具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种确定待测物是否被生物毒素侵染的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：对所述待测物进行提取处理，以便得到提取液；对所述提取液进行液相色谱-质谱检测，基于脂质代谢标志物确定所述待测物中是否含有生物毒素。

根据本发明实施例的确定待测物是否被生物毒素侵染的方法，通过液相色谱-质谱检测，基于上述脂质代谢标志物，能准确的判断待测物是否被生物毒素侵染，并且，操作简单，灵敏度和准确率高。

根据本发明的实施例，该方法不仅能实现禽兽细胞和大肠杆菌的检测，而且能实现人源性细胞的检测，不仅对生物毒素干预下的人源性细胞代谢研究具有重要意义，对于建立食品、药品、化妆品及环境中的其他有害物质的侵染模型具有重要应用价值。

根据本发明的实施例，所述生物毒素选自霉菌毒素、植物毒素、动物毒素和微生物毒素中的至少一种。本发明实施例的方法，适于多种毒素侵染的检测。根据本发明的优选实施例，生物毒素为霉菌毒素，更优选地，所述霉菌毒素为黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、伏马毒素B1和呕吐毒素中的至少一种。霉菌毒素是侵染细胞的重要毒素，对霉菌毒素进行定性检测，对于建立食品、药品、化妆品及环境中的其他有害物质的侵染模型具有重要应用价值。

根据本发明的实施例，所述伏马毒素B1的所述脂质代谢标志物选自下述的至少一种：(1)伏马毒素B1标志物1：512.5028m/z；(2)伏马毒素B1标志物2：540.5343m/z；(3)伏马毒素B1标志物3：813.6830m/z；(4)伏马毒素B1标志物4：722.5258m/z；(5)伏马毒素B1标志物5：738.5056m/z；(6)伏马毒素B1标志物6：787.6675m/z。

根据本发明的实施例，所述黄曲霉毒素B1的所述脂质代谢标志物选自下述的至少一种：(1)黄曲霉毒素B1标志物1：甘油三脂TG(18:1(9Z)/20:1(11Z)/22:1(13Z))；(2)黄曲霉毒素B1标志物2：甘油二脂DG(18:2(9Z,12Z)/20:0/0:0)；(3)黄曲霉毒素B1标志物3：甘油三脂TG(18:1(9Z)/20:1(11Z)/20:1(11Z))；(4)黄曲霉毒素B1标志物4：甘油三脂TG(14:0/16:0/18:0)；(5)黄曲霉毒素B1标志物5：甘油三脂TG(18:0/18:1(9Z)/20:1(11Z))。

根据本发明的实施例，所述赭曲霉毒素A的所述标志物选自下述的至少一种：(1)磷脂酸PA(13:0/20:1(11Z))；(2)磷脂酰丝氨酸PS(O-20:0/19:1(9Z))。

根据本发明的实施例，所述呕吐毒素的所述脂质代谢标志物选自下述的至少一种：(1)磷脂酸PA(13:0/20:1(11Z))；(2)卵磷脂PC(10:0/21:0)；(3)赶黄草B(Thonningianin B)；(4)卵磷脂PC(16:0/22:5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))；(5)甘油二脂DG(O-16:0/18:1(9Z))。

根据本发明的实施例，对待测物进行提取处理包括：提取待测物的细胞，用磷酸盐缓冲液清洗3次，加入胰酶，37℃消化1-2min后，弃去胰酶，用杜氏磷酸盐缓冲液轻轻冲洗一次，更换新的杜氏磷酸盐缓冲液将细胞吹打下来并4℃离心2-3次，弃去杜氏磷酸盐缓冲液加入固体体积4-5倍的二氯甲烷：甲醇(2：1,v/v)，超声10min后，离心15min(12,000rpm,5min,4℃),氮气吹干，异丙醇/甲醇/水(2:1:1,v/v/v)复溶，过0.22μm滤膜，以便得到提取液。

根据本发明的实施例，所述液相色谱-质谱为超高效液相色谱-飞行时间-离子淌度质谱。离子迁移质谱(IMS)在分析复杂代谢物方面展示出广泛的应用前景。部分具有相同质荷比及相同或相近保留时间的离子，可能有不同的头基，不同的脂肪酸酰基连接方式以及不同的脂肪酸酰基的双键位置。IMS根据离子在飘移管中与缓冲气体碰撞时的碰撞截面不同，按大小和形状进行分离而不依赖于色谱条件，具有操作简单、鉴定准确、易于实现自动化等优点。但是淌度维度的增加降低了灵敏度，使后续定量工作面临着巨大的挑战。发明人采用超高效液相色谱，分析时间短，溶剂消耗量小，检测速度快；并且，该方法增加了离子淌度维度，提高了分离效果及鉴定结果的可信度。

根据本发明的实施例，所述液相色谱-质谱的色谱柱为ACQUITY CSH C18色谱柱。发明人发现CSH C18色谱柱低水平的正表面电荷，在酸性流动相中，不仅提升脂质代谢物负载能力而且增强脂质代谢物分离能力，对脂质代谢物的检测信号强。

根据本发明的实施例，所述液相色谱-质谱的色谱流动相为：流动相A:含10mM甲酸铵和0.1％甲酸的乙腈水溶液，优选地，乙腈与水的体积比为6：4；流动相B：含10mM甲酸铵和0.1％甲酸的异丙醇和乙腈的混合溶液，其中，异丙醇与乙腈的体积比为9：1。发明人发现，在流动相中加入甲酸利于正离子质子化，维持样品在流动相中的电离状态；加入甲酸铵能增大流动相极性，调整溶液中的离子强度，有利于脂质代谢物充分分离。

根据本发明的实施例，所述液相色谱-质谱的色谱的洗脱为梯度洗脱，优选地，所述梯度洗脱条件：0-2min，流动相B：40％-43％；2.0-2.1min，流动相B：43％-50％；2.1-12.0min，50％-54％；12.0-12.1min，54％-70％；12.1-18.0min，70％-99％；18.0-18.1min，99％-40％；18.1-20.0min，40％。由此，有利于充分分离上述脂质代谢标志物，提高灵敏度。

根据本发明的实施例，所述液相色谱-质谱的色谱条件：色谱柱温：55℃；样品室温为10℃；流速300μL/min。柱温越高，出峰越快，保留时间越短，但是有些组份可能分离度不够；柱温降低，流速加快，但可能导致柱压过高，发明人经大量实验，发现色谱柱温为55℃，流速为300μL/min，脂质代谢物的出峰时间和保留时间适宜。此外，生物样品一般低温存放。

根据本发明的实施例，所述液相色谱-质谱的质谱条件：采集模式为HDMSE；电离模式为ESI⁺/ESI^-；锥孔电压为30V；去溶剂温度为550℃；去溶剂气流速为900L/hr；采集范围为50-1200m/z。发明人发现，负电离模式下脂类的构象空间宽度相对压缩，因此ESI⁺被用于后续研究。

根据本发明的实施例，所述待测物的分子量不大于1200Da。

根据本发明的实施例，所述待测物来源于哺乳动物，优选地，来源于哺乳动物的肝。由此，肝脏是哺乳动物的重要消化器官，并且含有丰富的酶，物质代谢活跃，适于生物毒素的检测。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种确定待测物是否被生物毒素侵染的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前述的检测-生物毒素侵染细胞的特征指纹标志物的方法中所使用的试剂、标准品、辅助材料或其中至少一项的组合。由此，该试剂盒通过液相色谱-质谱检测，基于前述脂质代谢标志物，能准确的判断待测物是否被生物毒素侵染，并且，操作简单，灵敏度和准确率高。此外，需要说明的是，该试剂盒具有前述确定待测物是否被生物毒素侵染的方法的全部技术特征和技术效果，在此不再一一赘述。

根据本发明的实施例，所述标准品包括脂质代谢物标准品和霉菌毒素标准品，其中，所述脂质代谢物标准品选自N-神经酰基-D-赤型-鞘氨醇磷酰胆碱、C14-二氢神经酰胺和C16-二氢神经酰胺和C22鞘磷脂中的至少一种；所述霉菌毒素标准品选自黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、呕吐毒素和赭曲霉毒素中的至少一种。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。

实施例1

本实施例中，利用本实施例的确定待测物是否被生物毒素侵染的方法，对伏马毒素干预后的细胞脂质代谢物进行检测，并判断不同浓度干预后的拮抗/促进趋势，具体如下：

1、干预体系建立：

(1)将Hepg2细胞从液氮中取出，将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，加入4-5mL培养基混匀；

(2)在1000rpm左右条件下离心4min，弃上清,加1-2mL培养基吹匀；

(3)将细胞悬液加入T25培养瓶或60mm培养皿中，补加适量培养基，贴壁24h后加药。

2、脂质代谢物提取：

(1)加不同浓度的伏马毒素干预，待细胞长至80％左右，将培养皿从37℃5.0％CO₂恒温培养箱中取出，弃去培养基，磷酸盐缓冲液清洗3次。

(2)向培养皿中加入1mL胰酶，37℃消化1-2min后，弃去胰酶，用杜氏磷酸盐缓冲液轻轻冲洗一次；

(3)更换新的杜氏磷酸盐缓冲液将细胞吹打下来并4℃离心2-3次，弃去杜氏磷酸盐缓冲液加入固体体积4-5倍的二氯甲烷：甲醇(2：1,v/v)，超声10min；

(4)离心15min(12,000rpm,5min,4℃),氮气吹干，异丙醇/甲醇/水(2:1:1,v/v/v)复溶，过0.22μm滤膜。

3、试剂与材料

(1)实验中所用色谱级乙腈、异丙醇购于英国赛默飞公司，甲醇、亮氨酸脑啡美国Sigma-Aldrich公司。实验中所用霉菌毒素标准品，黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、呕吐毒素、赭曲霉毒素购于澳大利亚Romer公司，脂类标准品，N-神经酰基-D-赤型-鞘氨醇磷酰胆碱、C14-二氢神经酰胺、C16-二氢神经酰胺和C22鞘磷脂购于美国Sigma-Aldrich公司。

(2)标准储备液的配制

准确称取4种霉菌毒素标准品5mg分别置于样品瓶中，加入磷酸盐缓冲液溶解伏马毒素B1和呕吐毒素，加入甲醇溶解黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素，分别配制成2000μM储备液，于存在-20℃冰箱中待用。

(3)混合标准工作液的配制

精密量取单标储备液各500μL，置于10mL容量瓶中，用磷酸盐缓冲液稀释得400μM标准溶液，并放置于4℃冰箱中保存待用。根据实际工作需要，梯度稀释成序列浓度。

3、将对照品溶液在高效液相色谱-质谱中进行检测，色谱及质谱条件：

色谱柱：ACQUITY CSH C18色谱柱；

色谱柱温：55℃；

样品室温为10℃；

流速300μL/min；

流动相A:乙腈/水(6：4)含10mM甲酸铵和0.1％甲酸；

流动相B为异丙醇/乙腈(9：1)含10mM甲酸铵和0.1％甲酸；

梯度洗脱，洗脱条件：0-2min，流动相B：40％-43％；2.0-2.1min，流动相B：43％-50％；2.1-12.0min，50％-54％；12.0-12.1min，54％-70％；12.1-18.0min，70％-99％；18.0-18.1min，99％-40％；18.1-20.0min，40％。具体详见表1

表1流动相比例和流速参数设置

质谱条件：质谱：SYNAPT G2 HDMS；采集模式：HDMSE；电离模式：ESI+/ESI-；锥电压：30V；去溶剂温度：550℃；去溶剂气流速：900L/hr；源温：120℃；缓冲气体：氮气和氦气；碰撞池电压：20-50V；采集范围：50-1200m/z。

不同霉菌毒素干预后Hepg2脂质提取物基峰图如图1(ESI⁺)和如图2(ESI^-)所示，由于负电离模式下脂类的构象空间宽度相对压缩，因此ESI⁺被用于后续研究。

4、数据处理：

(1)原始数据采用MassLynx 4.2版软件(Waters Corporation,Wilmslow,UK)收集；

(2)Progenesis QI进一步进行峰对齐和计算CCS值。

(3)将所得数据提交至EZ info 3.0(Waters Corporation,Wilmslow,UK)和SIMCA14.1软件(Umetrics,Sweden)进行统计分析。

(4)在过滤出具有统计学意义的特征数据后，使用脂质在线搜索工具(http://www.lipidmaps.org)进行脂质鉴定，以获得详细的生物标志物信息。

综合VIP值、q值、Anova(p)、得分信息及排名，得到生物标志物(FB1)，具体如下：

(1)Cer(d18:0/14:0)(m/z 512.5028)(VIP>1,Anova(p)＝0，q＝0，得分39.2)；

(2)Cer(d18:0/16:0)(m/z 540.5343)(VIP>1,Anova(p)＝3.06E-09，q＝8.85E-09，得分42.5)；

(3)SM(d18:1/24:1(15Z))(m/z 813.6830)(VIP>1,Anova(p)＝1.15463E-14，q＝1.5098E-14，得分47.6)；

(4)1-(8-[5]-ladderane-octanyl)-2-(8-[3]-ladderane-octanyl)-sn-glycerophosphoethanolamine(m/z 722.5258)(VIP>1,Anova(p)＝5.61218E-13，q＝5.47066E-13，得分43.6)；

(5)PE(14:1(9Z)/22:4(7Z,10Z,13Z,16Z))(m/z 738.5056)(VIP>1,Anova(p)＝0，q＝0，得分56.1)；

(6)SM(d18:1/22:0)(m/z 787.6675)(VIP>1,Anova(p)＝0，q＝0，得分47.9)。

图3为保留时间为7.93分钟时，m/z 780.549在离子在漂移时间维度上的分离，由此可见，CCS维度在非靶向代谢组学的鉴定中具有重要意义。不同浓度伏马毒素B1干预后在Hepg2提取物中(以m/z 722.52为例)的萃取离子色谱图(EICs)如图4所示。基于生物标志物的模型识别中，控制组和被霉菌毒素侵染组完全分开，如图5。

实施例2

采用实施例1的方法，对黄曲霉毒素B1干预后的细胞脂质代谢物进行检测，并判断不同浓度干预后的拮抗/促进趋势，区别在于，步骤2的(1)加入的是不同浓度的黄曲霉毒素B1干预，检测得到的黄曲霉毒素B1的生物标志物为

(1)甘油三脂TG(18:1(9Z)/20:1(11Z)/22:1(13Z))；

(2)甘油二脂DG(18:2(9Z,12Z)/20:0/0:0)；

(3)甘油三脂TG(18:1(9Z)/20:1(11Z)/20:1(11Z))；

(4)甘油三脂TG(14:0/16:0/18:0)；

(5)甘油三脂TG(18:0/18:1(9Z)/20:1(11Z))。

实施例3

采用实施例1的方法，对赭曲霉毒素A干预后的细胞脂质代谢物进行检测，并判断不同浓度干预后的拮抗/促进趋势，区别在于，步骤2的(1)加入的是不同浓度的赭曲霉毒素A干预，检测得到的赭曲霉毒素A的生物标志物为：

(1)磷脂酸PA(13:0/20:1(11Z))；

(2)磷脂酰丝氨酸PS(O-20:0/19:1(9Z))。

实施例4

采用实施例1的方法，对赭曲霉毒素A干预后的细胞脂质代谢物进行检测，并判断不同浓度干预后的拮抗/促进趋势，区别在于，步骤2的(1)加入的是不同浓度的呕吐毒素干预，检测得到的呕吐毒素的生物标志物为：

(1)磷脂酸PA(13:0/20:1(11Z))；

(2)卵磷脂PC(10:0/21:0)；

(3)Thonningianin B；

(4)卵磷脂PC(16:0/22:5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))；

(5)甘油二脂DG(O-16:0/18:1(9Z))。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。