一种测定高有机质固体样品中甾体激素的检测方法
阅读说明：本技术 一种测定高有机质固体样品中甾体激素的检测方法 (Detection method for measuring steroid hormone in high organic matter solid sample ) 是由 张云 邹华 钟琴 冯慧 周涛 顾帆 付善飞 于 2021-09-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种测定高有机质固体样品中甾体激素的检测方法,包括下列步骤：(1)将固体样品冷冻干燥,研磨后过100目筛；(2)将步骤(1)得到的样品置于容器内；(3)向步骤(2)中的容器加入萃取剂,震荡15s-30s,超声处理后离心取上清液,萃取三次；萃取三次使用的萃取剂为甲醇、乙腈；(4)将步骤(3)得到的三次萃取的上清液混合后在氮气下吹干,加入甲醇复溶后,加入PSA吸附剂进行清洗；吸附剂的投加量为400mg；(5)离心将吸附剂分离后,将清洗后的样品过膜用LC-MS/MS进行检测。采用本发明方法适用范围广,操作简便,能实现多种甾体激素回收率均达到75％以上,平均回收率达到94.65％。(The invention discloses a detection method for measuring steroid hormones in a high organic matter solid sample, which comprises the following steps: (1) freeze-drying the solid sample, grinding, and sieving with a 100-mesh sieve; (2) placing the sample obtained in the step (1) into a container; (3) adding an extracting agent into the container in the step (2), shaking for 15-30 s, centrifuging after ultrasonic treatment, taking supernate, and extracting for three times; the extracting agent used for the third extraction is methanol and acetonitrile; (4) mixing the supernatants obtained in the step (3) after the three extractions, drying the mixed supernatants under nitrogen, adding methanol for redissolution, and adding a PSA adsorbent for cleaning; the dosage of the adsorbent is 400 mg; (5) after centrifugation to separate the adsorbent, the washed sample was passed through a membrane and examined by LC-MS/MS. The method has wide application range and simple and convenient operation, and can realize that the recovery rates of various steroid hormones all reach over 75 percent and the average recovery rate reaches 94.65 percent.)
技术领域
本发明涉及一种测定高有机质固体样品中甾体激素的检测方法，属于复杂环境样品中微量新型污染物检测分析领域。
背景技术
甾体激素又称类固醇激素，是一类最强效的内分泌干扰物，环境相关浓度水平下也可对水生生物造成显著的内分泌干扰效应，存在较高的生态风险。对环境不同介质中的甾体激素进行监测和准确的报告，对预防和管控甾体激素的生态风险具有重要意义。甾体激素常存在于畜禽粪便及养殖场周边土壤、污水处理厂污泥、水体沉积物等固体介质中，这些固体样品通常含有大量腐殖酸、蛋白质、木质纤维素等有机质，通过吸附络合甾体激素、干扰目标物响应等对甾体激素的准确定量提出挑战。过去常用传统的固相萃取法作为萃取浓缩后的清洗步骤去除有机质的影响，但对粪便、污泥等有机质特别高的样品回收率仍不理想，传统固相萃取法对有机质的去除有限，而目标检测物的损失增加，且操作步骤繁琐，需要消耗较多的时间和人力。经过检索，目前尚未有针对高有机质固体样品的甾体激素检测方法，因此，亟待开发一种操作简便、回收率良好的检测方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种高有机质固体样品中22种甾体激素的检测方法，通过筛选适当的有机质吸附剂，减少萃取物中有机质干扰的同时，尽可能保留目标检测物。该方法操作简单，干扰较少，适用范围广，能有效提高复杂环境固体样品中甾体激素的回收率和检测准确性。
本发明的第一个目的是提供一种检测高有机质固体样品中微量甾体激素的前处理方法，所述前处理方法是采用固相萃取法对高有机质固体样品中微量甾体激素进行萃取得到萃取液，然后采用N-丙基乙二胺作为吸附剂对萃取液进行清洗即可；所述萃取分为三次萃取，第一次采用甲醇进行萃取；第二次和第三次采用乙腈萃取；N-丙基乙二胺的添加量为200-800mg/g高有机质固体样品，即N-丙基乙二胺的添加量为高有机质固体样品质量的20％～80％，g/g。
在本发明的一种实施方式中，所述高有机质固体样品需先进行冷冻干燥，研磨过筛。
在本发明的一种实施方式中，所述三次萃取均在超声条件下进行，每次萃取时间为10-20min。
在本发明的一种实施方式中，高有机质固体样品包括污水厂活性污泥及剩余污泥、畜禽粪便、高有机质土壤或沉积物。
在本发明的一种实施方式中，所述的甾体激素包括雌酚酮、雌二醇、雌三醇、乙炔雌二醇、表雄酮、雄酮、雄烯二酮、睾酮、甲睾酮、诺龙、孕酮、左炔诺孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、羟孕酮、可的松、氢化可的松、皮质甾酮、强的松、泼尼松龙、甲基强的松龙和地塞米松中的一种或多种。
本发明的第二个目的是提供一种方法对高有机质固体样品中甾体激素进行检测方面的应用。
本发明的第三个目的是提供一种检测高有机质固体样品中微量甾体激素含量的方法，所述方法是先采用上述前处理方法对固体样品进行处理后，再采用高效液相色谱串联质谱进行分析。
在本发明的一种实施方式中，当分析雌激素时，采用氨水和乙腈作为流动相；当分析雄激素、孕激素和糖皮质激素时，采用含有0.1％甲酸的甲醇溶液和乙腈作为流动相。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：
(1)预处理：将固体样品先置于培养皿中在-80℃超低温冰箱冷冻过夜，取出后立即放入冷冻干燥机冻干在-45℃下冻干，于研钵内研磨后过100目筛。
(2)萃取：将步骤(1)得到的固体样品准确称取0.5g放入30mL聚四氟乙烯离心管中，加入5mL甲醇，拧紧螺旋盖后用涡流振荡器振荡30s，然后超声萃取15min，在4000rpm条件下离心15min进行固液分离，用玻璃胶头滴管吸出上清液于聚四氟乙烯离心管中。重复以上步骤2次，但萃取溶剂换成5mL乙腈，收集三次离心后的萃取液再离心30min，取上清液盛于玻璃氮吹管中，在氮吹仪上用稳定氮气流吹干，再准确加入1.0mL甲醇复溶。
(3)清洗：称取400mg PSA粉末状吸附剂加入步骤(2)盛有浓缩萃取液的离心管，涡流振荡30s后4000rpm离心20min，最后用针式过滤器将上清液过0.22μm PTFE膜后，注入250μL内插管后保存于棕色色谱瓶待测。
(4)高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析：分析雌激素时的液相色谱条件为：流动相A为0.05％氨水，流动相B为乙腈，流速为0.4mL/min，进样量为5μL，柱温40℃。洗脱条件为：0–0.25min流动相是70％A相+30％B相；0.25–2min，A相逐渐减少至10％，同时B相逐渐增加至90％；维持1min后即刻恢复至初始流动相70％A相+30％B相，再维持1min。质谱分析条件为：质谱模式为电喷雾负离子源(ESI-)；质谱扫描方式为多反应离子监控(MRM)；毛细管电压为3.5kV；锥孔电压和提取锥孔电压分别为30.0和3.0V；离子源温度和脱溶剂温度分别为150℃和500℃；锥孔气流和脱溶剂气流分别为50L/hr和900L/hr；碰撞气流为0.16mL/min。分析雄激素、孕激素和糖皮质激素时的色谱条件为：流动相A为含有0.1％甲酸的甲醇溶液(水：甲醇为98:2，v/v)，流动相B为乙腈，流速为0.4mL/min，进样量为5μL，柱温40℃。洗脱条件为：0–0.25min流动相是90％A相+10％B相；0.25–1min，B相逐渐增加至70％；1–3min，B相继续增加至95％，并维持1min；随后即刻恢复至初始流动相90％A相+10％B相，维持1min。质谱分析条件为：检测雄激素和糖皮质激素时质谱模式为电喷雾正离子源(ESI+)；检测糖皮质激素时质谱模式为电喷雾负离子源(ESI-)，质谱扫描方式为多反应离子监控(MRM)；毛细管电压为3.5kV；锥孔电压和提取锥孔电压分别为30.0和3.0V；离子源温度和脱溶剂温度分别为150℃和500℃；锥孔气流和脱溶剂气流分别为50L/hr和900L/hr；碰撞气流为0.16mL/min。
在本发明的一种实施方式中，所述的甾体激素包括雌酚酮、雌二醇、雌三醇、乙炔雌二醇、表雄酮、雄酮、雄烯二酮、睾酮、甲睾酮、诺龙、孕酮、左炔诺孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、羟孕酮、可的松、氢化可的松、皮质甾酮、强的松、泼尼松龙、甲基强的松龙、地塞米松。
本发明的第四个目的是提供一种对高有机质固体样品中甾体激素进行提取后的萃取液进行清洗的方法，所述方法是采用N-丙基乙二胺粉末(Primarysecondaryamine,PSA)作为有机质吸附剂，降低有机质的干扰的同时避免目标检测物的损失。
本发明的有益效果：
1、采用本发明方法能实现22种甾体激素的测定，回收率为63.50％～154.10％，平均回收率可达94.65％。
2、本发明利用PSA作为有机质吸附剂，对固体样品的萃取浓缩液进行清洗，仅需要涡流和离心等操作，相对于传统固相萃取作为清洗方法，步骤简便、时间和人力消耗小，对仪器设备要求不高、维护成本较低。
3、本发明利用PSA作为清洗剂，相对于石墨碳粉、硅胶等其它吸附剂，对有机质的干扰进行有效的控制，并减少目标检测物的损失，达到在复杂样品中检测微量甾体激素的目的。
附图说明
图1从高有机质固体样品中检测微量甾体激素的方法流程图。
图2不同PSA投加剂量下雌激素的回收率对比图，其中，E1为雌酚酮(Estrone)，E2为雌二醇(17β-Estradiol)，EE2为乙炔雌二醇(Ethinylestradiol)。
图3不同PSA投加剂量下雄激素的回收率对比图，其中，NDL为诺龙，ADD为雄烯二酮(Androstenedione)，TTR为睾酮(Testosterone)，EADR为表雄酮(Epiandrosterone)，ADR为雄酮(Androsterone)，MTTR为甲睾酮(17α-Methyltestosterone)。
图4不同PSA投加剂量下孕激素的回收率对比图，其中，LNG为左炔诺孕酮(Levonorgestrel)，PGT为孕酮(Progesterone)，HPT为羟孕酮(Hydroxyprogesterone)，MTA为醋酸甲地孕酮(Megestrolacetate)，MPA为醋酸甲羟孕酮(Medroxyprogesteroneacetate)。
图5不同PSA投加剂量下糖皮质激素的回收率对比图，其中，CORT为皮质甾酮(Corticosterone)，PREL为泼尼松龙(Prednisolone)，CRN为可的松(Cortisone)，CRL为氢化可的松(Cortisol)，MPREL为甲基强的松龙(Methylprednisolone)，DEX为地塞米松(Dexamethasone)。
图6不同实施例和对比例中甾体激素的回收率图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式。
发明提供了一种测定高有机质固体样品中多种微量甾体激素的检测方法，可以用于萃取和定量分析污水厂剩余污泥、活性污泥、人畜粪便以及高有机质的土壤或沉积物中雌激素、雄激素、孕激素和糖皮质激素等22种甾体激素，采用以下仪器和试剂：
仪器：超声仪(宁波新芝生物科技股份有限公司，SB-500DTY)；冷冻干燥机(LABCONCO)；离心机(Eppendorf，Centrifuge 5804R)；涡流振荡器(上海沪西分析仪器厂有限公司，WH-1微型旋涡混合仪)；干式氮吹仪(上海欧戈电子有限公司，AG-DCY-12G)；高效液相色谱串联质谱(Waters，ACQUITY UPLC Xevo TQ)，Waters ACQUITY UPLC R BEH C18(100mm×2.1mm×1.7μm)。
试剂：萃取溶剂包括甲醇、乙腈，均为德国Merck色谱纯，超纯水。
吸附剂：N-丙基乙二胺粉末(Primarysecondaryamine，简称PSA)；石墨碳粉末(Supelco ENVI Carb，简称Carb)；硅胶粉末(简称Silica)。
实施例1：标准曲线的建立
(1)先用甲醇将各甾体激素标准品准确配制成浓度为1g/L的单标储备液溶液，再各取10μL单标至10mL容量瓶定容，配制成1mg/L的混标进行LC-MS/MS分析，确定各自出峰时间和定性定量离子对；
所述LC-MS/MS流动相的配制方法为，测定雌激素的流动相A是将20％的浓氨水稀释400倍得到0.05％的氨水，测定其它激素的流动相A是将水和甲醇以98:2的体积比混合，再加入甲酸至其浓度为0.1％；
色谱条件为采用Waters ACQUITY UPLC R BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm×1.7μm)，离子源温度和脱溶剂温度分别为150℃和350℃，用上述配制好的流动相A和乙腈为流动相B进行洗脱，流速为0.4mL/min，进样量为5μL。
(2)各取100μL的1g/L甾体激素单标至10mL容量瓶，用甲醇定容从而配制10mg/L的混标，并将其稀释成浓度分别为1，5，10，50，100，200μg/L的混合标准液，最终以进样浓度作为横坐标X(μg/L)，峰面积作为纵坐标Y，得到相应甾体激素的标准曲线和检测限。结果得到各激素标曲的线性范围为1～200μg/L，详细结果如下：
表1甾体激素的标准曲线及检测限和定量限
实施例2：一种检测污水厂剩余污泥中甾体激素的检测方法
如图1所示，将固体样品先置于培养皿中在-80℃超低温冰箱冷冻过夜，取出后立即放入冷冻干燥机冻干在-45℃下冻干，于研钵内研磨过100目筛待提取。不能马上提取的样品用铝箔包好封入密封袋贮存于-20℃冰箱。
准确称取0.5g冻干研磨好的样品，放入30mL聚四氟乙烯离心管中，加入5mL甲醇，拧紧螺旋盖后用涡流振荡器振荡30s，然后超声萃取15min，在4000rpm条件下离心15min进行固液分离，用玻璃胶头滴管吸出上清液于聚四氟乙烯离心管中。重复以上步骤2次，但萃取溶剂换成5mL乙腈，收集三次离心后的萃取液再离心30min，取上清液盛于玻璃氮吹管中，在氮吹仪上用稳定氮气流吹干，再准确加入1.0mL甲醇复溶。称取400mg PSA粉末状吸附剂加入离心管，涡流振荡30s后4000rpm离心20min，最后用针式过滤器将上清液过0.22μmPTFE膜后，注入250μL内插管后保存于棕色色谱瓶待测。
用高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)对提取得到的样品进行分析，分析雌激素时的液相色谱条件为：流动相A为0.05％氨水，流动相B为乙腈，流速为0.4mL/min，进样量为5μL，柱温40℃。洗脱条件为：0–0.25min流动相是70％A相+30％B相；0.25–2min，A相逐渐减少至10％，同时B相逐渐增加至90％；维持1min后即刻恢复至初始流动相70％A相+30％B相，再维持1min。质谱分析条件为：质谱模式为电喷雾负离子源(ESI-)；质谱扫描方式为多反应离子监控(MRM)；毛细管电压为3.5kV；锥孔电压和提取锥孔电压分别为30.0和3.0V；离子源温度和脱溶剂温度分别为150℃和500℃；锥孔气流和脱溶剂气流分别为50L/hr和900L/hr；碰撞气流为0.16mL/min。分析雄激素、孕激素和糖皮质激素时的色谱条件为：流动相A为含有0.1％甲酸的甲醇溶液(水：甲醇为98:2，v/v)，流动相B为乙腈，流速为0.4mL/min，进样量为5μL，柱温40℃。洗脱条件为：0–0.25min流动相是90％A相+10％B相；0.25–1min，B相逐渐增加至70％；1–3min，B相继续增加至95％，并维持1min；随后即刻恢复至初始流动相90％A相+10％B相，维持1min。质谱分析条件为：检测雄激素和糖皮质激素时质谱模式为电喷雾正离子源(ESI+)；检测糖皮质激素时质谱模式为电喷雾负离子源(ESI-)，质谱扫描方式为多反应离子监控(MRM)；毛细管电压为3.5kV；锥孔电压和提取锥孔电压分别为30.0和3.0V；离子源温度和脱溶剂温度分别为150℃和500℃；锥孔气流和脱溶剂气流分别为50L/hr和900L/hr；碰撞气流为0.16mL/min。
对该方法进行加标回收率检测，在0.5g污水厂剩余污泥中加入200ng甾体激素混标，即加标量为400μg/kg，同时准备未加标的空白样，每个实验组准备2～3个平行样，静置2小时后进行萃取和检测，按以下公式计算回收率：
其中，R为回收率，％；M为加标样品的检出量，ng；M0为空白样品的检出量，ng。
如图2所示，实施例1各甾体激素的回收率为63.5％～154.1％(平均94.7％)，用该方法测某市政污水处理厂剩余污泥中的甾体激素，检出雌激素E1、E2、E3和EE2分别为0.50～2.60μg/kg、0.90μg/kg、4.40μg/kg和2.30μg/kg，雄激素EADR、ADR、ADD分别为14.70～381.12μg/kg、32.8μg/kg、0.40～4.70μg/kg，孕激素PGT为0.50～6.60μg/kg。
实施例3：一种检测污水厂活性污泥中甾体激素的检测方法
检测步骤与实施例2相同，检测样品变为某市政污水厂氧化沟、厌氧池、缺氧池、好氧池中的活性污泥，检出结果如表2所示：
表2污水厂不同工艺段活性污泥中甾体激素的检出情况
“–”为未检出。
实施例4：吸附剂PSA添加量的优化
选用PSA为清洗步骤的有机质吸附剂，对1mL样品萃取浓缩液投加量分别为0、50、100、200、300和400mg时，比较各甾体激素的回收率，结果如图2、图3、图4和图5所示，回收率随着投加量增加而增大，在试验投加量范围内400mg的回收率最佳，并且若投加量继续增加，离心分离后可收集的样品量将不够用于LC-MS/MS测定，因此选择400mg为最终投加量。
对比例1：硅胶粉末作为清洗步骤的吸附剂
在清洗步骤，即在氮吹仪上用稳定氮气流吹干、再准确加入1.0mL甲醇复溶后，称取0、50、100、200、300或400mg硅胶粉末加入离心管，涡流振荡30s后4000rpm离心20min，最后用针式过滤器将上清液过0.22μm PTFE膜后，注入250μL内插管后保存于棕色色谱瓶待测。其余步骤和参数与实施例2一致。结果显示硅胶对有机质的吸附去除效果并不明显，清洗过后样品仍呈黄褐色，仍具有损伤液相色谱柱的风险，且随投加量的增加回收率并无显著上升的趋势，最高投加量400mg条件下各激素的回收率仅为12.65％～98.25％(平均62.47％)，检测效果不如以PSA作为清洗剂的效果(实施例2)。
对比例2：石墨碳粉作为清洗步骤的吸附剂
在清洗步骤，即在氮吹仪上用稳定氮气流吹干、再准确加入1.0mL甲醇复溶后，称取150mg石墨碳粉加入离心管，涡流振荡30s后4000rpm离心20min，最后用针式过滤器将上清液过0.22μm PTFE膜，注入250μL内插管后保存于棕色色谱瓶待测。其余步骤和参数与实施例2一致。结果石墨碳粉对有机质的去除效果非常好，清洗前萃取液为黄褐色甚至深棕色，清洗后为透亮的淡黄色，但与此同时，石墨碳对目标物的去除也很明显，各激素的回收率仅为0.63％～77.55％(平均26.42％)，未能达到检测目的。
对比例3：不加清洗步骤
不加清洗步骤，即收集三次离心后的萃取液离心30min，取上清液盛于玻璃氮吹管中，在氮吹仪上用稳定氮气流吹干，再准确加入1.0mL甲醇复溶，最后直接用针式过滤器将样品过0.22μm PTFE膜后保存于棕色色谱瓶待测。不加清洗步骤的样品为黄褐色甚至深棕色，具有损伤仪器的风险，各激素的回收率为27.98％～78.83％(平均43.11％)，检测效果不如实施例2，并且样品冷冻保存后会出现絮状沉淀，不能到达上机要求。
对比例4：采用传统固相萃取法作为清洗步骤
以传统SPE作为清洗步骤，即在氮吹仪上吹干并加入1.0mL甲醇复溶后，用超纯水定容至500mL，在固相萃取装置上安装Waters OasisHLB固相萃取柱(200mg，6cc)，连接好真空泵、防倒吸装置和进样管，先依次通过5mL甲醇和5mL超纯水将固相萃取柱活化，然后在真空下将500mL样品全部通过固相萃取柱，流速控制在10mL/min，再通入10mL10％甲醇水溶液进行清洗。继续真空抽气30min以上将固相萃取柱吹干，然后以5mL/min依次通过7mL甲醇和7mL甲醇/丙酮(1:1，v/v)将萃取的激素洗脱至玻璃氮吹管，然后再平稳氮气流下浓缩至1mL，过0.22μm PTFE膜后保存于棕色色谱瓶待测。该方法得到的样品颜色与未加清洗步骤的样品比略浅，但不十分明显，说明对有机质的去除有限，回收率结果显示该方法对目标激素也造成一定损失，回收率在17.80％～118.60％之间，平均回收率为53.96％，高于不加清洗步骤的回收率，但显著低于实施例2的回收率。
综上所述，本发明用甲醇和乙腈对高有机质固体样品中的22种甾体激素进行萃取，以PSA为吸附剂对浓缩萃取液进行清洗净化，再用LC-MS/MS进行定量，经过投加量优化后，22中甾体激素的回收率达到63.5％以上，平均回收率为94.7％，检测限低，操作简便，达到微量有机污染物定量检测的要求。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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