具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种反刍动物瘤胃液中挥发性脂肪酸含量的测定方法，包括如下步骤：

S1，标准溶液配制

分别准确称取乙酸、丙酸、丁酸标准品，纯水定容，配制成320mmol/L乙酸、32mmol/L丙酸、32mmol/L丁酸的混标储备液，备用；分别移取不同体积的标准储备液，配置成浓度分别为样品测定浓度的80％、100％和120％混合标准品溶液；

S2，顶空进样条件

顶空进样器条件：平衡温度85℃，样品流路温度180℃，传输线温度200℃，平衡时间30min，进样时间1min；

S3，气相色谱条件

色谱柱为SH-Stabilwax石英毛细管色谱柱；进样口温度200℃，载气为氮气，载气压力100kPa，分流比50:1；

升温程序：80℃保持1min，以8℃/min升温至170℃，20℃/min升温至220℃，保持4min；FID检测器温度220℃；

S4，样品处理

检测样品包括奶牛和湖羊的天然瘤胃液和人工瘤胃发酵液，准确量取1mL样品于20mL顶空瓶中，硅胶隔垫密封，铝盖封口，混合均匀后置于自动顶空进样器中，在一定温度下平衡预热一段时间后取平衡气体进行测定。

进一步地，为确定最佳的平衡温度，本实验选取60、65、70、75、80和85℃这6个温度进行HS-GC分析，在85℃时样品出峰达到最大值。

进一步地，比较平衡时间分别为20、25、30、35、40和45min的响应信号强度，在30min时峰面积达到最大值。

进一步地，在同一天内，取同一批样品每隔2h测定一次，每天连续测定6次，计算日内精密度。

进一步地，取同一样品在4℃下存放，连续测定3d，考察样品的日间精密度。

进一步地，将已知浓度的标准品溶液存放于4℃下，连续3d取样进行HS-GC分析，考察标准溶液在存放3d内的稳定性。

进一步地，取晨饲前空腹的湖羊瘤胃液样品，测定其中的挥发性脂肪酸浓度后，分别在其中加入浓度分别为样品测定浓度的80％、100％和120％，按照下式计算加标回收率：

加标回收率＝(加标试样测定值－初始量)/加标量×100％。

进一步地，取奶牛瘤胃液、湖羊瘤胃液以及瘤胃液人工发酵后的产物各3份，测定挥发性脂肪酸的含量。

实施例2

本实施例提供一种具体的测试方法如下：

一种反刍动物瘤胃液中挥发性脂肪酸含量的测定方法，包括如下步骤：

1材料与方法

1.1仪器与试剂

HSS 86.50顶空进样器(意大利DANI公司)；GC-2010Plus气相色谱仪(日本岛津公司)，配备氢火焰离子化检测器(FID)；Eppendorf系列移液器；顶空瓶压盖器购自飞鸿包装材料厂(江苏省南通市)；冰乙酸、丙酸、丁酸均为色谱纯，购自阿拉丁公司(上海市)；乙醇、丙醇、丁醇均为色谱纯，购自百灵威公司(北京市)；空气、氮气、氢气均购自杭州今工物资有限公司；超纯水由NANO pure UV/UF超纯水系统生产。

1.2标准溶液配制

分别准确称取乙酸、丙酸、丁酸标准品，纯水定容，配制成320mmol/L乙酸、32mmol/L丙酸、32mmol/L丁酸的混标储备液，备用。分别移取不同体积的标准储备液，配置成不同浓度的混合标准品溶液。

1.3顶空进样条件

顶空进样器条件：平衡温度85℃，样品流路温度180℃，传输线温度200℃，平衡时间30min，进样时间1min。

1.4气相色谱条件

色谱柱为SH-Stabilwax石英毛细管色谱柱(30m×0.25mm，)；进样口温度200℃，载气为氮气(99.999％)，载气压力100kPa，分流比50:1。升温程序：80℃保持1min，以8℃/min升温至170℃，20℃/min升温至220℃，保持4min；FID检测器温度220℃。

1.5样品处理

检测样品包括奶牛和湖羊的天然瘤胃液和人工瘤胃发酵液，准确量取1mL样品于20mL顶空瓶中，硅胶隔垫密封，铝盖封口，混合均匀后置于自动顶空进样器中，在一定温度下平衡预热一段时间后取平衡气体进行测定。

2结果与分析

2.1平衡温度

为确定最佳的平衡温度，本实验选取60、65、70、75、80和85℃这6个温度进行HS-GC分析，发现随着温度的升高，VFA各组分峰面积响应值随之变大，在85℃时样品出峰达到最大值；由于随着温度的进一步升高，水蒸气含量增大，顶空瓶的蒸汽压力随之加大，使得顶空瓶的承压加大并存在安全隐患问题，同时蒸气压的增大亦会导致顶空瓶的气密性变差，影响数据的重复性(图1)。因此本发明最终选取的顶空平衡温度为85℃。

2.2平衡时间

比较平衡时间分别为20、25、30、35、40和45min的响应信号强度，发现随着平衡时间的延长，峰面积响应值变大，在30min时峰面积达到最大值。随着平衡时间的进一步延长，样品的峰面积减小，同时数据的重复性变差(RSD＞5％)。基于数据的稳定性，兼顾时间效率和峰面积，本发明最终选取30min为最佳进样时间(图2)。

2.3线性范围和检出限(limit of detection,LOD)

取梯度稀释的混标溶液进行HS-GC测定，得到了乙酸、丙酸、丁酸的线性回归方程，并以信噪比S/N≥3分析3种挥发酸的检出限，结果见表1。

表1挥发性脂肪酸的保留时间、线性范围、线性回归方程及检出限

由表1可见，乙酸、丙酸、丁酸在相应的浓度范围内，线性相关系数均大于0.9997，表示在该方法的浓度范围内，挥发性脂肪酸的标准曲线的线性关系良好；由信噪比法计算所得的检出限分别为0.329、0.087、0.036mmol/L，检出限较低，说明该方法可用于反刍动物瘤胃液VFA含量的测定。

2.4精密度考察

2.4.1日内精密度

在同一天内，取同一批样品每隔2h测定一次，每天连续测定6次，计算日内精密度。结果显示，三种挥发性脂肪酸峰面积的相对标准偏差(RSD)均不高于3.3％(表2)，说明方法的精密度良好。

表2日内精密度(n＝6)

2.4.2日间精密度

取同一样品在4℃下存放，连续测定3d，考察样品的日间精密度，发现3d内挥发性脂肪酸峰面积的日间精密度良好，RSD范围为0.333％～2.303％(表3)。

表3日间精密度(n＝3)

n＝3.

2.4.3稳定性

将已知浓度的标准品溶液存放于4℃下，连续3d取样进行HS-GC分析，考察标准溶液在存放3d内的稳定性。实验结果见表4。

表4标准品的稳定性

n＝3.

由表4可见，混合标准品峰面积的RSD均在8.318％以下，说明在该条件下挥发性脂肪酸在3d内有很好的稳定性，测试样品可在3d内用于检测。

2.4.4加标回收率

取晨饲前空腹的湖羊瘤胃液样品，测定其中的挥发性脂肪酸浓度后，分别在其中加入低、中、高3个不同浓度的混合标准品溶液，浓度分别为样品测定浓度的80％、100％和120％，按照下式计算加标回收率。

加标回收率＝(加标试样测定值－初始量)/加标量×100％

测得的样品加标回收率，结果见表5。

表5样品的加标回收率

由表5可见，乙酸和丁酸的加标回收率范围分别为94.09％～108.13％和93.54％～100.35％之间。表明该方法适用于反刍动物瘤胃液中乙酸和丁酸的定量测定。

2.6专属性试验

反刍动物瘤胃液中可能含有其他有机化合物，为考察方法的专属性，取可能存在的乙醇、丙醇、丁醇与乙酸、丙酸和丁酸一定量混合，配成混合溶液，在选定的色谱条件下测定，结果如图3所示。由图3可以看出，3种挥发性脂肪酸与乙醇、丙醇、丁醇等组分分离良好。这些有机化合物的存在不会干扰乙酸、丙酸和丁酸的检出。

2.7样品测定

取奶牛瘤胃液、湖羊瘤胃液以及瘤胃液人工发酵后的产物各3份，测定挥发性脂肪酸的含量，发现奶牛、湖羊瘤胃液以及人工瘤胃发酵液因物种的不同以及进食精粗饲料的比例不同，其挥发性脂肪酸含量也各不相同。测得的乙酸、丙酸、丁酸浓度相对标准偏差(RSD)范围为0.127％～3.333％(表6)。

表6 3种反刍动物瘤胃液中挥发性脂肪酸的含量

VFA是饲料在反刍动物瘤胃内经微生物发酵后产生的主要营养物质，开展反刍动物瘤胃液中VFA的测定对研究肠道微生物与饲料发酵、营养吸收和能量转化率均具有重要意义。在检测过程中，VFA易挥发的特性常导致样品定量不准确、重复性差，同时瘤胃液中的复杂成分亦影响VFA色谱峰形及基线的稳定性。

现有VFA测定方法中，实验样品大都需要经过复杂的前处理操作后方能进样分析。刘立成等^[11]采用过滤离心的方式处理羊瘤胃液，并采用气相色谱外标法测定VFA的含量，结果显示，线性相关系数均未能大于0.999，推测可能是由于样品在过滤离心的过程中造成VFA的损失。戴晨伟等^[12]使用酸化过滤法预处理样品，并建立毛细管柱气相色谱分析方法测定合成气厌氧发酵液中的VFA，实验发现样品色谱图在7.5min后出现了基线漂移，推测可能是因为样品中的杂质导致色谱柱或检测器污染。

本发明采用顶空进样方式，不仅简化了样品的前处理步骤，而且能避免VFA的挥发性损失，提高结果的准确度。本试验检测结果表明，VFA的标准曲线线性关系良好，回归方程相关系数均大于0.9997。此外，顶空进样器排除了样品中非挥发性杂质对气相色谱仪的污染和干扰，有利于色谱峰形和基线的稳定性。张俊瑜等^[13]采用6种不同的方法对瘤胃液中的VFA进行前处理，并通过添加巴豆酸作为内标降低实验误差。除前处理和进样方式不同外，本发明所用的实验仪器和检测方法与之相同或接近，且3种VFA的检出限、线性相关系数、日内精密度、日间精密及稳定性等结果均与之相当，表明顶空气相色谱外标法是一种操作简便且行之有效的瘤胃液VFA检测方法。

本发明采用顶空气相色谱法测定了反刍动物瘤胃液中的VFA含量。该方法无需样品前处理，直接用顶空瓶进样分析，从而最大程度地保留了原始组分，检测结果更接近样品的真实成分。相比于普通进样分析，顶空进样方式有效降低了样品杂质对色谱柱的污染，降低了维护成本，同时节约了样品前处理所用的实验耗材，是一种符合“绿色分析化学”要求的分析手段。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。