十味香鹿胶囊人参皂苷含量分析方法
阅读说明：本技术 十味香鹿胶囊人参皂苷含量分析方法 (Method for analyzing ginsenoside content of ten-ingredient xianglu capsules ) 是由 张辉 吴楠 杜延佳 李晶峰 李志成 边学峰 吕金朋 张凯月 兰梦 高旭 于 2019-11-29 设计创作，主要内容包括：十味香鹿胶囊人参皂苷含量分析方法,属于中药配方技术领域,本发明充分发挥各味中药的价值,具有疏肝解郁,软坚散结等功效,其中人参的药效物质基础是人参皂苷,其对垂体－性腺轴的神经内分泌功能具有调节作用,能兴奋垂体分泌促性腺激素,促进DNA和蛋白质合成相关酶蛋白的生物合成,使性腺活性增加,通过对垂体－性腺轴的双向调节作用,平衡神经内分泌的正负反馈功能以达到降低异常增高的雌二醇的目的,并使卵巢激素控制的乳腺细胞增生得到抑制；采用一测多评的方式选择中药的内在成分作为内标,并通过测量与其它待测成分之间的相对校正因子RCF,计算待测成分的含有量,从而减少对照品的使用量,节约了成本。(The invention relates to a method for analyzing the content of ginsenoside in Shiwei Xianglu capsules, which belongs to the technical field of traditional Chinese medicine formulas, fully exerts the value of each traditional Chinese medicine, and has the effects of soothing liver, relieving depression, softening hardness, dissipating stagnation and the like, wherein the drug effect substance of ginseng is ginsenoside which has the function of regulating neuroendocrine function of pituitary-gonadal axis, can excite the pituitary to secrete gonadotropin, promote the biosynthesis of DNA and protein synthesis related enzyme protein, increase the activity of gonadal, balance the positive and negative feedback function of neuroendocrine through the bidirectional regulation function of pituitary-gonadal axis so as to achieve the purpose of reducing abnormally increased estradiol, and inhibit hyperplasia of mammary gland cells controlled by ovarian hormone; the internal components of the traditional Chinese medicine are selected as internal standards in a one-test and multi-evaluation mode, and the content of the components to be tested is calculated by measuring the relative correction factor RCF between the internal standard and other components to be tested, so that the use amount of a reference substance is reduced, and the cost is saved.)
本案为201911198034.5的分案申请
技术领域
本发明属于中药配方技术领域，特别是涉及到一种用于调节乳腺增生的中药及其功效的验证方法。
背景技术
乳腺增生病(Hmg)属于中医“乳痛”范畴，本病的发生发展的基础原因在于三大脏腑功能失调-肝郁、脾虚、肾虚，外在表现为痰凝，气滞，血瘀。现有的治疗方药主要成分有柴胡、浙贝母、当归、薄荷、茯苓、青皮、白术、夏枯草、白芍、郁金以及炙甘草，黄连、黄芩、穿山甲、鳖甲、牡丹皮、川芎丹参、三菱、金银花、连翅、莪术、薏苡仁以及干姜，桃红四物汤原方采用活血大法在主方基础上加用柴胡、当归、川芎等药物，或散结止痛大法自拟方剂，主要药物有柴胡、郁金、白芍、延胡索、夏枯草、锻牡蛎以及浙贝母；相关内服外敷中药组分种类繁多，但治愈效果不明显，或周期长；因此现有技术中，亟需一种新的技术方案来解决这一问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供十味香鹿胶囊及其制备方法和人参皂苷含量分析方法，充分发挥各味中药的价值，具有疏肝解郁，软坚散结等功效，可使乳腺腺泡腔缩小，小叶和腺泡数目减少及降低雌二醇的作用，主治肝郁兼痰凝证所致乳腺疾病。
十味香鹿胶囊，其特征是：按质量分数比包括香附10～30份、薤白2～6份、鹿角脱盘2～6份、浙贝母2～6份、莪术2～6份、蜈蚣、天冬2～6份、鳖甲2～6份、生晒参2～6份以及桔梗1～3份。
十味香鹿胶囊的制备方法，其特征是：制备所述的十味香鹿胶囊，包括以下步骤，且以下步骤顺次进行，
步骤一、按照权利要求1所述配比，取蜈蚣和配方中0.5倍量的生晒参粉碎成粒径大小为150～180μm的细粉；
步骤二、按照权利要求1所述配比，取香附、莪术以及薤白，加入4倍药材量的水蒸气蒸馏6小时获得挥发油，将挥发油以β－环糊精包合备用，蒸馏后剩余水溶液和药渣分别收集留存；
步骤三、按照权利要求1所述配比，取鹿角脱盘和鳖甲，加入6倍药材量水煎煮6小时，获得煎液和药渣分别收集留存；
步骤四、按照权利要求1所述配比，取浙贝母、天冬、桔梗及配方中剩余0.5倍量生晒参与步骤二和步骤三获得的药渣合并，加入4倍药材量水煎煮3次，每次2h，获得煎液与步骤二获得的水溶液和步骤三获得的煎液合并，滤过，浓缩至80℃条件下，相对密度1.21～1.25，加乙醇，使含醇量达70％；静置24小时，滤过，滤液回收乙醇，缩至稠膏；
步骤五、在步骤四获得的稠膏中加入步骤一获得的人参蜈蚣细粉，干燥后粉碎为粒径大小为150～180μm的细粉，与步骤二中制备的挥发油包合物混合，装胶囊，制备十味香鹿胶囊成品。
十味香鹿胶囊人参皂苷含量分析方法，其特征是：对制备的十味香鹿胶囊成品进行人参皂苷含量测定，包括以下步骤，且以下步骤顺次进行，
步骤一、制备对照品溶液
精密称取人参皂苷Rb1对照品2.04mg、人参皂苷Rb3对照品2.04mg、人参皂苷Re对照品2.02mg、人参皂苷Rf对照品2.02mg以及人参皂苷Rg1对照品2.01mg，加入甲醇溶解，定容至10ml容量瓶内，混合备用；
步骤二、制备供试品溶液
取十味香鹿胶囊成品粉末过65目筛，精密称量1.0002g至50mLEP管中，加30mL甲醇，在功率250W，频率50kHz的条件下，超声振荡1h，过滤后蒸干，蒸干物溶于20mL水中，用20mL二氯甲烷、乙酸乙酯依次萃取3次，再以水饱和正丁醇20mL萃取3次，合并上层萃取液，蒸干，加适量甲醇溶解，并定容至5mL容量瓶备用；
步骤三、缺人参阴性样品溶液
将蜈蚣研磨成细粉状，精密称定1.0025g，备用；取香附50.0028g、莪术30.0124g、薤白30.0113g，添加4倍量的水，水蒸气蒸馏法提取挥发油6h，得到挥发油溶液，备用，蒸馏后的水溶液另器收集；取鹿角脱盘3.0122g、鳖甲3.0024g加6倍药材量水煎煮6h，煎液另器收集；将浙贝母6.0241g、天冬6.0125g、桔梗3.0026g与上述药渣合并，加4倍药材量水煎煮3次，每次2h，过滤，滤液与所述另器收集的水溶液和另器收集煎液合并，在80℃条件下，浓缩至相对密度1.21～1.25，加无水乙醇，使其含醇量达70％，静置24h，滤过，浓缩至稠膏，加上述蜈蚣细粉；置通风处干燥、研磨成细粉，与所述挥发油混匀备用；
步骤四、系统适应性试验
色谱条件为：采用Agilent EC-C18色谱柱4.6mm×150mm，2.7μm；流动相为乙腈A-水B，梯度洗脱为0～60min，19％A；60～120min，30％～50％A；流速为0.5mL/min；柱温为25℃；检测波长为203nm；在所述色谱条件下，注入3μL步骤一获得的对照品溶液，步骤二获得的供试品溶液以及步骤三获得的缺人参阴性样品溶液；
步骤五、线性关系试验
分别取步骤一获得的对照品溶液1μL、2μL、4μL、6μL、8μL、10μL，在步骤四所述的色谱条件下测定，以对照品质量浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y计算各成分的线性回归方程与线性范围；
步骤六、加样回收率试验
取十味香鹿胶囊样品，研成细粉，平行6次精密称定分别为0.2004g、0.2008g、0.2006g、0.2004g、0.2003g、0.2002g，按1:1比例计算精密添加步骤一制备的对照品溶液；取步骤二制备6份供试品溶液，按步骤四中色谱条件测定供试品溶液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1以及人参皂苷Rb3的峰面积，计算平均加样回收率值和相对平均偏差RSD值；
步骤七、相对校正因子的计算
吸取步骤一制备的对照品溶液，以步骤四的色谱条件进行测定，以人参皂苷Rb1为内标，采用斜率法和多点校正法计算人参皂苷之间的相对校正因子RCF，
斜率法计算公式：fi/s＝ki/ks，
其中，f为相对校正因子，k为斜率，i为待测成分，s为内标物Rb1；
多点校正法计算公式：f＝fi/fs＝(Ai/Ci)/(As/Cs)
其中，Ai为待测成分的峰面积，Ci为待测成分的浓度，单位为μg/μL；As为Rb1的峰面积，Cs为Rb1的浓度，单位为μg/μL；
步骤八、定位参数测定及重复性考察
以人参皂苷Rb1为内标，通过公式RTRi/s＝tRi/tRs，计算人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb3的相对保留值RTRi/s，其中tRi为待测成分的保留时间，tRs为Rb1的保留时间。
通过上述设计方案，本发明可以带来如下有益效果：十味香鹿胶囊及其制备方法和人参皂苷含量分析方法，使乳腺腺泡腔缩小，小叶和腺泡数目减少及降低雌二醇的作用，其中人参的药效物质基础是人参皂苷，其对垂体－性腺轴的神经内分泌功能具有调节作用，能兴奋垂体分泌促性腺激素，促进DNA和蛋白质合成相关酶蛋白的生物合成，使性腺活性增加，通过对垂体－性腺轴的双向调节作用，平衡神经内分泌的正负反馈功能以达到降低异常增高的雌二醇的目的，并使卵巢激素控制的乳腺细胞增生得到抑制；由于对照品在质量控制中的稀缺性与昂贵性，采用一测多评的方式选择中药的内在成分作为内标，并通过测量与其它待测成分之间的相对校正因子RCF，计算待测成分的含有量，从而减少对照品的使用量，节约了成本。
附图说明
以下结合附图和
具体实施方式
对本发明作进一步的说明：
图1为本发明十味香鹿胶囊及其制备方法和人参皂苷含量分析方法系统适应性试验对照品溶液HPLC色谱图。
图2为本发明十味香鹿胶囊及其制备方法和人参皂苷含量分析方法系统适应性试验供试品溶液HPLC色谱图。
图3为本发明十味香鹿胶囊及其制备方法和人参皂苷含量分析方法系统适应性试验缺人参样品溶液HPLC色谱图。
具体实施方式
十味香鹿胶囊，按照质量份数比，包括香附10～30份、薤白2～6份、鹿角脱盘2～6份、浙贝母2～6份、莪术2～6份、蜈蚣、天冬2～6份、鳖甲(炙)2～6份、生晒参2～6份以及桔梗1～3份。其最佳比例为香附10份、薤白6份、鹿角脱盘6份、浙贝母6份、莪术6份、蜈蚣1份、天冬6份、鳖甲(炙)6份、人参6份以及桔梗3份。
十味香鹿胶囊的制备方法，包括以下步骤，且以下步骤顺次进行，
步骤一、按照权利要求1所述配比，取蜈蚣和配方中0.5倍量的生晒参粉碎成粒径大小为150～180μm的细粉；
步骤二、按照权利要求1所述配比，取香附、莪术以及薤白，加入4倍药材量的水蒸气蒸馏6小时获得挥发油，将挥发油以β－环糊精包合备用，蒸馏后剩余水溶液和药渣分别收集留存；
步骤三、按照权利要求1所述配比，取鹿角脱盘和鳖甲，加入6倍药材量水煎煮6小时，获得煎液和药渣分别收集留存；
步骤四、按照权利要求1所述配比，取浙贝母、天冬、桔梗及配方中剩余0.5倍量的生晒参与步骤二和步骤三获得的药渣合并，加入4倍药材量水煎煮3次，每次2h，获得煎液与步骤二获得的水溶液和步骤三获得的煎液合并，滤过，浓缩至80℃条件下，相对密度1.21～1.25，加乙醇，使含醇量达70％；静置24小时，滤过，滤液回收乙醇，缩至稠膏；
步骤五、在步骤四获得的稠膏中加入步骤一获得的人参蜈蚣细粉，干燥后粉碎为粒径大小为150～180μm的细粉，与步骤二中制备的挥发油包合物混合，装胶囊，制备十味香鹿胶囊成品。
本发明配方中人参的药效物质基础是人参皂苷，其对垂体－性腺轴的神经内分泌功能具有调节作用，能兴奋垂体分泌促性腺激素，促进DNA和蛋白质合成相关酶蛋白的生物合成，使性腺活性增加，通过对垂体－性腺轴的双向调节作用，平衡神经内分泌的正负反馈功能以达到降低异常增高的雌二醇的目的，并使卵巢激素控制的乳腺细胞增生得到抑制。因此，建立与本品药效相关的人参皂苷质量控制方法具有重要意义。十味香鹿胶囊标准制定了人参、莪术、蜈蚣、浙贝母的薄层色谱鉴别，浙贝母中贝母素甲的含量测定，人参中人参皂苷Rb1、Re、Rg1的含量，但未进行一测多评。以下以人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3、人参皂苷Re、人参皂苷Rf和人参皂苷Rg1为测定指标，对十味香鹿胶囊进行一测多评质量控制增项分析。
十味香鹿胶囊人参皂苷含量分析方法，包括以下步骤，且以下步骤顺次进行，
步骤一、制备对照品溶液
精密称取人参皂苷Rb1对照品2.04mg、人参皂苷Rb3对照品2.04mg、人参皂苷Re对照品2.02mg、人参皂苷Rf对照品2.02mg以及人参皂苷Rg1对照品2.01mg，加入甲醇溶解，定容至10ml容量瓶内，混合备用；
步骤二、制备供试品溶液
取十味香鹿胶囊成品粉末过65目筛，精密称量1.0002g至50mLEP管中，加30mL甲醇，在功率250W，频率50kHz的条件下，超声振荡1h，过滤后蒸干，蒸干物溶于20ml水中，用20mL二氯甲烷、乙酸乙酯依次萃取3次，再以水饱和正丁醇20mL萃取3次，合并上层萃取液，蒸干，加适量甲醇溶解，并定容至5mL容量瓶备用；
步骤三、缺人参阴性样品溶液
将蜈蚣研磨成细粉状，精密称定1.0025g，备用；取香附50.0028g、莪术30.0124g、薤白30.0113g，添加4倍量的水，水蒸气蒸馏法提取挥发油6h，得到挥发油溶液，备用，蒸馏后的水溶液另器收集；取鹿角脱盘3.0122g、鳖甲3.0024g加6倍药材量水煎煮6h，煎液另器收集；将浙贝母6.0241g、天冬6.0125g、桔梗3.0026g与上述药渣合并，加4倍药材量水煎煮3次，每次2h，过滤，滤液与所述另器收集的水溶液和另器收集煎液合并，在80℃条件下，浓缩至相对密度1.21～1.25，加无水乙醇，使其含醇量达70％，静置24h，滤过，浓缩至稠膏，加上述蜈蚣细粉；置通风处干燥、研磨成细粉，与所述挥发油混匀备用；
步骤四、系统适应性试验
色谱条件为：采用Agilent EC-C18色谱柱4.6mm×150mm，2.7μm；流动相为乙腈A-水B，梯度洗脱为0～60min，19％A；60～120min，30％～50％A；流速为0.5mL/min；柱温为25℃；检测波长为203nm；在所述色谱条件下，注入3μL步骤一获得的对照品溶液，步骤二获得的供试品溶液以及步骤三获得的缺人参阴性样品溶液；其结果的HPLC色谱图如图1～图3所示，其中，1为人参皂苷Rg1，2为人参皂苷Re，3为人参皂苷Rf，4为人参皂苷Rb1，5为人参皂苷Rb3；
步骤五、线性关系试验
分别取步骤一获得的对照品溶液1μL、2μL、4μL、6μL、8μL、10μL，在步骤四所述的色谱条件下测定，以对照品质量浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y计算各成分的线性回归方程与线性范围，结果如下表1所示；
表1各人参皂苷线性关系
步骤六、精密度试验
取步骤一制备的对照品溶液，按步骤四中的色谱条件连续进样6次，测定人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3的峰面积值，计算得相对平均偏差RSD分别为1.23％、2.46％、1.42％、1.83％、1.79％，证明仪器的精密度良好；
步骤七、稳定性试验
取同一份步骤二制备的供试品溶液，按步骤四中的色谱条件分别于0h、3h、6h、9h、12h、24h进样，测定人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3的峰面积，计算得相对平均偏差RSD分别为1.49％、1.04％、1.39％、1.36％、1.75％，证明十味香鹿胶囊供试品溶液在24h内较稳定；
步骤八、重复性试验
取十味香鹿胶囊样品，在步骤二的方法下平行制备6份，按步骤四中的色谱条件测定人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3的含有量，计算得相对平均偏差RSD分别为1.82％、1.43％、1.89％、2.00％、1.92％，证明本方法重复性良好；
步骤九、加样回收率试验
取十味香鹿胶囊样品，研成细粉，平行6次精密称定分别为0.2004g、0.2008g、0.2006g、0.2004g、0.2003g、0.2002g，按1:1比例计算精密添加步骤一制备的对照品溶液；取步骤二制备6份供试品溶液，按步骤四中色谱条件测定供试品溶液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1以及人参皂苷Rb3的峰面积，计算平均加样回收率值和相对平均偏差RSD值，结果如下表2所示，
表2各人参皂苷加样回收率试验结果(n＝6)
步骤十、相对校正因子的计算
吸取步骤一制备的对照品溶液，以步骤四的色谱条件进行测定，以人参皂苷Rb1为内标，采用斜率法和多点校正法计算人参皂苷之间的相对校正因子RCF，
斜率法计算公式：fi/s＝ki/ks，
其中，f为相对校正因子，k为斜率，i为待测成分，s为内标物Rb1；
多点校正法计算公式：f＝fi/fs＝(Ai/Ci)/(As/Cs)
其中，Ai为待测成分的峰面积，Ci为待测成分的浓度，单位为μg/μL；As为Rb1的峰面积，Cs为Rb1的浓度，单位为μg/μL；
上述两种方法的相对误差RE均小于3.0％，结果如下表3所示，
表3各人参皂苷相对校正因子
步骤十一、定位参数测定及重复性考察
以人参皂苷Rb1为内标，通过公式RTRi/s＝tRi/tRs，计算人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb3的相对保留值RTRi/s，其中tRi为待测成分的保留时间，tRs为Rb1的保留时间，结果如下表4所示，
表4各人参皂苷的相对保留值(n＝6)
同时，本发明十味香鹿胶囊及其制备方法和人参皂苷含量分析方法还进行耐用性考察，吸取步骤一制备的对照品溶液适量，在步骤四所述的谱条件下进样测定，采用多点校正法考察Agilent 1260色谱仪、Agilent 1100Series色谱仪和Agilent EC-C18色谱柱、Zorbax SB-C18色谱柱、Extend-C18色谱柱对相对校正因子的影响，结果如下表5所示，可知均无明显影响；
表5不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响
待测组分色谱峰定位，通过步骤十一的算法，验证其他4种成分在不同色谱仪、色谱柱下的相对保留值，结果如下表6所述，可知均无明显影响；
QAMS(一测多评法)和ESM(外标法)测定结果比较按步骤四所述的色谱条件，采用QAMS和ESM分别测定十味香鹿胶囊的5种成分。结果如下表7所示，
表7一测多评法与外标法所得结果比较(n＝6)
本发明十味香鹿胶囊及其制备方法和人参皂苷含量分析方法通过对十味香鹿胶囊中多种人参皂苷含量的测定，建立了一个操作简单，结果可靠的一测多评方法，解决了人参皂苷对照品缺失与昂贵等问题。试验以人参皂苷Rb1为内标，通过人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb3相对校正因子计算其含有量。结果发现，该方法所得结果与外标法相比无显著性差异。本分析方法补充了十味香鹿胶囊多药效成分的质量评价方法，更加有效地控制产品质量。