基于乳液界面能诱导释放的生理毒性快速检测方法及应用
阅读说明：本技术 基于乳液界面能诱导释放的生理毒性快速检测方法及应用 (Rapid physiological toxicity detection method based on emulsion interface energy induced release and application ) 是由 柯李晶 高观祯 余兆硕 徐阳 徐天豪 罗思浩 汪惠勤 周建武 饶平凡 于 2021-07-26 设计创作，主要内容包括：基于食用乳液界面能的诱导释放的生理毒性快速检测方法,包括以下步骤：1)取乳化剂溶于超纯水中溶解,再均匀缓慢加入食用乳液样品并采用高速剪切机剪切,剪切均质后用有机膜过滤,全过程维持温度恒定；2)按照体积配置含氧化还原酶的食用乳液样品；3)将荧光探针溶于超纯水中,并对荧光探针水溶液进行稀释,设置测定条件；4)吸取食用乳液样品于离心管内,将离心管放入样品槽中,开始测量；向样品中加入稀释后的荧光探针水溶液,得到并分析测量数据和动力学曲线。本发明的检测方法快速、高效、简单,设备要求低,结果精确,重复性高,灵敏度高,只需微量便可检测出结果；且可在体外诱导并破坏乳体系并释放出其界面能,安全便捷。(The quick physiological toxicity detection method based on the induction release of the edible emulsion interfacial energy comprises the following steps: 1) dissolving emulsifier in ultrapure water, uniformly and slowly adding an edible emulsion sample, shearing by using a high-speed shearing machine, filtering by using an organic membrane after shearing and homogenizing, and maintaining the temperature to be constant in the whole process; 2) preparing an edible emulsion sample containing oxidoreductase according to volume; 3) dissolving a fluorescent probe in ultrapure water, diluting a fluorescent probe aqueous solution, and setting a determination condition; 4) sucking an edible emulsion sample into a centrifugal tube, putting the centrifugal tube into a sample groove, and starting to measure; the diluted fluorescent probe aqueous solution was added to the sample, and measurement data and a kinetic curve were obtained and analyzed. The detection method is rapid, efficient and simple, has low equipment requirement, accurate result, high repeatability and high sensitivity, and can detect the result only by trace; and can induce and destroy the milk system in vitro and release the interface energy thereof, and is safe and convenient.)
技术领域
本发明属于食品安全检测领域，特别是基于乳液界面能诱导释放的生理毒性快速检测方法及应用。
背景技术
自由基又称活性氧或者游离基，它是指带有不配对价电子的分子，原子或者原子团。其化学活性高，均不稳定，存在时间短，性质活泼，有极高的反应性，能与生物体系组分起反应，破坏蛋白质，脂类，多糖核酸进而导致细胞损伤。我们生物体系主要遇到的是氧自由基，体内活性氧自由基具有一定的功能，如免疫和信号传导过程。但过多的活性氧自由基就会有破坏行为，导致人体正常细胞和组织的损坏，从而引起多种疾病。如心脏病、老年痴呆症、帕金森病和肿瘤。同时食物中的过高自由基含量对人体具有一定的生理毒性。
食用乳液是指将可食用油脂或者脂溶性成分经物理或者化学方法乳化成 O/W或者W/O的微纳米乳液，大部分是由于机械混合(剧烈加工如均质剪切，温和的为机械搅拌)或者超声混合、化学稳定等几步所形成特定空间乳液结构，部分能量在其加工过程中被储存在乳液结构中，用于保持其结构的相对稳定。研究发现，当乳液结构受到外界干扰时，其存储的能量就会被释放出来，若这个释放过程在人体内进行，则极易导致不同程度的炎症。近来研究发现，鱼油等乳液体系在食用后会导致一部分机体产生炎症，然而，在溯源食品安全问题时，制备乳液的酸价、过氧化值等各项常规指标均正常，也并无检测出生理堵塞，且操作过程也符合规范，这为乳液产品的安全性带来了诸多疑问。本发明者首次发现了这些安全问题与其界面能转化的自由基相关。
综上，面对生活中越来越多的食品乳液产品，但是市场上对于其生理毒性的评价检测方法仍需进一步完善，亟需一种体外食用乳液生理毒性的快速评价方法。
发明内容
基于现有技术中存在的上述缺点和不足，本发明创新性的使用了过氧化氢酶来诱导释放出乳液的界面能并基于食品乳液界面中过量自由基所导致的炎症问题，利用荧光检测技术，建立了基于乳液界面能诱导释放的生理毒性快速检测方法，补充了食品生理毒性的检测体系，对于其相关产品的快速检测及品质控制具有重要意义。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
基于乳液界面能诱导释放的生理毒性快速检测方法，包括以下步骤：
1)取乳化剂溶于超纯水中溶解，再均匀缓慢加入食用乳液样品并采用高速剪切机剪切，剪切均质后用有机膜过滤，全过程维持温度恒定；
2)配置含氧化还原酶的食用乳液样品；
3)将荧光探针溶于超纯水中，并对荧光探针水溶液进行稀释，设置测定条件；
4)吸取食用乳液样品于离心管内，将离心管放入样品槽中，开始测量；向样品中加入稀释后的荧光探针水溶液，得到并分析测量数据和动力学曲线。
优选的，所述步骤1中乳化剂的量为100μL，超纯水的量为100mL，食用乳液的量为500μL，剪切速度为3000-30000rpm，时间为3-15min，所述温度为 30-50℃。
优选的，步骤3中，所述荧光探针为二甲基吡啶N-氧化物荧光探针，荧光探针的量为0.1mg，超纯水的量为866μL，稀释比例为1:4.5；
所述测定条件为：设置AB-2280照度传感器的准备时间为5s，测定时间为 120s；
步骤4中，食用乳液样品的量为1100μL，加入稀释后的荧光探针水溶液的量为100μL；开始测量5s后加入稀释后的荧光探针水溶液。
优选的，所述食用乳液为由鱼油、猪油、橄榄油、藻油、亚油酸、棕榈油一种或多种制备而成的食用乳液。
优选的，食用乳液的制备形式为纳米乳液、脂质体、胶束、囊泡中的一种或多种。
优选的，所述氧化还原酶为过氧化氢酶。过氧化氢酶能够诱导食品乳液界面能的释放。
优选的，步骤2配置的食用乳液含还原酶的浓度为0-0.5μmol/L。
优选的，所述有机膜为0.22-0.45μL有机膜。
优选的，所述乳化剂为吐温、卵磷脂、司盘、甘油酯中的一种或者几种。
本发明还提供上述基于乳液界面能诱导释放的生理毒性快速检测方法在分析食品乳液生理毒性中的应用。
本发明的有益效果：
1.本发明的使用了过氧化氢酶来诱导释放出乳液的界面能并基于食品乳液界面中过量自由基所导致的炎症问题，利用荧光检测技术，建立了基于乳液界面能诱导释放的生理毒性快速检测方法。本发明的检测方法快速、高效、简单，设备要求低。
2.本发明的检测方法结果精确，重复性高，灵敏度高，只需微量便可检测出结果。
3.本发明的检测方法可在体外诱导并破坏乳体系并释放出其界面能，安全便捷。
附图说明
图1不同乳化剂制备而成的鱼油乳液本底ROS含量及其与过氧化氢酶(CAT) 混合后的ROS含量；(黑色部分：未添加过氧化氢酶；灰色部分：添加过氧化氢酶)
图2不同过氧化氢酶(CAT)浓度对鱼油乳液ROS含量的影响(F0为鱼油乳液本底ROS含量，F1为鱼油乳液加入过氧化氢后的ROS含量)；
图3不同浓度过氧化氢酶(CAT)添加量对猪油乳液ROS含量的影响(第1、 3天)；
图4不同浓度过氧化氢酶(CAT)添加量对亚油酸乳液ROS含量的影响；
图5不同浓度过氧化氢酶(CAT)添加量对DHA藻油乳液ROS含量的影响；
图6不同浓度过氧化氢酶(CAT)添加量的鱼油乳液的生理毒性图(鱼油选择16.7μg/mL，过氧化氢酶添加量分别为0/0.24/0.48μmol/L)
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
除非另作定义，本公开所使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内有一般技能的人士所理解的通常意义。
实施例1：鱼油乳液生理毒性的快速检测方法
吸取100μL吐温80或卵磷脂溶于100ml超纯水中搅拌溶解，再向该体系中均匀缓慢的滴入500μl鱼油样品18000rpm高速剪切机均质五分钟，剪切均质样品用0.22μL有机膜过滤，整个过程维持在40℃。分别配置含过氧化氢酶浓度为0/0.24/0.48μmol/L的鱼油乳液。
0.1mg二甲基吡啶N-氧化物荧光探针溶于866μL超纯水中，以1:4.5的比例对二甲基吡啶N-氧化物水溶液进行稀释，打开设置AB-2200照度传感器，设置准备时间设置为5s,测定时间设置为120s。吸取1100μL乳液样品于离心管，并放入样品槽中，点击开始测量，等待5s后向样品中加入100μL稀释后的二甲基吡啶N-氧化物荧光探针水溶液再点击开始按钮，得到并分析测量数据和动力学曲线。
在此条件下，测定了不同乳化剂，不同鱼油浓度/有无过氧化氢酶对鱼油乳液ROS含量的影响以及不同过氧化氢酶浓度对细胞的毒性，详见附图1、附图2 和附图6。
结果显示，不同乳化剂对于成品的乳液制品的自由基含量具有较大的影响。着重分析图2我们可以发现，无过氧化氢酶的样品的自由基含量在80000上下，基数较少且随着鱼油浓度的增加变化不大，而加了过氧化氢酶的鱼油乳液的自由基含发生爆发，扩大了6倍以上，再分析图6可发现过氧化氢酶浓度增加以后，细胞的存活率下降。由此得出在过氧化氢酶为0-0.48μmol/L浓度下，自由基的含量和细胞毒性大致关系:自由基的大量爆发会降低细胞的存活率，故我们可以得出该鱼油乳液的服用后对机体具有生理毒性。该法重现性好，只需微量便可检测出结果。
实施例2：亚油酸乳液生理毒性的快速检测方法
吸取100μL吐温80溶于100mL超纯水中搅拌溶解，再向该体系中均匀缓慢的滴入500μL亚油酸样品30000rpm高速剪切机剪切3分钟，剪切均质样品用0.22μL有机膜过滤，整个过程维持在47℃。配置含过氧化氢酶浓度为0μmol/L、 0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.6μmol/L、0.8μmol/L的亚油酸乳液备用。
0.1mg二甲基吡啶N-氧化物荧光探针溶于866μL超纯水中，以1:4.5的比例对二甲基吡啶N-氧化物荧光探针水溶液进行稀释，设置设置AB-2200照度传感器控制面板的测定条件，准备时间设置为5s,测定时间设置为120s。吸取1100 μL亚油酸乳液样品于离心管，并放入样品槽中，点击开始测量，等待5s后向样品中加入100μL稀释后的二甲基吡啶N-氧化物荧光探针水溶液再点击开始按钮，记录自由基数量以及其动力学曲线。部分结果如图4，随着过氧化氢酶浓度的增加，样品的自由基发生2-4倍的爆发且基数不高，推测分析此样品服用后对人体基本无生理毒性。该法重现性好，只需微量便可检测出结果。
实施例3：藻油乳液生理毒性的快速检测方法
吸取100μL吐温80溶于100ml超纯水中搅拌溶解，再向该体系中均匀缓慢的滴入500μL藻油样品3000rpm高速剪切机剪切15分钟，剪切均质样品用0.45 μL有机膜过滤，整个过程维持在32℃。配置含过氧化氢酶浓度为0μmol/L、0.2 μmol/L、0.4μmol/L、0.6μmol/L、1.0μmol/L的藻油乳液备用。
0.1mg二甲基吡啶N-氧化物荧光探针溶于866μL超纯水中，以1:4.5的比例对二甲基吡啶N-氧化物荧光探针水溶液进行稀释，设置设置AB-2200照度传感器控制面板的测定条件，准备时间设置为5s,测定时间设置为120s。吸取1100 μL藻油乳液于离心管(浓度过高可以稀释)，并放入样品槽中，点击开始测量，等待5s后向样品中加入100μL稀释后的二甲基吡啶N-氧化物荧光探针水溶液再点击开始按钮，记录自由基含量以及其动力学曲线。部分结果如图4，随着过氧化氢酶浓度的增加，样品的自由基发生4倍以内的爆发且基数不高，推测分析此样品服用后对人体基本无生理毒性。该法重现性好，只需微量便可检测出结果。
实施例4：猪油乳液生理毒性的快速检测方法
吸取100μL吐温80溶于100mL超纯水中搅拌溶解，再向该体系中均匀缓慢的滴入500μL猪油样品15000rpm高速剪切机剪切7分钟，剪切均质样品用 0.22μL有机膜过滤，整个过程维持在38℃。配置含过氧化氢酶浓度为0μmol/L、0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.4μmol/L、0.5μmol/L的猪油乳液备用。
0.1mg二甲基吡啶N-氧化物荧光探针溶于866μL超纯水中，以1:4.5的比例对二甲基吡啶N-氧化物荧光探针水溶液进行稀释，设置AB-2200照度传感器控制面板的测定条件，准备时间设置为5s,测定时间设置为120s。吸取1100μL 猪油乳液于离心管(浓度过高可以稀释)，并放入样品槽中，点击开始测量，等待5s后向样品中加入100μL稀释后的二甲基吡啶N-氧化物荧光探针水溶液再点击开始按钮，记录自由基数量以及其动力学曲线。部分结果如图5，随着过氧化氢酶浓度的增加，样品的自由基发生大量爆发，爆发最多的达到了10的数量级，推测分析样品服用后对人体有生理毒性。该法重现性好，只需微量便可检测出结果。
以上实施例充分展示了可以通过ROS的检测来快速的得出食品乳液的生理毒性情况，基于荧光检测技术得出的ROS含量，有望以此作为品质评价、调控及判断食品乳液的生理毒性。
以上所述仅是对本发明的优选实施例及原理进行了详细说明，对本领域的普通技术人员而言，依据本发明提供的思想，在具体实施方式上会有改变之处，而这些改变也应视为本发明的保护范围。
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