一种药物或其中间体中叠氮化钠的检测方法
阅读说明：本技术 一种药物或其中间体中叠氮化钠的检测方法 (Method for detecting sodium azide in medicine or intermediate thereof ) 是由 马桂霞 任霞 邵长凯 李英杰 于 2021-09-26 设计创作，主要内容包括：本申请属于医药检测技术领域,具体涉及一种药物或其中间体中叠氮化钠的检测方法。该方法采用液相色谱法进行检测,采用十八烷基硅烷键合硅胶柱和分子排阻色谱柱联用来实现叠氮化钠的快速分离和检测,检测成本低。该方法可实现叠氮化钠的低成本、快速、准确的定量测定。(The application belongs to the technical field of medicine detection, and particularly relates to a method for detecting sodium azide in a medicine or an intermediate thereof. The method adopts liquid chromatography for detection, realizes rapid separation and detection of sodium azide by combining an octadecylsilane chemically bonded silica column and a molecular exclusion chromatographic column, and has low detection cost. The method can realize low-cost, quick and accurate quantitative determination of the sodium azide.)
技术领域
本申请属于医药检测技术领域，具体涉及一种药物或其中间体中叠氮化钠的检测方法。
背景技术
叠氮化钠是一类含有三个氮相连结构的化合物，一般用NaN3表示。叠氮化钠是电子传递系统的抑制剂，能与细胞色素形成配位化合物，阻止细胞色素氧化酶氧化型a3组分的还原作用。叠氮化钠剧毒，因此，必须严格控制药物及其中间体叠氮化钠的含量。
叠氮化钠是药物合成过程中的常见关键物料。如厄贝沙坦、缬沙坦、坎地沙坦等沙坦类药物；拉氧头孢钠、头孢哌酮钠、头孢孟多酯钠、等孢菌素药物；齐多夫定等药物，合成中均用到叠氮化钠作为物料。这些药物及其中间体均需要严格控制其中叠氮化钠的含量。
目前，叠氮化钠的含量限定已经被写入了部分药品的标准，比如厄贝沙坦，其原料质量标准中明确要求了叠氮化钠的含量限度以按标法计以峰面积计算不得过0.001％。
拉氧头孢钠起始物料之一为1-甲基-5-巯基四氮唑，1-甲基-5-巯基四氮唑生产过程中用到叠氮化钠为起始物料。拉氧头孢钠中叠氮化钠的来源为起始物料1-甲基-5-巯基四氮唑中引入。为了控制拉氧头孢钠成品中的叠氮化钠的含量，可通过控制1-甲基-5-巯基四氮唑中叠氮化钠的含量实现。
中国药典2020年版二部厄贝沙坦原料标准中公开了一种厄贝沙坦原料中叠氮化钠的检测方法，具体内容如下：
系统适用性溶液 取溴化钾、叠氮化钠和硝酸钾各适量，加90％甲醇溶液溶解并稀释制成每1ml中各约含0.2μg的混合溶液。
色谱条件 用阴离子交换色谱柱(lonPac AS18柱，或效能相当的色谱柱)；检测器为电导检测器；检测方式为抑制电导检测；柱温30℃；以氢氧化钾溶液为淋洗液，按下表程序进行分析柱浓度梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；用阀切换在线基体消除法(见附2)对供试品溶液进样后在线处理；进样体积200μl。
系统适用性要求 系统适用性溶液色谱图中，叠氮根与溴离子及硝酸根的分离度应大于 1.5。
测定法 精密量取供试品溶液与对照品溶液，分别注入离子色谱仪，记录色谱图。
限度 供试品溶液色谱图中如显叠氮化钠峰，按外标法以峰面积计算，不得过0.001％。
该方法中，采用离子色谱法进行检测，需要用带有富集装置的离子色谱仪、预处理柱、富集柱、切换阀，以及专用的离子色谱柱。具备该项功能的离子色谱仪价格昂贵，使用率低，其耗材离子色谱柱、电导抑制器、淋洗液等耗材均价格昂贵，综合成本约一百万人民币，且耗材寿命低，检测成本高昂。
专利CN108982695A公开了一种衍生化HPLC法测定药物或其中间体中叠氮化合物的方法，首先在实验温度下，使用联苯酰氯类衍生化试剂对叠氮化合物进行衍生化反应5～60min，反应液作为样品进行检测；以上述生成的衍生化反应液作为样品，利用HPLC-DAD法在 220～300nm之间测定衍生化产物，从而实现对药物或其合成中间体中叠氮化合物的定量检测。本发明能够避免药物或合成中间体本身带来的基质干扰，建立一种灵敏度高、专属性强、简单通用的柱前衍生化方法继而以HPLC方法测定药物或其合成中间体中叠氮化合物的残留量，提高了叠氮化合物检测方法的灵敏度和专属性。该方法中，采用衍生化法进行检测，检测目标为衍生化后的化合物而非叠氮钠本身，专属性受限且操作步骤烦琐，易受客观环境的影响；各化合物例如头孢类化合物本身易于降解且降解产物复杂，该专利提供的图4、图5、图6均表明含有大量其他色谱峰，衍生产物易受其他色谱峰的干扰，破坏方法的专属性。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种药物或其中间体中叠氮化钠的检测方法，该方法采用液相色谱法进行检测，采用成本较低的耐酸十八烷基硅烷键合硅胶柱和分子排阻色谱柱联用来实现叠氮化钠的快速分离和检测，检测成本低。该方法可实现叠氮化钠的低成本、快速、准确的定量测定。
一种药物或其中间体中叠氮化钠的检测方法，所述检测方法为高效液相色谱法。
所述药物为沙坦类药物、头孢类药物和齐多夫定。
优选的，所述药物为厄贝沙坦、替米沙坦、缬沙坦、坎地沙坦、拉氧头孢钠、头孢哌酮钠、头孢孟多酯钠、齐多夫定。
所述拉氧头孢钠其中间体为1-甲基-5-巯基四氮唑。
上述的药物或其中间体中叠氮化钠的检测方法，包括如下步骤：
采用高效液相色谱法进行检测，将药物或其中间体供试品溶液通过第一色谱柱和第二色谱柱进行在线处理后直接进入液相色谱仪的检测器进行检测，得到药物或其中间体中叠氮化钠的量；所述第一色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，第二色谱柱为分子排阻色谱柱，所述第一色谱柱和第二色谱柱通过六通阀连接，采用在线阀切换技术在4-6分钟进行阀切换。
优选的，所述第一色谱柱为耐酸十八烷基硅烷键合硅胶柱。
更优选的，所述第一色谱柱为Venusil ASB C18，4.6×250mm，5μm。
优选的，所述第二色谱柱以磺化交联的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物钙型强阳离子交换树脂为填充剂更优选的，所述第二色谱柱CHRomegabond CAM Ca2+8％ES INDUSTRIES300×7.8mm，8μm。
上述的药物或其中间体中叠氮化钠的检测方法，所述高效液相色谱法的色谱条件为：输液系统包含梯度泵A与恒流泵B，梯度泵A以0.05％硫酸溶液为流动相A，甲醇为流动相B，流速为1.0ml/min，按下表与下图进行线性梯度洗脱与阀切换，阀切换时间4分钟(泵A→柱 A→废液，泵B→柱B→检测器)与6分钟(泵A→柱A→柱B→检测器，泵B→废液)；恒流泵B以0.05％硫酸溶液为流动相，流速为每分钟0.5ml；柱温为60℃；检测波长为210nm；进样体积100μl。
本发明的药物或其中间体中叠氮化钠的检测方法，采用高效液相仪来进行检测，其输液系统采用梯度泵A与恒流泵B；色谱柱系统采用十八烷基硅烷键合硅胶柱和分子排阻色谱柱串联，中间通过六通阀进行串联，采用在线阀切换技术将叠氮化钠进行分离。其分离的具体机理为：第一步，利用叠氮化钠与药物或其中间体在十八烷基硅烷键合硅胶柱上的保留能力不同，选用低有机相浓度的流动相，叠氮化钠先流出色谱柱，药物或中间体后流出色谱柱；第二步，叠氮化钠流出十八烷基硅烷键合硅胶柱后，进入与上述色谱柱串联分子排阻色谱柱；第三步，通过转换阀切断上述二色谱柱的连接，目的为防止药物或中间体进入分子排阻色谱柱；第四步，执行泵梯度程序用高浓度有机相的流动相洗脱十八烷基硅烷键合硅胶柱，药物与中间体流出后通过泵梯度程序选择低有机相浓度的流动相平衡色谱柱以进行下次检测；第五步，在进行第四步的同时叠氮化钠流出分子排阻色谱柱，进入检测器，完成检测。
梯度泵A与恒流泵B的连接状态见图9。
具体地，一种药物或其中间体中叠氮化钠的检测方法，包括如下步骤：
色谱条件 输液系统包含梯度泵A与恒流泵B，第一色谱柱为耐酸硅胶色谱柱；第二色谱柱以磺化交联的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物钙型强阳离子交换树脂为填充剂；所述第一色谱柱和第二色谱柱通过六通阀连接；梯度泵A以0.05％硫酸溶液为流动相A，甲醇为流动相B，流速为1.0ml/min，按下表与下图进行线性梯度洗脱与阀切换，阀切换时间4分钟(1状态) 与6分钟(0状态)；恒流泵B以0.05％硫酸溶液为流动相，流速为每分钟0.5ml；柱温为60℃；检测波长为210nm；进样体积100μl；
溶剂：50％甲醇水；
线性关系溶液 取叠氮化钠对照品，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含叠氮化钠0.2mg的溶液；精密量取1ml置50ml量瓶中，用溶剂定量稀释至刻度，摇匀；分别精密量取1、2、3、4、5ml置10ml量瓶中，用溶剂定量稀释至刻度，摇匀，即得线性关系试验溶液1、2、3、4、5；
供试品溶液 称取药物或其中间体1.0g，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂使溶解并定量稀释至刻度，摇匀；
系统适用性要求 取线性关系试验1溶液作为灵敏度溶液；灵敏度溶液色谱图中，叠氮化钠色谱峰高的信噪比应大于10，以线性关系溶液中各组分峰面积与相应浓度绘制标准曲线，计算线性回归方程，相关系数(r)应不小于0.995；
测定法 精密量取供试品溶液和线性关系溶液各100μl注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有与叠氮化钠保留时间一致的色谱峰，按线性回归方程计算，即得。
优选的，上述的药物或其中间体中叠氮化钠的检测方法中，所述第一色谱柱为Venusil ASB C18，4.6×250mm，5μm。
优选的，上述的药物或其中间体中叠氮化钠的检测方法中，所述第二色谱柱为CHRomegabond CAM Ca2+8％ES INDUSTRIES 300×7.8mm，8μm。
本发明的优选技术方案之一：
一种1-甲基-5-巯基四氮唑中叠氮化钠的检测方法，包括如下步骤：
色谱条件 输液系统包含梯度泵A与恒流泵B，第一色谱柱(推荐色谱柱VenusilASB C18，4.6×250mm，5μm，或效能相当的色谱柱)，第二色谱柱(磺化交联的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物钙型强阳离子交换树脂为填充剂，推荐色谱柱CHRomegabond CAM Ca2+8％ESINDUSTRIES 300×7.8mm，8μm，或效能相当的色谱柱)。所述第一色谱柱和第二色谱柱通过六通阀连接；梯度泵A以0.05％硫酸溶液为流动相A，甲醇为流动相B，流速为1.0ml/min，按下表与下图进行线性梯度洗脱与阀切换，阀切换时间4分钟(1状态)与6分钟(0状态)；恒流泵B以0.05％硫酸溶液为流动相，流速为每分钟0.5ml；柱温为60℃；检测波长为210nm；进样体积100μl。
溶剂：50％甲醇水。
线性关系溶液 取叠氮化钠对照品，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含叠氮化钠0.2mg的溶液；精密量取1ml置50ml量瓶中，用溶剂定量稀释至刻度，摇匀；分别精密量取1、2、3、4、5ml置10ml量瓶中，用溶剂定量稀释至刻度，摇匀，即得线性关系试验溶液1、2、3、4、5。
供试品溶液 称取1-甲基-5-巯基四氮唑1.0g，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂使溶解并定量稀释至刻度，摇匀。
系统适用性要求 取线性关系试验1溶液作为灵敏度溶液。灵敏度溶液色谱图中，叠氮化钠色谱峰高的信噪比应大于10，以线性关系溶液中各组分峰面积与相应浓度绘制标准曲线，计算线性回归方程，相关系数(r)应不小于0.995。
测定法 精密量取供试品溶液和线性关系溶液各100μl注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有与叠氮化钠保留时间一致的色谱峰，按线性回归方程计算，含叠氮化钠不得过12ppm。
有益效果：
(1)本发明的药物或其中间体中叠氮化钠的检测方法中，该方法采用液相色谱法进行检测，采用成本较低的耐酸十八烷基硅烷键合硅胶柱和分子排阻色谱柱联用来实现叠氮化钠的快速分离和检测，检测成本低。可实现叠氮化钠的低成本、快速、准确的定量测定。液相色谱法所用的仪器为液相色谱仪，是药品检测领域的常用仪器，其仪器成本仅为离子色谱仪的 5-20％。耐酸十八烷基硅烷键合硅胶柱和分子排阻色谱柱均为常用色谱柱，其成本较之离子色谱柱低许多。
(2)本发明的药物或其中间体中叠氮化钠的检测方法中，通过两根色谱柱在线实现叠氮化钠的快速分离和检测。第一色谱柱是硅胶柱，因叠氮化钠在硅胶柱上无保留，但是药物或其中间体一般能在硅胶柱柱上有保留且保留时间长，用0.05％硫酸溶液冲不出来，因此，第一根C18柱用于分离除叠氮化钠和叠氮化钠相似的极性的部分物质，其他的物质在C18柱中被吸附；第二色谱柱是磺化交联的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物钙型强阳离子，是分子它是分子排阻色谱柱，它是根据分子量的大小来分离的，相当于把叠氮化钠和叠氮化钠相似的极性的部分物质根据分子量大小来进行分离。通过在两根色谱柱之间添加六通阀，实现了1-甲基-5- 巯基四氮唑中叠氮化钠的快速分离。
附图说明
图1为空白溶剂液相色谱图，
图2为叠氮化钠定位溶液液相色谱图。
图3为供试品溶液液相色谱图。
图4为供试品混合溶液液相色谱图。
图5为叠氮化钠灵敏度溶液液相色谱图。
图6为叠氮化钠线性关系图。
图7为对比例1得到的色谱图。
图8为对比例2得到的色谱图。
图9为梯度泵A与恒流泵B的连接状态示意图。其中，图9-A为1状态，图9-B为0 状态。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式来对本申请作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本申请，但并不以此限制本发明。
本发明的实施例中所用的实验仪器、试剂和材料都可以通过市购获得。
一种药物或其中间体中叠氮化钠的检测方法，所述检测方法为高效液相色谱法。所述药物为沙坦类药物、头孢类药物和齐多夫定。具体为厄贝沙坦、替米沙坦、缬沙坦、坎地沙坦、拉氧头孢钠、头孢哌酮钠、头孢孟多酯钠、齐多夫定。所述拉氧头孢钠其中间体为1-甲基-5- 巯基四氮唑。
一种药物或其中间体中叠氮化钠的检测方法，包括如下步骤：
色谱条件 输液系统包含梯度泵A与恒流泵B，第一色谱柱为耐酸硅胶色谱柱；第二色谱柱以磺化交联的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物钙型强阳离子交换树脂为填充剂；所述第一色谱柱和第二色谱柱通过六通阀连接；梯度泵A以0.05％硫酸溶液为流动相A，甲醇为流动相B，流速为1.0ml/min，按下表与下图进行线性梯度洗脱与阀切换，阀切换时间4分钟与6分钟；恒流泵B以0.05％硫酸溶液为流动相，流速为每分钟0.5ml；柱温为60℃；检测波长为210nm；进样体积100μl；
溶剂：50％甲醇水；
线性关系溶液 取叠氮化钠对照品，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含叠氮化钠0.2mg的溶液；精密量取1ml置50ml量瓶中，用溶剂定量稀释至刻度，摇匀；分别精密量取1、2、3、4、5ml置10ml量瓶中，用溶剂定量稀释至刻度，摇匀，即得线性关系试验溶液1、2、3、4、5；
供试品溶液 称取药物或其中间体1.0g，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂使溶解并定量稀释至刻度，摇匀；
系统适用性要求 取线性关系试验1溶液作为灵敏度溶液；灵敏度溶液色谱图中，叠氮化钠色谱峰高的信噪比应大于10，以线性关系溶液中各组分峰面积与相应浓度绘制标准曲线，计算线性回归方程，相关系数(r)应不小于0.995；
测定法 精密量取供试品溶液和线性关系溶液各100μl注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有与叠氮化钠保留时间一致的色谱峰，按线性回归方程计算，即得。
拉氧头孢钠起始物料之一为1-甲基-5-巯基四氮唑，1-甲基-5-巯基四氮唑生产过程中用到叠氮化钠为起始物料。拉氧头孢钠中叠氮化钠的来源为起始物料1-甲基-5-巯基四氮唑中引入。为了控制拉氧头孢钠成品中的叠氮化钠的含量，需要控制1-甲基-5-巯基四氮唑中叠氮化钠的含量。
实施例1 1-甲基-5-巯基四氮唑中叠氮化钠的含量测定及其方法学实验
需验证的检测方法如下：
照高效液相色谱法(中国药典2020年版四部通则0512)测定。
色谱条件 输液系统包含梯度泵A与恒流泵B，第一色谱柱(推荐色谱柱VenusilASB C18，4.6×250mm，5μm，或效能相当的色谱柱)，第二色谱柱(磺化交联的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物钙型强阳离子交换树脂为填充剂，推荐色谱柱CHRomegabond CAM Ca2+8％ESINDUSTRIES 300×7.8mm，8μm，或效能相当的色谱柱)。所述第一色谱柱和第二色谱柱通过六通阀连接；具体连接见下图。
梯度泵A以0.05％硫酸溶液为流动相A，甲醇为流动相B，流速为1.0ml/min，按下表与下图进行线性梯度洗脱与阀切换，阀切换时间4分钟(1状态)与6分钟(0状态)；恒流泵 B以0.05％硫酸溶液为流动相，流速为每分钟0.5ml；柱温为60℃；检测波长为210nm；进样体积100μl。
梯度泵A与恒流泵B的连接状态见图9。
溶剂：50％甲醇水。
线性关系溶液 取叠氮化钠对照品，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含叠氮化钠0.2mg的溶液；精密量取1ml置50ml量瓶中，用溶剂定量稀释至刻度，摇匀；分别精密量取1、2、3、4、5ml置10ml量瓶中，用溶剂定量稀释至刻度，摇匀，即得线性关系试验溶液1、2、3、4、5。
供试品溶液 称取1-甲基-5-巯基四氮唑1.0g，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂使溶解并定量稀释至刻度，摇匀。
系统适用性要求 取线性关系试验1溶液作为灵敏度溶液。灵敏度溶液色谱图中，叠氮化钠色谱峰高的信噪比应大于10，以线性关系溶液中各组分峰面积与相应浓度绘制标准曲线，计算线性回归方程，相关系数(r)应不小于0.995。
测定法 精密量取供试品溶液和线性关系溶液各100μl注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有与叠氮化钠保留时间一致的色谱峰，按线性回归方程计算，含叠氮化钠不得过12ppm。
此处不能改，涉及到换算。
1、方法学试验
表1方法学验证信息汇总
1.1专属性试验
溶剂：50％甲醇水
叠氮化钠贮备溶液：精密称取叠氮化钠19.99mg，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并定量稀释至刻度，摇匀。
叠氮化钠定位溶液：精密量取叠氮化钠贮备溶液1ml置50ml量瓶中，用溶剂定量稀释至刻度，摇匀。
供试品空白溶液：称取1-甲基-5-巯基四氮唑原料1.0019g，置10ml量瓶中，加溶剂使溶解并定量稀释至刻度，摇匀。
供试品混合溶液：称取1-甲基-5-巯基四氮唑原料1.0068g，置10ml量瓶中，加叠氮化钠定位溶液3ml使溶解，加溶剂溶解并定量稀释至刻度，摇匀。
检测及结果：分别精密量取空白溶剂、定位溶液、供试品溶液、供试品混合溶液各100μl 注入液相色谱仪，记录色谱图，色谱图见图1～图4。结论：叠氮化钠保留时间为29.670分钟；空白溶剂在叠氮化钠色谱峰处无色谱峰，对检测无干扰，供试品溶液、供试品混合溶液色谱图在叠氮化钠色谱峰相邻处无色谱峰，对检测无干扰。
5.2灵敏度试验
灵敏度溶液：精密称取叠氮化钠19.99mg，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并定量稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml置50ml量瓶中，用溶剂定量稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml置10ml量瓶中，用溶剂定量稀释至刻度，摇匀。
可接受限度：灵敏度溶液色谱图中，叠氮化钠峰峰高的信噪比应大于10。
检测及结果：精密量取上述溶液100μl注入液相色谱仪，记录色谱图，色谱图见图5，由色谱图可知，S/N为47.57。
结论：灵敏度溶液色谱图中，叠氮化钠峰峰高的信噪比为47.57，符合规定。
5.3线性关系试验
线性贮备溶液：精密称取叠氮化钠19.99mg，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并定量稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml置50ml量瓶中，用溶剂定量稀释至刻度，摇匀。
线性关系溶液：分别精密量取上述溶液1、2、3、4、5ml置10ml量瓶中，用溶剂定量稀释至刻度，摇匀，得线性关系溶液1、2、3、4、5。
可接受限度：相关系数≥0.995。
检测及结果：精密量取上述溶液各100μl注入液相色谱仪，记录色谱图，计算线性方程参数，结果见表2。
表2叠氮化钠线性关系试验数据
No
体积(ml)
浓度(μg/ml)
峰面积
线性关系试验溶液1
1
0.3978
19259
线性关系试验溶液2
2
0.7956
40207
线性关系试验溶液3
3
1.193
62793
线性关系试验溶液4
4
1.591
84842
线性关系试验溶液5
5
1.989
107085
线性关系图见图6：得线性方程：A＝55379C-3246，R＝0.9999。
结论：符合规定。
5.4检测限及定量限
检测限：确定在该检测条件下，叠氮化钠可以被检出的最低限度；
定量限：确定在该检测条件下，叠氮化钠可以被准确定量的最低量。
信噪比法：取叠氮化钠对照品适量，加溶剂溶解并稀释至所需浓度，依法测定，检测限以信噪比S/N为2～3计；定量限以信噪比S/N为10计。
直观法：以被测物能被定量测定的最低量确定定量限，以准确度试验最低浓度计算。
(1)信噪比法
取叠氮化钠对照品适量，加溶剂溶解并稀释至所需浓度，依法测定，检测限以信噪比S/N 为2～3计；定量限以信噪比S/N为10计。
叠氮化钠定量限溶液：精密称取叠氮化钠19.99mg，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并定量稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml置50ml量瓶中，用溶剂定量稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml置10ml量瓶中，用溶剂定量稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液2ml置10ml量瓶中，用溶剂定量稀释至刻度，摇匀。
叠氮化钠检测限溶液：精密量取定量限溶液5ml置10ml量瓶中，用溶剂定量稀释至刻度，摇匀。
可接受标准：定量限浓度小于线性关系试验溶液1浓度；定量限峰面积RSD％＜10.0％，保留时间RSD％＜2.0％。
检测及结果：精密量取上述溶液各100μl分别注入液相色谱仪，定量限溶液连续测定6 次，检测限溶液测定1次。计算得叠氮化钠定量限浓度为0.07956μg/ml，S/N值见表3，定量限为0.007956μg，相当于供试品0.007956ppm；检测限浓度为0.03978μg/ml，S/N值为2.89，检测限为0.003978μg，相当于供试品0.003978ppm；计算结果见表3。
表3叠氮化钠信噪比法定量限测定数据
次数
1
2
3
4
5
6
RSD％
保留时间
29.689
29.593
29.584
29.647
29.624
29.717
0.2
峰面积
2895
2659
2430
2502
2822
2584
6.9
S/N
10.42
7.98
11.02
11.10
9.74
8.37
NA
(2)直观法
叠氮化钠定量限溶液：精密称取叠氮化钠19.99mg，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并定量稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml置50ml量瓶中，用溶剂定量稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml置10ml量瓶中，用溶剂定量稀释至刻度，摇匀。
可接受标准：定量限供试品溶液色谱图中，叠氮化钠峰保留时间RSD％≤2.0％；峰面积 RSD％≤5.0％。
检测及结果：精密量取上述供试品溶液100μl注入液相色谱仪，连续测定6次，记录色谱图。结果见表4。
表4叠氮化钠定量限溶液测定数据
次数
1
2
3
4
5
6
RSD％
保留时间
29.664
29.618
29.652
29.677
29.617
29.646
0.09
峰面积
19305
18977
18516
19074
18670
19030
1.6
结论：直观法定量限叠氮化钠峰保留时间RSD％为0.09％；峰面积RSD％为1.6％。
5.5系统精密度试验
确定在该检测条件下，仪器重复多次地完成同一变化过程所对应的结果变化。
可接受限度：响应值RSD％≤6.0％。
检测及结果：精密量取线性关系溶液(3)100μl注入液相色谱仪，记录色谱图，连续测定6次。结果见表5。
表5叠氮化钠精密度试验数据
次数
1
2
3
4
5
6
均值
RSD％
峰面积
62646
63786
63286
63465
62992
63072
63208
0.7
结论：符合规定。
5.6准确度试验
确定叠氮化钠用所确定的方法检测测定的结果与真实值接近的程度。
可接受限度：回收率75％～120％。
准确度贮备溶液：精密称取叠氮化钠19.99mg，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并定量稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml置50ml量瓶中，用溶剂定量稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液：精密量取准确度贮备溶液3ml置10ml量瓶中，用溶剂定量稀释至刻度，摇匀。
准确度供试品溶液：称取1-甲基-5-巯基四氮唑原料约1.0g置10ml量瓶中，按表6加入各溶液，加溶剂溶解并定量稀释至刻度，摇匀。
表6准确度供试品溶液配制方法
检测及结果：精密量取对照品溶液及供试品溶液各100μl注入液相色谱仪，记录色谱图，用外标法计算得测得量及回收率，结果见表7。
表7叠氮化钠准确度试验数据
结论：回收率1平均值为81.2％，RSD％为2.8％；回收率2平均值为93.0％，RSD％为0.6％；回收率3平均值为96.6％，RSD％为0.5％，均符合规定。
5.7重复性试验
确定同一份供试品，由同一分析人员经多次取样测定所得结果之间的接近程度。
重复性贮备溶液：精密称取叠氮化钠20.01mg，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并定量稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml置50ml量瓶中，用溶剂定量稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液：精密量取重复性贮备溶液3ml置10ml量瓶中，用溶剂定量稀释至刻度，摇匀。
供试品溶液：称取1-甲基-5-巯基四氮唑原料约1.0g置10ml量瓶中，加入3.0ml重复性贮备溶液，加溶剂溶解并定量稀释至刻度，摇匀。连续制备6份。
可接受限度：RSD％≤6.0％。
检测及结果：精密量取对照品溶液及供试品溶液各100μl注入液相色谱仪，记录色谱图，用外标法计算得测得量与回收率，并计算平均值及RSD％。结果见表8。
表8叠氮化钠重复性试验数据
结论：叠氮化钠回收率平均值为98.0％，RSD％为2.1％，符合规定。
6、结论
经过对检测方法进行详细的验证，方法的专属性、线性关系、灵敏度、系统精密度、准确度、重复性均符合规定，适用于1-甲基-5-巯基四氮唑中叠氮化钠的检测。
7、检测结果
取1-甲基-5-巯基四氮唑原料，依法检测，结果见表9。
表9样品检测结果
对比例1仅用十八烷基硅烷键合硅胶柱的方法及图谱
色谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动相：0.1％磷酸溶液；流速0.5ml/min，检测波长205nm，柱温35℃。图谱见图7。由图7可以看出供试品中待测物位置有严重干扰。
对比例2仅用分子排阻色谱柱的方法及图谱
色谱条件：磺化交联的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物钙型强阳离子交换树脂为填充剂；流动相：0.05％硫酸水；流速0.5ml/min，检测波长210nm，柱温60℃。图谱见图8。由图8可以看出供试品中待测物位置有严重干扰。
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