非戈替尼在细胞毒性损伤中的应用
阅读说明：本技术 非戈替尼在细胞毒性损伤中的应用 (Application of non-golitinib in cytotoxic injury ) 是由 文先杰 李逸群 陈美欣 毋朝霞 杨淑璇 梁肖霞 陈伟健 于 2021-04-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了非戈替尼在细胞毒性损伤中的应用,涉及医药配制品技术领域。本发明公开的非戈替尼在制备修复或改善或预防由酰胺类局部麻醉类药物引起的细胞损伤的产品等方面的新用途,以及在制备用于修复或改善或预防与炎症反应相关的疾病的药物中的新应用,为修复或改善或预防酰胺类局部麻醉类药物引起的中枢神经系统疾病提供了理论依据和新的思路。(The invention discloses an application of non-gautinib in cytotoxic injury, and relates to the technical field of pharmaceutical preparations. The invention discloses a new application of non-gautinib in preparation of products for repairing or improving or preventing cell damage caused by amide local anesthesia drugs, and a new application in preparation of drugs for repairing or improving or preventing diseases related to inflammatory reaction, and provides a theoretical basis and a new thought for repairing or improving or preventing central nervous system diseases caused by amide local anesthesia drugs.)
技术领域
本发明涉及医药配制品研究领域，特别涉及非戈替尼在细胞毒性损伤中的应用。
背景技术
Filgotinib(中文名称非戈替尼或非洛替尼)是一种用于治疗类风湿关节炎(RA)，溃疡性结肠炎(UC)，银屑病关节炎(PsA)和克罗恩氏病的药物。非戈替尼是Janus激酶抑制剂，对该酶的亚型JAK1具有选择性。由于它选择性地抑制JAK1，因此被认为是有前途的药物。
非戈替尼已经经历了三期的FINCH试验。FINCH 1是一项与MTX联合进行的为期52周的随机、安慰剂和阿达木单抗对照试验，招募1，759名对MTX(甲氨蝶呤)治疗反应不足的成年中重度活动性RA患者。FINCH 1的主要终点是第12周时的ACR20。该试验包括第24周和第52周时的放射学评估。FINCH2是一项为期24周的全球性随机、双盲、安慰剂对照3期研究，以常规合成疾病缓解性抗风湿药(csDMARD)为背景，对449名对bDMARD(生物类改变病情类抗风湿药)反应不足的成年中重度活动性RA患者评估非戈替尼。FINCH 2的主要终点是第12周时的ACR20。FINCH 3是一项为期52周的随机试验，对1，252名MTX-初治患者评估单独给药非戈替尼200mg和非戈替尼100mg或200mg联合MTX与单独给药MTX的疗效。FINCH 3的主要终点是第24周时的ACR20。该试验包括第24周和第52周时的放射学评估。
发明内容
本发明目的在于提供非戈替尼在细胞毒性损伤场景中的应用，为细胞毒性损伤的治疗提供新思路，并拓宽非戈替尼的应用范围。
本发明一方面提供了非戈替尼在制备用于修复或改善或预防由盐酸罗哌卡因引起的细胞损伤的产品中的应用。
在本发明的一些应用实施方式中，所述细胞损伤的类型包括细胞凋亡、细胞活力降低、细胞炎症反应中一种或几种。
在本发明的一些应用实施方式中，所述细胞活力降低包括细胞收缩变圆、膜破裂、内容物溢出。
在本发明的一些应用实施方式中，所述细胞炎症反应的表现为IL-10的表达量提高、IL-6的表达量降低、TNF-a的表达量降低中的一种或几种。
在本发明的一些应用实施方式中，所述酰胺类局部麻醉类药物包括盐酸罗哌卡因、盐酸布比卡因、盐酸利多卡因中的一种。
通过试验能够观察到样品中施加非戈替尼后，细胞凋亡的情况得到减轻，样品细胞活力提高，样品细胞的p-STAT1和p-STAT2蛋白的表达量下降，样品的抗炎因子IL-10的表达量上升，样品的致炎因子IL-6和TNF-a因子的表达下降。
本发明另一方面提供了非戈替尼在制备用于治疗或预防与炎症反应相关的外周神经系统疾病和/或中枢神经系统疾病的药物中的应用。
局部麻醉类药物所致的神经毒性损伤，常表现为受损区域麻木、感觉异常、痉挛性和放射性烧灼样疼痛，严重时导致感觉缺失，甚至瘫痪，给患者带来不适。局麻药的神经损伤机制目前尚不明确，可能与细胞内钙超载、低电压依赖性钙通道(T型钙通道)、钙依赖性钙调蛋白激酶(CaMKⅡ)、p38MAPK、细胞凋亡等相关。Ⅰ-IFN与其受体IFNAR(分为IFNAR1和IFNAR2两种亚型)结合后，IFNAR磷酸化，同时激活JAK1和非受体络氨酸激酶TYK2，诱导转录因子STAT1和STAT2磷酸化激活化，STAT1和STAT2聚合形成二聚体，与IFN调节因子9(IRF9)形成STAT1-STAT2-IRF9三聚体复合物，该复合物转入细胞核，在细胞核中与IFN刺激反应元件(ISRE)结合，激活IFN刺激基因(ISGs)转录，由ISGs编码蛋白通过不同作用的机制，诱导炎症反应发生。发明人意外地发现，非戈替尼的JAK1-STAT信号通路阻断能够减轻炎症反应的发生，进而缓解局部麻醉类药物造成的神经细胞毒性损伤。
在本发明的一些应用实施方式中，所述中枢神经系统疾病包括由暴露于选自工业溶剂、重金属、药物或化疗剂组成的毒性化合物引起的神经损伤、药物引起的中枢神经毒性损伤、惊厥。
附图说明
图1是比较各组细胞活力的柱状图；
图2是各组细胞凋亡率的比较图；
图3是各组细胞STAT1、STAT2、p-STAT1、p-STAT2蛋白的表达图；
图4是各组细胞IL-6、IL-10、TNF-α含量图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1)实验材料
Filgotinib(非戈替尼)为美国Selleck Chemicals公司产品(批号S760501)，Ropivacaine(盐酸罗哌卡因)为英国阿斯利康公司产品(批号NAZL)，Annexin-APC/7-AAD试剂盒为南京凯基生物技术公司产品(批号20200103)，p-STAT1和p-STAT2抗体来自中国武汉Abclonal生物技术有限公司(p-STAT1批号：1000540，p-STAT2批号：LOT21155940101)；IL-6ELISA(批号：BWWE6KXLEX)、IL-10ELISA(批号：76ZTQQPFTN)、TNF-a(批号：BNTAU5UJAP)试剂盒来自中国武汉Elabscience生物技术有限公司。
2)实验方法
2-1)实验分组及处理方案
实验分为四组，培养标准为：将细胞注入含15％胎牛血清的DMEM/F12培养基，在37℃、5％CO2饱和湿度的条件下，培养箱培养，每2天更换培养基。标准组：取SH-SY5Y细胞按标准培养。非戈替尼组：用终浓度为5μM的非戈替尼细胞培养液培养SH-SY5Y细胞4h后按标准培养。盐酸罗哌卡因组：用3mM的盐酸罗哌卡因处理SH-SY5Y细胞4h后按标准培养。试验组：SH-SY5Y细胞预先用终浓度为3mM盐酸罗哌卡因和终浓度为5μM的非戈替尼细胞培养液处理4h，然后按标准培养培养。
2-2)MTT法细胞活力检测
各组按照处理方案在处理后，每孔加入10μl MTT，37℃培养4h；去培养基，加入150μl DMSO震荡10min；酶标仪测定各孔吸光值OD 568。以OD568对照组值与OD568空白对照值的差，与OD568对照组值得比值为100％。实验组细胞OD568值与OD568空白对照值之差，与对照组的比值为实验组细胞活力。
结果如图1所示。与标准组比较，非戈替尼组的细胞活力无统计学差异，盐酸罗哌卡因组及实验组的细胞活力显著降低，差异有统计学意义。与盐酸罗哌卡因组比较，试验组的细胞活力显著增加，差异有统计学意义(Mean±SD，n＝3)，aP<0.05vs标准组，bP<0.05vs试验组。
2-3)流式细胞仪检测细胞凋亡率
将4组SH-SY5Y细胞按细胞密度1×106/ml接种到6孔板，每孔1ml细胞悬液，5％CO2，37℃培养过夜。收集细胞，1200rpm，5min离心，去上清，加PBS重悬；用PBS将细胞润洗2次，1200rpm，5min；按照AnnexinV-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒操作说明进行：加入500μlBinding Buffer，重悬细胞；5μlAnnexinV-FITC混匀后加入5μl PI，混匀；室温避光反应5-15min后在流失细胞仪上检测细胞凋亡率。
结果如图2所示。标准组的细胞凋亡率为(4±0.05)％。与标准组比较，非戈替尼组的细胞凋亡率无统计学差异，盐酸罗哌卡因组及试验组细胞凋亡率显著增加，差异有统计学意义。与盐酸罗哌卡因组细胞比较，试验组细胞凋亡率显著显著降低，差异有统计学意义，(Mean±SD，n＝3)，aP<0.05vs标准组，bP<0.05vs试验组。
2-4)WB检测p-STAT1、p-STAT2蛋白的表达
将4组SH-SY5Y细胞接种在六孔细胞板中按照实验方案处理后，去上清，每孔加入1ml的4℃预冷的PBS共洗细胞三次后把细胞板置于冰上，每孔加入120μl含PMSF(0.1mM)的裂解液于冰上裂解30min后，将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。于4℃下12000rpm离心5min。将离心后的上清分装转移倒0.5ml的离心管中放于-20℃保存。取蛋白样品2μl用BCA试剂盒和DG-3022A酶标仪测定OD568，计算出样品蛋白浓度。各蛋白样本行沸水浴10min变性后，冷却至室温再放入-20℃保存。分别配制5％浓缩胶和12％分离胶，各样本取40μg总蛋白上样，加样后在80V电泳至溴酚蓝指示剂在浓缩胶与分离胶交界处成线状，改为恒压120v至溴酚蓝到凝胶底部。取出凝胶根据Marker切下目的条带，按照黑色板-纤维垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-纤维垫-白色板依次放好，放入转膜仪内，在转膜槽中加满电转液开始转膜。转膜条件为200mA转模时间为70min-120min.转模结束后，5％脱脂奶粉的TBST(封闭液)浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2h。用封闭液稀释相应的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育过夜。TBST充分洗涤PVDF膜。加入HRP标记二抗，1:50000稀释，室温摇床孵育2h。将ECL试剂中增强液与稳定的过氧化物酶溶液按1:1比例混匀，滴加工作液于PVDF膜上，反应数分钟待荧光带明显后，用滤纸吸去多余的底物液，覆上保鲜膜，X光胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影，冲洗胶片。用BandScan分析胶片灰度值。抗体浓度：GAPDH为1:1000，JAK1、STAT1、STAT2、p-JAK1、p-STAT1、p-STAT2为1:500。
结果如图3所示。各组细胞JAK1、STAT1、STAT2表达无统计学差异。与标准组细胞比较，非戈替尼组的细胞的p-JAK1、p-STAT1、p-STAT2蛋白均降低，盐酸罗哌卡因组p-JAK1、p-STAT1、p-STAT2蛋白均上调，实验组细胞p-JAK1、p-STAT1无统计学差异，p-STAT2表达增加。与盐酸罗哌卡因组比较，试验组的细胞p-JAK1、p-STAT1、p-STAT2表达均增加，差异有统计学意义，(Mean±SD，n＝3)，aP<0.05vs标准组，bP<0.05vs非戈替尼组，cP<0.05vs盐酸罗哌卡因组。
2-5)ELSA法检测TNF-α、IL-6、IL-10浓度
将4组SH-SY5Y细胞按照实验方案处理完后，3000rpm离心10min，收集上清检测。按照IL-6/IL-10/TNF-α的ELISA检测试剂盒实验步骤进行检测，分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl。37℃孵育90分钟。弃去孔内液体，每孔中加入生物素化抗体工作液100μl，37℃温育1小时。弃去液体，每孔加酶结合物工作液100μl，37℃温育30分钟。弃去孔内液体，每孔加显色剂(TMB)90μl，酶标板37℃避光孵育15分钟。加终止液50μl，终止反应。立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。根据标准品和OD值计算TNF-α、IL-6、IL-10浓度。
结果如图4所示。
测得IL-6含量：与标准组比较，非戈替尼组IL-6含量无统计学意义，盐酸罗哌卡因组、试验组IL-6含量增加；与盐酸罗哌卡因组比较，试验组IL-6含量降低。
测得IL-10含量：与标准组比较，非戈替尼组、试验组IL-10含量差异无统计学意义；与盐酸罗哌卡因组比较，试验组IL-10含量增加。
测得TNF-α含量：与标准组比较，非戈替尼组TNF-α含量无统计学意义，盐酸罗哌卡因组、试验组TNF-α含量增加；与盐酸罗哌卡因组比较，试验组的TNF-α含量降低，(Mean±SD，n＝3)，aP<0.05vs标准组，bP<0.05vs盐酸罗哌卡因组。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
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