拓扑替康与17β-雌二醇的药物组合物及其应用
阅读说明：本技术 拓扑替康与17β-雌二醇的药物组合物及其应用 (Medicinal composition of topotecan and 17 beta-estradiol and application thereof ) 是由 郭建丽 许建强 徐卫平 贺高红 包永明 闫志刚 代新英 于 2021-11-19 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种拓扑替康与17β-雌二醇的药物组合物及其应用,所述药物组合物包括拓扑替康和17β-雌二醇,所述拓扑替康与17β-雌二醇的药物组合物通过以下方法制备而成：称取拓扑替康和17β-雌二醇,以二甲基亚砜和/或乙醇分别溶解,配成拓扑替康浓度为50-100mmol/L,17β-雌二醇浓度为50-100mmol/L的贮存液,在-20℃下保存,制备得到拓扑替康与17β-雌二醇的药物组合物。该药物组合物在治疗乳腺癌中具有显著的协同效用,相比单一采用拓扑替康,提高了药物的疗效,降低了用药剂量,减少了副作用的发生。(The invention provides a pharmaceutical composition of topotecan and 17 beta-estradiol and application thereof, wherein the pharmaceutical composition comprises the topotecan and the 17 beta-estradiol, and the pharmaceutical composition of the topotecan and the 17 beta-estradiol is prepared by the following method: weighing topotecan and 17 beta-estradiol, dissolving with dimethyl sulfoxide and/or ethanol respectively to prepare stock solution with topotecan concentration of 50-100mmol/L and 17 beta-estradiol concentration of 50-100mmol/L, and storing at-20 ℃ to prepare the pharmaceutical composition of topotecan and 17 beta-estradiol. The pharmaceutical composition has remarkable synergistic effect in treating breast cancer, and compared with the single use of topotecan, the pharmaceutical composition improves the curative effect of the drug, reduces the dosage and reduces the occurrence of side effects.)
技术领域
本发明涉及药物组合物技术，尤其涉及一种拓扑替康与17β-雌二醇的药物组合物及其应用。
背景技术
2020年全球癌症统计数据显示，2020年全球发生了1930万新癌症病例和近1000万癌症死亡病例，该统计数据显示女性乳腺癌首次超过肺癌成为最常见的癌症，因此，乳腺癌的治疗成为亟待解决的问题。目前乳腺癌的治疗方法主要有手术、放疗及化疗，其中最常用的还是化疗。拓扑替康就是化疗药物中功不可没的一份子。拓扑替康(TPT)是一种半合成的水溶性植物碱化物，该药物的靶点是Topo I，其通过与Topo I及DNA形成三重复合物来抑制Topo I对断裂的DNA的重新连接，进而导致大量的DNA单链损伤，诱导细胞死亡。目前，该药物已广泛应用于实体瘤的二线治疗。拓扑替康一直被用作二线药物，主要是因为它的缺点限制了其临床上的应用范围。拓扑替康一大缺点：对肿瘤细胞的选择性差，拓扑替康属于周期特异性药物，它会导致细胞周期阻滞在S期，属于DNA毒性药物，对所有的发生DNA复制的细胞，包括正常细胞都具有杀伤作用，因此，会产生极大的毒副作用。拓扑替康的第二大缺点：作用靶点很单一，肿瘤细胞易对其产生耐药性。
发明内容
本发明的目的在于，针对目前拓扑替康毒副作用大、易产生耐药性的问题，提出一种拓扑替康与17β-雌二醇的药物组合物，该药物组合物在治疗乳腺癌中具有显著的协同效果，相比单一采用拓扑替康，提高了药物的疗效，降低了用药剂量，减少了副作用的发生。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种拓扑替康与17β-雌二醇的药物组合物，包括拓扑替康和17β-雌二醇。
其中，拓扑替康、17β-雌二醇的结构式如Ⅰ、Ⅱ所示。
进一步地，通过以下方法制备而成：称取拓扑替康和17β-雌二醇，以二甲基亚砜和/或乙醇分别溶解，配成拓扑替康浓度为50-100mmol/L，17β-雌二醇浓度为50-100mmol/L的贮存液，在-20℃下保存，制备得到拓扑替康与17β-雌二醇的药物组合物。
进一步地，所述拓扑替康与17β-雌二醇的摩尔比为0.03～2:1，优选的摩尔比为0.26～2:1。
进一步地，药物组合物中拓扑替康与17β-雌二醇的浓度分别为0.3～25μM和5～30μM，优选的浓度分别为1.56～13μM和6～25μM。
进一步地，所述拓扑替康与17β-雌二醇的稀释溶剂为二甲基亚砜或乙醇。
本发明的另一个目的还公开了一种拓扑替康与17β-雌二醇的药物组合物在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
进一步地，所述拓扑替康与17β-雌二醇的药物组合物的给药顺序为同时给药。
进一步地，所述拓扑替康与17β-雌二醇的药物组合物的给药时间为24-72小时。
本发明拓扑替康与17β-雌二醇的药物组合物，与现有技术相比较具有以下优点：
1)本发明能提高拓扑替康的药效，同时减少其毒副作用，本发明利用其与其他低毒药物进行联合，从而达到减毒增效的效果。
2)雌二醇是一种甾体雌激素，是由卵巢成熟滤泡分泌的一种自然雌激素，具有包括治疗癌症在内的多种药效。但由于其是内分泌系统用药，长期大剂量使用会引起很多副作用，如乳房疼痛、体重增加、高血压等。但雌二醇单药抗癌作用较弱，使用高剂量的雌二醇才会能起到抗癌效果，使用雌二醇单药抗癌并不现实。因此，本发明通过联合用药的方式，充分利用其毒性低，价格低廉，且具有抗癌作用的优势，来提高化疗药物的药效的同时减少其毒副作用。
综上，本发明的拓扑替康与17β-雌二醇的药物组合物在治疗乳腺癌中具有显著的协同效用，降低了用药剂量，提高了药物的疗效，减少了副作用的发生。
附图说明
图1为拓扑替康单药作用48小时对MCF7细胞增殖的影响；
图2为17β-雌二醇单药作用48小时对MCF7细胞增殖的影响；
图3为不同浓度的拓扑替康与17β-雌二醇联合作用48小时对MCF7细胞增殖的影响。其中：显著性分析是以每组只加拓扑替康药物为对照，若P<0.01，则为极显著，表示为“**”。
各图中，TPT表示拓扑替康，Estradiol表示17β-雌二醇。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的阐述，但本发明并不受限于此，在不脱离本发明的思想和宗旨的情况下，对本发明的技术方案所做的任何变化都应落入本发明权利要求书所限定的范围内。
实施例1-3中所用的生物材料、药品和实验方法如下：
细胞：MCF-7(人乳腺癌细胞株)可从商业途径中获得。
药品：准确称量拓扑替康和17β-雌二醇，以二甲基亚砜或乙醇分别溶解，配成拓扑替康浓度为50-100mmol/L，17β-雌二醇浓度为50-100mmol/L的贮存液在-20℃下保存，使用时用新鲜的培养基稀释到合适的浓度，实施例1-3中使用的培养基为DMEM高糖培养基。
噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖：细胞于含体积比为5％-20％胎牛血清、80-120kU/L青霉素、80-120mg/L链霉素的DMEM高糖培养基中，37℃、体积比为5％CO2的条件下培养。将细胞用胰酶消化后，用血细胞计数板进行计数。按每孔100-200μL体积接种于96孔细胞培养板(细胞接种量8000-10000个/孔，根据细胞大小和生长速度选择)，体积比为5％CO2、37℃培养箱中培养12-36小时后加入不同浓度梯度的拓扑替康、17β-雌二醇单药或合药，体积比为5％CO2、37℃培养箱中孵育24-72小时。弃去培养基，用PBS洗一次，而后每孔加入含有0.4-1.0mg/mL MTT的无血清培养基100-200μL，体积比为5％CO2、37℃培养箱中孵育4-6小时。将96孔板孔内的培养基吸去，然后每孔加入100-200μL二甲基亚砜。用酶标仪进行检测，检测波长为570nm，参考波长为630nm。
两药联合使用时可能会出现三种不同的情况：协同作用、相加作用或拮抗作用。本发明中采用的评判标准是Chou和Talalay提出的合用指数法(Combinational index，CI)。当CI值＜1时，表示两种药物联用是协同作用；当CI值＝1时，表示两种药物联用是相加作用；当CI＞1时，表示两种药物联用是拮抗作用。
以下结合实施例对本发明进一步说明：
实施例1
本实施例提供了一种抗乳腺癌的药物组合物，具体步骤如下：
(1)MTT检测拓扑替康和17β-雌二醇单药对MCF7细胞增殖的影响：MCF-7细胞于含10％胎牛血清、100kU/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM高糖培养基中，37℃、体积比为5％CO2的条件下培养。将细胞用胰酶消化后，用血细胞计数板进行计数。按每孔100μL体积接种于96孔细胞培养板(细胞接种量8000-10000个/孔，根据细胞大小和生长速度选择)，体积比为5％CO2、37℃培养箱中培养24小时后加入不同浓度梯度的拓扑替康和17β-雌二醇单药，体积比为5％CO2、37℃培养箱中孵育48小时。弃去培养基，用PBS洗一次，而后每孔加入含有0.5mg/mL MTT的无血清培养基100μL，体积比为5％CO2、37℃培养箱中孵育4小时。将96孔板孔内的培养基吸去，然后每孔加入100μL二甲基亚砜。用酶标仪进行检测，检测波长为570nm，参考波长为630nm。根据该波长下的吸光度值计算拓扑替康和17β-雌二醇单药对MCF7细胞增殖的影响，结果显示拓扑替康与17β-雌二醇单药均对MCF7细胞具有抑制作用，拓扑替康单药对MCF7作用48小时后的半数致死浓度为10.86±2.81μM，17β-雌二醇单药对MCF7作用48小时后的半数致死浓度为29.21±2.10μM，详见附图1和2。
(2)MTT法检测6.25μM 17β-雌二醇与不同浓度拓扑替康联用对MCF7细胞增殖的影响：MCF-7细胞于含10％胎牛血清、100kU/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM高糖培养基中，37℃、体积比为5％CO2的条件下培养。将细胞用胰酶消化后，用血细胞计数板进行计数。按每孔100μL体积接种于96孔细胞培养板(细胞接种量8000-10000个/孔，根据细胞大小和生长速度选择)，体积比为5％CO2、37℃培养箱中培养24小时后加入终浓度为6.25μM的17β-雌二醇和终浓度为3.13-25μM的拓扑替康的药物组合，体积比为5％CO2、37℃培养箱中孵育48小时。弃去培养基，用PBS洗一次，而后每孔加入含有0.5mg/mL MTT的无血清培养基100μL，体积比为5％CO2、37℃培养箱中孵育4小时。将96孔板孔内的培养基吸去，然后每孔加入100μL二甲基亚砜。用酶标仪进行检测，检测波长为570nm，参考波长为630nm。根据该波长下的吸光度值，以及合用指数的计算方法计算6.25μM 17β-雌二醇和拓扑替康的联用效果。结果显示6.25μM 17β-雌二醇和3.13-25μM的拓扑替康对MCF7细胞联合作用48小时后的结果详见附图3，其合用指数CI值为0.35-0.75，均小于1，此时两药联合使用具有协同作用。
实施例2
本实施例提供了一种抗乳腺癌药物组合物，具体步骤如下：
(1)MTT检测拓扑替康和17β-雌二醇单药对MCF7细胞增殖的影响：MCF-7细胞于含10％胎牛血清、100kU/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM高糖培养基中，37℃、体积比为5％CO2的条件下培养。将细胞用胰酶消化后，用血细胞计数板进行计数。按每孔100μL体积接种于96孔细胞培养板(细胞接种量8000-10000个/孔，根据细胞大小和生长速度选择)，5％CO2、37℃培养箱中培养24小时后加入不同浓度梯度的拓扑替康和17β-雌二醇单药，体积比为5％CO2、37℃培养箱中孵育48小时。弃去培养基，用PBS洗一次，而后每孔加入含有0.5mg/mL MTT的无血清培养基100μL，体积比为5％CO2、37℃培养箱中孵育4小时。将96孔板孔内的培养基吸去，然后每孔加入100μL二甲基亚砜。用酶标仪进行检测，检测波长为570nm，参考波长为630nm。根据该波长下的吸光度值计算拓扑替康和17β-雌二醇单药对MCF7细胞增殖的影响，结果显示拓扑替康与17β-雌二醇单药均对MCF7细胞具有抑制作用，拓扑替康单药对MCF7作用48小时后的半数致死浓度为10.86±2.81μM，17β-雌二醇单药对MCF7作用48小时后的半数致死浓度为29.21±2.10μM，详见附图1和2。
(2)MTT法检测12.5μM 17β-雌二醇与不同浓度拓扑替康联用对MCF7细胞增殖的影响：MCF-7细胞于含10％胎牛血清、100kU/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM高糖培养基中，37℃、体积比为5％CO2的条件下培养。将细胞用胰酶消化后，用血细胞计数板进行计数。按每孔100μL体积接种于96孔细胞培养板(细胞接种量8000-10000个/孔，根据细胞大小和生长速度选择)，体积比为5％CO2、37℃培养箱中培养24小时后加入终浓度为12.5μM的17β-雌二醇和终浓度为0.78-25μM的拓扑替康的药物组合，体积比为5％CO2、37℃培养箱中孵育48小时。弃去培养基，用PBS洗一次，而后每孔加入含有0.5mg/mL MTT的无血清培养基100μL，体积比为5％CO2、37℃培养箱中孵育4小时。将96孔板孔内的培养基吸去，然后每孔加入100μL二甲基亚砜。用酶标仪进行检测，检测波长为570nm，参考波长为630nm。根据该波长下的吸光度值，以及合用指数的计算方法计算12.5μM 17β-雌二醇和拓扑替康的联用效果。结果显示12.5μM 17β-雌二醇和0.78-25μM的拓扑替康对MCF7细胞联合作用48小时后的结果详见附图3，其合用指数CI值为0.15-0.56，均小于1，此时两药联合使用具有协同作用。
实施例3
本实施例提供了一种抗乳腺癌药物组合物，具体步骤如下：
(1)MTT检测拓扑替康和17β-雌二醇单药对MCF7细胞增殖的影响：MCF-7细胞于含10％胎牛血清、100kU/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM高糖培养基中，37℃、体积比为5％CO2的条件下培养。将细胞用胰酶消化后，用血细胞计数板进行计数。按每孔100μL体积接种于96孔细胞培养板(细胞接种量8000-10000个/孔，根据细胞大小和生长速度选择)，体积比为5％CO2、37℃培养箱中培养24小时后加入不同浓度梯度的拓扑替康和17β-雌二醇单药，体积比为5％CO2、37℃培养箱中孵育48小时。弃去培养基，用PBS洗一次，而后每孔加入含有0.5mg/mL MTT的无血清培养基100μL，体积比为5％CO2、37℃培养箱中孵育4小时。将96孔板孔内的培养基吸去，然后每孔加入100μL二甲基亚砜。用酶标仪进行检测，检测波长为570nm，参考波长为630nm。根据该波长下的吸光度值计算拓扑替康和17β-雌二醇单药对MCF7细胞增殖的影响，结果显示拓扑替康与17β-雌二醇单药均对MCF7细胞具有抑制作用，拓扑替康单药对MCF7作用48小时后的半数致死浓度为10.86±2.81μM，雌二醇单药对MCF7作用48小时后的半数致死浓度为29.21±2.10μM，详见附图1和2。
(2)MTT法检测25μM 17β-雌二醇与不同浓度拓扑替康联用对MCF7细胞增殖的影响：MCF-7细胞于含10％胎牛血清、100kU/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM高糖培养基中，37℃、体积比为5％CO2的条件下培养。将细胞用胰酶消化后，用血细胞计数板进行计数。按每孔100μL体积接种于96孔细胞培养板(细胞接种量8000-10000个/孔，根据细胞大小和生长速度选择)，体积比为5％CO2、37℃培养箱中培养24小时后加入终浓度为25μM的17β-雌二醇和终浓度为0.78-25μM的拓扑替康的药物组合，体积比为5％CO2、37℃培养箱中孵育48小时。弃去培养基，用PBS洗一次，而后每孔加入含有0.5mg/mL MTT的无血清培养基100μL，体积比为5％CO2、37℃培养箱中孵育4小时。将96孔板孔内的培养基吸去，然后每孔加入100μL二甲基亚砜。用酶标仪进行检测，检测波长为570nm，参考波长为630nm。根据该波长下的吸光度值，以及合用指数的计算方法计算25μM 17β-雌二醇和拓扑替康的联用效果。结果显示25μM 17β-雌二醇和0.78-25μM的拓扑替康对MCF7细胞联合作用48小时后的结果详见附图3，其合用指数CI值为0.12-0.62，均小于1，此时两药联合使用具有协同作用。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。