醉后经呼吸道递送0～100μg SPIONs后，在第1、7、30天时麻醉小鼠后处死小鼠，取肺组织进行组织病理学切片，并进行切片肺组织普鲁士蓝铁染色。观察经呼吸道递送SPIONs后，不同时间SPIONs在肺内的分布情况。
(8)健康BALB/c小鼠麻醉后经呼吸道递送0～100μg SPIONs后，在第1、7、30天时麻醉小鼠后处死小鼠，取肺组织及各重要器官(心、肝、脾、脑、肾、肠及骨骼肌)进行组织病理学切片的HE染色。观察经呼吸道途径递送SPIONs后，不同时间小鼠各个脏器是否存在病理损伤。
(9)健康BALB/c小鼠麻醉后经呼吸道递送0～100μg SPIONs后，在第1、7、30天时麻醉小鼠后处死小鼠，取肺组织进行病理学切片，并进行切片肺组织的马松(Masson)染色。观察经呼吸道途径递送后不同时间小鼠肺组织损伤情况。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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