冬凌草甲素在制备抗前列腺癌药物中的用途
阅读说明：本技术 冬凌草甲素在制备抗前列腺癌药物中的用途 (Application of oridonin in preparation of anti-prostatic cancer drugs ) 是由 黄帅 唐欲博 瓦庆德 令狐熙涛 王斌 谢尚延 马长淞 于 2021-09-02 设计创作，主要内容包括：本发明涉及前列腺癌治疗技术领域,特别是涉及冬凌草甲素在制备抗前列腺癌药物中的用途。本发明要解决的技术问题是为治疗前列腺癌提供一种新选择。本发明的技术方案是冬凌草甲素在制备抗前列腺癌药物中的用途。本发明验证了冬凌草甲素通过上调miR-204-5p表达并阻断NF-κB信号通路活性,从而抑制了PC-3细胞的增殖、迁移及侵袭。本发明揭示了冬凌草甲素在体外对PC-3细胞的抗瘤作用,为冬凌草甲素作为潜在抗PCa药物提供可能性,同时为制备抗PCa的药物提供了新选择。(The invention relates to the technical field of prostate cancer treatment, in particular to application of oridonin in preparation of a prostate cancer resistant medicament. The invention aims to provide a new choice for treating prostate cancer. The technical scheme of the invention is the application of oridonin in preparing the anti-prostate cancer medicament. The invention verifies that oridonin inhibits the proliferation, migration and invasion of PC-3 cells by up-regulating miR-204-5p expression and blocking NF-kB signal pathway activity. The invention discloses the anti-tumor effect of oridonin on PC-3 cells in vitro, provides possibility for the oridonin as a potential anti-PCa medicament, and provides a new choice for preparing the anti-PCa medicament.)
技术领域
本发明涉及前列腺癌治疗技术领域，特别是涉及冬凌草甲素在制备抗前列腺癌药物中的用途。
背景技术
前列腺癌(Prostate cancer，PCa)骨转移是PCa患者的主要死因，目前PCa骨转移的治疗措施主要包括手术、化疗及放疗等，其中化疗是PCa骨转移的主要治疗方法之一。但化疗易导致胃肠道反应、神经病变等副作用，因此探索有效且毒副作用小的PCa骨转移治疗药物具有重要临床意义。
microRNAs是一类广泛分布在真核生物中的非编码RNA，其通过结合靶基因的3′UTR区域以介导基因降解或抑制其翻译。研究发现microRNAs的异常表达与肿瘤发生发展密切相关，可作为肿瘤诊断的标志物和治疗靶点。
冬凌草甲素(Oridonin，ORI)是一类分离自冬凌草的二萜类活性物质。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为治疗前列腺癌提供一种新选择。
本发明的技术方案是冬凌草甲素在制备抗前列腺癌药物中的用途。
本发明还提供了冬凌草甲素在制备抗前列腺癌骨转移药物中的用途。
本发明还提供了一种抗前列腺癌或抗前列腺癌骨转移的药物，其主要活性成分为冬凌草甲素。
优选的，所述冬凌草甲素的浓度为5～20μM。
更优选的，所述冬凌草甲素的浓度为20μM。
本发明还进一步提供了冬凌草甲素在调控基因miR-204-5p表达和/或NF-κB信号通路中的用途。
具体的，所述调控基因miR-204-5p表达为上调基因miR-204-5p表达。
优选的，所述调控NF-κB信号通路为调控基因P65、TRAF1、TAB3和/或MAP3K3的表达。
具体的，所述调控基因P65、TRAF1、TAB3和/或MAP3K3的表达为抑制基因P65、TRAF1、TAB3和/或MAP3K3的表达。
本发明还提供了调控基因miR-204-5p表达和/或NF-κB信号通路的组合物，其主要活性成分为冬凌草甲素。
具体的，所述调控基因miR-204-5p表达的组合物中，冬凌草甲素的浓度为5～20μM。
优选的，所述调控基因miR-204-5p表达的组合物中，冬凌草甲素的浓度为10～20μM。
进一步的，所述调控NF-κB信号通路的组合物中，冬凌草甲素的浓度为5～20μM。
优选的，所述调控调控NF-κB信号通路的组合物中，冬凌草甲素的浓度为20μM。
本发明的有益效果：本发明验证了冬凌草甲素通过上调miR-204-5p表达并阻断NF-κB信号通路活性，从而抑制了PC-3细胞的增殖、迁移及侵袭。本发明揭示了冬凌草甲素在体外对PC-3细胞的抗瘤作用，为冬凌草甲素作为潜在抗PCa药物提供可能性，同时为制备抗PCa的药物提供了新选择。
附图说明
图1、冬凌草甲素抑制PC-3细胞增殖；A、不同浓度的冬凌草甲素溶液对PC-3细胞增殖能力的影响；B、冬凌草甲素溶液在不同时间对PC-3细胞增殖能力的影响。其中，Relativecell proliferation(％)：细胞相对增殖(％)；Oridonin(μM)：冬凌草甲素(μmol/L)；DMSO：二甲基亚砜。
图2、冬凌草甲素抑制PC-3细胞迁移能力；A-D、Transwell法评估冬凌草甲素溶液对PC-3细胞迁移的影响；E、迁移细胞率。其中，Relative migration ratio：细胞迁移率；Oridonin(μM)：冬凌草甲素(μmol/L)。
图3、冬凌草甲素抑制PC-3细胞侵袭能力；A-D、Transwell法评估冬凌草甲素溶液对PC-3细胞侵袭的影响；E、侵袭细胞率。Relative invasion ratio：细胞侵袭率；Oridonin(μM)：冬凌草甲素(μmol/L)。
图4、冬凌草甲素通过上调miR-204-5p抑制NF-κB信号通路表达；A-E、qRT-PCR检测miR-204-5p及NF-κB信号通路相关基因mRNA表达；F、Westernblot检测NF-κB信号通路相关蛋白表达，p85为内参。其中，Relative miR-204-5P mRNA expression level：miR-204-5P的mRNA相对表达水平；Relative TRAF1 mRNA expression level：TRAF1基因的mRNA相对表达水平；Relative TAB3 mRNA expression level：TAB3基因的mRNA相对表达水平；Relative P65 mRNA expression level：P65基因的mRNA相对表达水平；Relative MAP3K3mRNA expression level：MAP3K3基因的mRNA相对表达水平；Oridonin(μM)：冬凌草甲素(μmol/L)；DMSO：二甲基亚砜。Vector：空载体组、miR-204-5P：miR-204-5P过表达组、DMSO：DMSO组、Oridonin：冬凌草甲素组。
图5、冬凌草甲素抑制PC-3细胞在体内的生长；A、冬凌草甲素溶液对PC-3细胞在体内表达NF-κB信号通路相关基因的代表性免疫组化染色结果；B、冬凌草甲素溶液对PC-3细胞在体内生长的重量影响；C、冬凌草甲素溶液对miR-204-5p在动物体内表达水平的影响；D-F、冬凌草甲素溶液对PC-3细胞表达NF-κB信号通路分子的影响。Tumor weight(mg)：肿瘤瘤体重量(毫克)；Relative miR-204-5P mRNA expression level：miR-204-5P的mRNA相对表达水平；Relative positive cells perfield(％)：阳性细胞相对百分比(％)。
具体实施方式
试剂、生物材料、仪器设备
人前列腺癌PC-3细胞(购自美国典型培养物ATCC保藏中心)，使用补充有10％胎牛血清、5％青霉素和链霉素的1640培养基培养(购自美国Gibco公司)；冬凌草甲素(购自中国武汉慧诚益通生物公司)；RPMI 1640培养基、0.25％胰蛋白酶-EDTA(购自美国Hyclone公司)；胎牛血清、青霉素/链霉素(购自美国Gibco公司)；P65、P84、TRAF1、TAB3和MAP3K3抗体(购自美国Cell Signaling Technology公司)；CCK-8细胞活性检测试剂盒(购自中国北京全式金生物技术有限公司)；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒(购自日本Takar公司)；PCR引物(购自中国吉凯基因医学科技公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒(购自中国碧云天生物科技公司)。
CO2细胞培养箱、冷冻高速离心机、超净生物安全工作台(美国Thermo Fisher公司)，荧光显微镜(德国Leica公司)，垂直凝胶转印系统(美国Biorad公司)，酶标仪(美国BioTek公司)。
以下所有实验均重复3次以上，数据以均数±标准差表示。用SPSS18.0进行分析，组间差异比较采用t检验，P<0.05代表差异有统计学意义。
实施例1：冬凌草甲素抑制PC-3细胞增殖
采用CCK8法检测不同浓度冬凌草甲素溶液对细胞增殖能力的影响。具体操作方法如下：用0.25％胰酶消化PC-3细胞制备细胞悬液，以2×103个/孔密度接种至96孔培养板中，每组设5个重复。待细胞贴壁后加入0、0.1、1、5、10、15、20、30、40μmol/L的冬凌草甲素溶液，继续培养24小时后各孔加入10μL CCK8试剂孵育2小时，然后用酶标仪检测450nm波长处的吸光度值。
结果表明冬凌草甲素且呈浓度依赖性抑制PC-3细胞的增殖，差异较对照组具有统计学意义(P<0.05)，其IC50值约为10μM(图1A)。在此基础上，用10μM冬凌草甲素溶液处理PC-3细胞0、1、2、3、4、5天后，用CCK8法检测细胞的增殖能力。结果表明冬凌草甲素且呈时间依赖性抑制PC-3细胞的活力，差异较对照组具有统计学意义(P<0.05)(图1B)。
实施例2：冬凌草甲素抑制PC-3细胞迁移及侵袭
采用Transwell实验检测不同浓度冬凌草甲素溶液对细胞迁移及侵袭能力的影响。具体操作方法如下：首先用0、5、10、20μmol/L的冬凌草甲素溶液处理PC-3细胞24小时，然后用0.25％胰酶消化，离心后重悬细胞沉淀，调整细胞密度至1×106个/mL。将100μL细胞重悬液加入Transwell上室，下室加入800μL细胞培养基后继续培养。24小时后取出Transwell小室，4％多聚甲醛固定30分钟，洗涤后用湿棉签小心去除上室面细胞，然后用0.1％结晶紫进行染色20分钟，晾干后在倒置显微镜随中机选取5个高倍视野进行拍照和计数，计算平均值。检测细胞迁移能力时未在上室添加Matrigel基质胶，而在检测细胞侵袭能力时，需用Matrigel基质胶稀释液(1︰5)包被Transwell上室面基底膜，其余实验条件与操作步骤相同。
结果显示，用0、5、10、20μM冬凌草甲素溶液处理PC-3细胞24小时后，冬凌草甲素呈浓度依赖性抑制细胞迁移(图2)及侵袭能力(图3)，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。
实施例3：冬凌草甲素上调miR-204-5p表达并抑制NF-κB信号通路
采用qPCR及Western blot实验检测冬凌草甲素溶液对细胞表达miR-204-5p及NF-κB信号通路分子的影响。具体操作方法如下：①qPCR实验：用不同浓度0、5、10、15、20、30、40μmol/L的冬凌草甲素溶液处理细胞24小时，RNA提取试剂盒提取总RNA，根据Takara试剂盒将总RNA逆转录成cDNA，然后使用Qantifest SYBR green mix(Qiagen)扩增。以U6或GAPDH作为对照，检测NF-κB信号通路分子TRAF1、TAB3、P65和MAP3K3的表达基因的相对表达率，使用2-ΔΔCt法计算，引物序列见表1。②Western blot实验：将PC-3细胞接种至100cm2培养皿中，待细胞密度增殖至80％时加入0、10μmol/L的冬凌草甲素溶液，24小时后利用RIPA与PMSF混合裂解液提取药物处理后的细胞总蛋白，BCA标准法进行蛋白定量。制备10-12％的SDS-PAGE凝胶进行电泳，PVDF膜电转2小时，2％BSA封闭1小时后加入一抗，4℃冰箱避光孵育。TBST洗涤3次后加入二抗孵育1小时，加入ECL发光液，在成像系统中曝光条带。
qRT-PCR和Westernblot实验结果均表明，用不同浓度(0、5、10、15、20μM)的冬凌草甲素溶液处理PC-3细胞24小时后，冬凌草甲素溶液以浓度依赖性上调miR-204-5p的表达，并抑制NF-κB信号通路分子TRAF1、TAB3、P65和MAP3K3的表达(图4A-E)，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。此外，过表达miR-204-5p和冬凌草甲素均可抑制PC-3细胞表达TRAF1、TAB3、P65和MAP3K3，二者对NF-κB信号通路调控作用相同(图4F)。
表1 qRT-PCR引物序列
实施例4：冬凌草甲素对裸鼠移植瘤的肿瘤抑制作用及TRAF1、TAB3和MAP3K3表达的影响
6周龄雄性Balb/c裸鼠购自中山大学实验动物中心。将小鼠随机分为对照组和冬凌草甲素治疗组。将0.2mL(1×106个)PC-3细胞接种于裸鼠背部皮下。待裸鼠肿瘤形成后，挑选瘤体积相近的裸鼠随机分组，每组6只。其中对照组不给予任何药物；oridonin治疗组，按照4mg/kg的标准进行注射，1次/1天，给药3周后处死小鼠，收集肿瘤组织称重，进行TRAF1、TAB3、MAP3K3和miRNA-204-5p的表达量检测，病进行免疫组织化学染色。如图5所示，对照组的肿瘤重量为(289.33±48.58)mg，而冬凌草甲素(500mg/kg)组体积为(45.35±20.13)mg，两组肿瘤重量具有统计学意义(图5B)。qRT-PCR实验结果表明(图5C、D)，冬凌草甲素(500mg/kg)上调裸鼠移植瘤中miRNA-204-5p的表达，同时还抑制NF-κB信号通路下游基因TRAF1、TAB3和MAP3K3的表达。免疫组织化学结果(图5A)显示：与对照组比较，冬凌草甲素组TRAF1、TAB3、MAP3K3蛋白表达显著降低。其中，图5中，Tumor weight(mg)：肿瘤瘤体重量(毫克)；Relative miR-204-5P mRNA expression level：miR-204-5P的mRNA相对表达水平；Relative positive cells perfield(％)：阳性细胞相对百分比(％)。
申请人探索了冬凌草甲素在体外是否能抑制PC-3细胞的增殖、迁移与侵袭。首先用不同浓度的冬凌草甲素溶液(0、0.1、1、5、10、15、20、30、40μM)处理PC-3细胞，24小时后用CCK8检测其对细胞增殖能力的影响，结果显示与对照组相比，冬凌草甲素溶液呈浓度依赖性抑制PC-3细胞的增殖，其半抑制率IC50值为10μM。在此基础上，用10μM的冬凌草甲素溶液处理细胞1-5天后，CCK8检测结果显示，与对照组相比冬凌草甲素溶液呈时间依赖性抑制PC-3细胞的增殖。其次，用0、5、10、20μM冬凌草甲素溶液处理PC-3细胞24小时，然后通过Transwell检测细胞迁移及侵袭能力的变化，结果表明冬凌草甲素溶液呈浓度梯度抑制PC-3细胞的迁移及侵袭能力，在5、10、20μM冬凌草甲素溶液作用下，迁移及侵袭的细胞数较对照组明显减少。上述结果均说明冬凌草甲素在体外能抑制PC-3细胞的增殖、迁移和侵袭。
miR-204-5p在PCa骨转移过程中具有重要的调控作用，但冬凌草甲素能否通过调控miR-204-5p表达影响PCa细胞的转移能力尚不明确。因此本发明重点探索了冬凌草甲素抑制PC-3细胞的增殖、迁移与侵袭是否与miR-204-5p有关。首先用不同浓度(0、5、10、15、20μM)冬凌草甲素溶液处理PC-3细胞24小时，然后用PCR检测miR-204-5p的mRNA表达，结果显示，与对照组相比冬凌草甲素能上调PC-3细胞中miR-204-5p的表达，在10μM时上调作用最明显。
NF-κB是肿瘤发生、发展和转移过程的关键调节因子。在本发明中，PCR结果表明不同浓度的冬凌草甲素溶液除能上调miR-204-5p外，同时还抑制NF-κB信号通路下游基因P65、TRAF1、TAB3和MAP3K3的表达。此外，Western blot结果表明，冬凌草甲素溶液处理组与过表达miR-204-5p结果一致，PC-3细胞中NF-κB信号通路下游分子P65、TRAF1、TAB3和MAP3K3蛋白表达较对照组均明显下调。因此，这些结果说明冬凌草甲素可上调miR-204-5p以阻断NF-κB信号通路分子表达参与调控PC-3细胞的转移能力。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。