检测藏红花素的试剂盒及其方法
阅读说明：本技术 检测藏红花素的试剂盒及其方法 (Kit for detecting crocin and method thereof ) 是由 王秀娟 陈凤明 袁真 冯峰 于 2021-09-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了检测藏红花素的方法和试剂盒。该方法包括：将待测样本进行提取处理,以便得到提取液；以及利用色谱-串联质谱对所述提取液进行检测,以便获得所述藏红花素的含量。该方法利用色谱-串联质谱进行检测,能对藏红花素进行定量检测,检测的准确度和灵敏度高。(The invention discloses a method and a kit for detecting crocin. The method comprises the following steps: extracting a sample to be detected to obtain an extracting solution; and detecting the extracting solution by using a chromatography-tandem mass spectrum so as to obtain the content of the crocin. The method can be used for quantitative detection of crocin by using chromatography-tandem mass spectrometry, and has high detection accuracy and sensitivity.)
技术领域
本发明涉及分析化学领域，具体地，涉及检测藏红花素的方法，以及检测藏红花素的试剂盒。
背景技术
藏红花又称西红花、番红花，为鸢尾科植物番红花Crocus sativus L.的干燥柱头，具有活血化瘀，凉血解毒，解郁安神之功效。而作为藏红花的主要活性物质，藏红花素，是由藏红花酸与不同数量的糖苷结合的一系列酯苷，具有中枢降压，防止动脉粥硬化、预防宫颈癌的作用。因为其强大的药理作用，藏红花的市场需求越来越高，而市面上藏红花的品质良莠不齐，以次充好的现象频发。
现有技术中检测藏红花素的方法包括:日本药典-JP16、英国药典-BP2013以及ISO-3632,均采取紫外-可见分光光度法定量藏红花素在藏红花中的含量。但上述方法难以对藏红花素进行准确的定量检测。
由此，对藏红花素进行定量检测的方法有待研究。
但大都未见直接用质谱和色谱对样品进行定性定量，且由于藏红花素为极性较大的物质，本身在质谱中的检出信号较低以及色谱中的保留较困难，故而更应该开发出一种针对藏红花素的液质联用的测定方法。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种检测藏红花素的方法，该方法利用色谱-串联质谱进行检测，能对藏红花素进行定量检测，检测的准确度和灵敏度高。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：
由于藏红花素为极性较大的物质，本身在质谱中的检出信号较低，并且在色谱中的保留较困难，现通常采用紫外-可见分光光度法，难以用色谱-串联质谱对其进行检测。藏红素在质谱中体现为Na+离子峰，根据其对称性以及极性，加酸或者碱性条件均不能提高其检测灵敏度，只有加大样品或者标品本身的量才能解决质谱响应不好的问题；对于色谱而言，通常使用的C18柱并不能够对极性物质进行很好的保留，需使用相应的极性柱，本发明所用的色谱柱为UPLC HSS T3色谱柱。
因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种检测藏红花素的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将待测样本进行提取处理，以便得到提取液；以及利用色谱-串联质谱对所述提取液进行检测处理，以便获得所述藏红花素的含量。
根据本发明实施例的检测藏红花素的方法，利用色谱-串联质谱进行检测，能对藏红花素进行定量检测，检测的准确度和灵敏度高。
另外，根据本发明上述实施例的检测藏红花素的方法，还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的实施例，所述提取处理包括：将所述待测样本与提取溶剂混合，以便混合物；将所述混合物进行超声提取，以便得到超声提取液；以及将所述超声产物进行离心处理，提取上清，所述上清为所述提取液。
根据本发明的实施例，所述提取溶剂为乙醇水溶液，优选地，为50体积％乙醇水溶液。
根据本发明的实施例，所述超声提取的温度条件为35～50℃条件下，时间条件为30-50分钟。
根据本发明的实施例，所述色谱-串联质谱中的色谱为高效液相色谱。
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱的色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱。
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱的流动相A为含5mM乙酸铵的水溶液，流动相B为甲醇。
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱的洗脱为梯度洗脱，
根据本发明的实施例，所述梯度洗脱条件为：0～0.2min，流动相B为20％：0.2～2min，流动相B为50％：2～4min，流动相B为100％；4～6min，流动相B为20％；6～6.2min，流动相B为20％。
根据本发明的实施例，所述色谱-串联质谱的色谱条件为：柱温：34～35℃；进样量：3μL；流速：0.3ml/min。
根据本发明的实施例，所述色谱-串联质谱的质谱条件为：ESI+；FULL MASS ddMS2模式；扫描范围200-1200m/z；碰撞能为35V；电喷雾电压为4500V。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种检测藏红花素的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前述的检测藏红花素的方法中所使用的试剂、标准品、辅助材料或其中至少一项的组合。由此，利用本发明实施例的试剂盒检测藏红花素，利用色谱-串联质谱进行检测，能对藏红花素进行定量检测，检测的准确度和灵敏度高。在此，需要说明的是，该试剂盒具有前述检测藏红花素的方法的全部技术特征和技术效果，在此不再一一赘述。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的C18色谱柱的藏红花素标准品色谱示意图；
图2显示了根据本发明一个实施例的样品水提取物色谱示意图；
图3显示了根据本发明一个实施例的对照品二级质谱示意图；
图4显示了根据本发明一个实施例的待测样品二级质谱示意图；
图5显示了根据本发明一个实施例的对照品色谱示意图；
图6显示了根据本发明一个实施例的待测样品色谱示意图；
图7显示了根据本发明一个实施例的标准曲线示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种检测藏红花素的方法。
根据本发明实施例的检测藏红花素的方法，利用色谱-串联质谱进行检测，能对藏红花素进行定量检测，检测的准确度和灵敏度高。
根据本发明实施例的检测藏红花素的方法，适用于市面上藏红花的品质检测，并且仪器的选择多元化，操作简单。
为了便于理解本发明实施例的检测藏红花素的方法，根据本发明的实施例，在此对该方法进行解释说明，该方法包括：
S100提取处理
根据本发明的实施例，将待测样本进行提取处理，以便得到提取液。由此，从待测样本中提取藏红花素，便于后续检测。
S200检测处理
根据本发明的实施例，利用色谱-串联质谱对所述提取液进行检测处理，以便获得所述藏红花素的含量。由此，利用色谱-串联质谱进行检测，能对藏红花素进行定量检测，检测的准确度和灵敏度高，并且仪器的选择多元化，操作简单。
根据本发明的实施例，所述提取处理包括：将所述待测样本与提取溶剂混合，以便混合物；将所述混合物进行超声提取，以便得到超声产物；以及将所述超声产物进行离心处理，提取上清，所述上清为所述提取液。由此，利用超声进行提取，有利于充分提取样本中的藏红花素。
根据本发明的实施例，所述提取溶剂为乙醇水溶液，藏红花素在水中的溶解度高，提取溶剂中添加适量有机溶剂便于后续提取物的复溶，简化后续处理流程，而藏红花素在乙醇中的溶解度较好，利用乙醇水溶液便于从待测物中提取藏红花素，优选地，为50体积％乙醇水溶液，藏红花素的提取效率更佳。
根据本发明的实施例，所述超声提取的温度条件为35～50℃条件下，时间条件为30-50分钟。发明人研究发现，藏红花素在高温时更容易从藏红花中分离出来，基于超声仪器的特性，应控制在一定温度范围内使之不变性但又可以更大程度提取。
根据本发明的实施例，所述色谱-串联质谱中的色谱为高效液相色谱。因为所选的流动相以及该设定的流速针对藏红花素时，在经典液相色谱中容易超过色谱柱的压力上限，因此，发明人选择高效液相色谱，能够满足藏红花检测对流速的要求。
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱的色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱。藏红花素为极性物质，选用上述色谱柱可以提高对藏红花素的保留。
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱的流动相A为含5mM乙酸铵的水，流动相B为甲醇。进一步地，根据本发明的实施例，所述高效液相色谱的洗脱为梯度洗脱。具体地，根据本发明的实施例，所述梯度洗脱条件为：0～0.2min，流动相B为20％：0.2～2min，流动相B为50％：2～4min，流动相B为100％；4～6min，流动相B为20％；6～6.2min，流动相B为20％。由此，有利于将藏红花素与其他杂质分离，检测的准确性更高。
根据本发明的实施例，所述色谱-串联质谱的色谱条件为：柱温：34～35℃；进样量：3μL；流速：0.3ml/min。根据其极性物质的特点，单针进样应不小于2μL,高效液相色谱本身也具有小体积样品精确分析的特点，故进样体积选为3μL,其余条件为仪器基本参数。
根据本发明的实施例，所述色谱-串联质谱的质谱条件为：ESI+；FULL MASS ddMS2模式；扫描范围200-1200m/z；碰撞能为35V；电喷雾电压为4500V。根据仪器以及物质本身的性质，其二及碎片离子的最佳碰撞能为35V，高压值为5000V左右。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种检测藏红花素的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前述的检测藏红花素的方法中所使用的试剂、标准品、辅助材料或其中至少一项的组合。由此，利用本发明实施例的试剂盒检测藏红花素，利用色谱-串联质谱进行检测，能对藏红花素进行定量检测，检测的准确度和灵敏度高。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。
仪器与材料
Thermo QE Orbitrap高效液相色谱-质谱系统(德国Thermo Fisher公司)；
KQ5200V型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；
Milli-Q Reference超纯水机(德国默克密理博公司)；
Thermo Fisher Pico 17高速离心机(德国Thermo Fisher公司)。
藏红花素标准品；
甲醇、乙醇为色谱纯；
乙酸铵为分析纯；
水为超纯水。
藏红花样品，购于西藏，主要分为三个不同的品级(头期，顶级，次级)。
流动相A为5mmol/L乙酸铵水溶液,配制方法为取385.4mg乙酸铵，用超纯水稀释至1L；流动相B为甲醇。
实施例1
本实施例中，利用本实施例的检测藏红花素的方法，对市售藏红花中藏红花素的含量进行检测，并判断藏红花的品质，具体如下：
1、对照品溶液制备及标准曲线绘制
精确称取藏红花素标准品2.3mg，溶于23mL甲醇中，得100ppm对照品母液，稀释至0.3ppm，0.5ppm，1.0ppm，2.0ppm，3.0ppm，5.0ppm待测对照品溶液。
将对照品溶液在高效液相色谱-质谱中进行检测，色谱及质谱条件：
色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱，；
柱温：35℃；
进样量：3μL
流动相比例及流速如表1所示：B相为甲醇，A相为5mmol/L乙酸铵水溶液。
表1流动相比例和流速参数设置
质谱条件：扫描范围200-1200m/z，碰撞能为35V,电喷雾电压4500V。
对照品的质谱二级碎片离子如图3所示。藏红花素的色谱峰出峰时间为3.96，如图5所示。进行对比的C18色谱柱色谱洗脱示意图如图1。将对照品的不同浓度依次进样与上述系统，利用系统内的QUAN BROWSER进行外标法定量并绘制标准曲线，标准曲线如图7所示。样品水提取物色谱示意图如图2所示。
2、样品溶液制备
(1)样本提取：
(a)选取不同品级3个代表藏红花样品分别研磨成粉末，再分别精确称取100mg，置于试管中，用移液枪将体积为10mL的50％乙醇水溶液(v：v＝1:1)加入带有样品的试管中并用封口膜密封，确认密封后涡旋1min；
(b)将涡旋后的样品放置于35～50℃超声仪中超声提取40min，超声结束后将其置于室温下冷却沉淀，并取上层溶液6mL进行离心(离心参数：温度为4℃，转速9000rpm，时间8min)；
(c)取离心后的3个样品3mL上层清液过0.22μm滤膜并收集，装于棕色样品瓶中等待备用；
(d)取1mL样品装入进样瓶中进行氮吹，吹干后取1mL甲醇进行复溶并涡旋1min，得到待测液，备用。
(2)样品检测
(a)取步骤(1)中不同样品待测液适量稀释2000倍，即得不同样品待测液；
(b)将不同的样品待测液依次进样上述高效液相色谱-质谱系统中，依据系统中绘制好的标准曲线定量不同样品中的藏红花素待测品中的浓度x，其中利用对照品对样品中的藏红花素进行定性，其样品质谱二级碎片示意图如图4，色谱峰图如图6；
根据公式对样品中藏红花素含量进行计算，其中，头期样品中藏红花素的浓度为1.196ppm，对应藏红花素含量为23.92％；顶级样品中藏红花素含量为1.036ppm，对应藏红花素含量为20.72％；次级样品中藏红花素浓度为609.740ppb，对应藏红花素含量为12.19％，该含量与购买时样品的级别相符合。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。