具体实施方式

本发明公开了7-氨甲基-7-脱氮鸟嘌呤(PreQ1)的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

酶相关信息：

7-氰基-7-脱氮鸟嘌呤合成酶(QueC synthase):来源于大肠杆菌(Uniprot ID:P77756,EC 6.3.4.20)；

氰基还原酶(Nitrile Reductase,QueF1):来源于胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum，Uniprot ID:C6DAH4,EC 1.7.1.13)；

氰基还原酶(Nitrile Reductase,QueF2):来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis,Uniprot ID:O31678,EC 1.7.1.13)；

多聚磷酸激酶(PPK):来源于苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti,Uniprot ID:Q92SA6,EC 2.7.4.1)；

亚磷酸氧化酶(PTDH):是以施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)体内一个亚磷酸脱氢酶为模板改造而来(Uniprot ID:O69054,EC 1.20.1.1)。

酶的发酵生产：

本发明所需的酶都是通过公司合成相应基因后构建在特定的表达质粒上再通过大肠杆菌发酵生产制得；其具体包含以下步骤：将以上酶所对应的基因进行序列优化后在下单到通用生物公司合成(安徽滁州),再引进NdeI/XhoI酶切位点并亚克隆到pET 28a表达载体上。确认序列正确的质粒转入E.coli(BL21)感受态细胞进行平板培养(擎科生物)以及单克隆小量液体培养，蛋白表达正确的菌最终进行逐级放大液体培养。其具体包含单菌落转入5ml含50μM卡那霉素的LB培养液中(37℃)进行培养，当细胞生长至对数期后接种到250ml含同样抗菌素的LB培养液中，同样生长到对数期时转入5L培养发酵罐里进行培养并进行最终的蛋白表达。在5L发酵罐培养中，当细胞OD～20时加入0.5mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)25℃诱导蛋白表达6小时，最后高速离心收集细胞(4000rpm,20min)获得酶过量表达湿细胞40-70g。取少量细胞先与三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)缓冲液(50mM,pH 8.0)在冰盆上混合均匀，然后利用冻融法破碎细胞、高速离心除细胞壁后清液跑SDS-PAGE凝胶电泳(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)确定蛋白表达。蛋白表达正确的菌体细胞用以进行下一步催化实验，具体来说，将剩余细胞与Tris.HCl缓冲液(50mM,pH8.0)在低温混合均匀(以～10g湿细胞:200ml缓冲液混合)，然后进行低温高压破碎细胞壁，高速离心(16000rpm,45min)除细胞壁后获得含酶清液备用(得到的酶活力在150～300U/ml,U是室温一分钟转化1μmol的底物所需酶量)。LB培养基构成为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉，1％NaCl，1％磷酸氢二钾、1％磷酸氢二钾以及5％的甘油。

表1

表2

本发明化学酶法制备路线如图1所示：

本发明首先利用甲酸甲酯与氯乙酸甲酯在碱性条件下缩合生成2-氯-3-氧丙酸甲酯(化合物1)，然后该中间体在水溶液中与2,4-二氨基-6-羟基嘧啶缩合成环得到7-甲酸甲酯-7-脱氮鸟嘌呤(化合物2)，在弱碱性条件下酯水解得7-羧基-7-脱氮鸟嘌呤(CDG)；最后7-羧基-7-脱氮鸟嘌呤在7-氰基-7-脱氮鸟嘌呤合成酶(QueC synthase,EC 6.3.4.20)催化下生成7-氰基-7-脱氮鸟嘌呤(Pre Q0),PreQ0在专一性的氰基还原酶(NitrileReductase,QueF，EC 1.7.1.13)作用下制备得到最终化合物7-氨甲基-7-脱氮鸟嘌(PreQ1)。由于最后两步酶反应需要用到三磷酸腺苷(ATP)以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH),两种辅酶的适时再生则可以进一步降低生产成本并提高产品品质。

随着大众对工业生产中的个人安全、自然环境保护的重视，绿色化学工业是其发展的必然趋势。考虑到单一制备方法无法实现7-氨甲基-7-脱氮鸟嘌的高效制备，因此通过结合利用化学-酶两种转化的各自独特的优势成为一个重要的选择；同时由于酶催化的环境兼容特性，还可以大大减少制备过程中的废物生成。本专利结合利用PreQ1化学与酶制备工艺，通过有效优化整合，形成一个最佳的制备路线，该路线不仅大大降低了生产成本，同时也更适宜于规模化工业催化。

本发明提供的7-氨甲基-7-脱氮鸟嘌呤(PreQ1)的制备方法中，所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：7-甲酸甲酯-7-脱氮鸟嘌呤(化合物2)的化学制备

路线图如图2所示。

将甲酸甲酯21.2g(350mmol)溶入200ml无水的四氢呋喃(THF)，然后在冰浴下搅拌冷却；4℃分批加入甲醇钠4.32g(80mmol),加完后搅拌30分钟，然后用滴液漏斗缓慢滴加氯乙酸甲酯6.52g(60mmol)。滴加完后4℃拌2小时，然后缓慢升至25℃继续搅拌1小时。最后加入冰水进入反应体系淬灭未反应的甲醇钠，该混合溶液再利用旋转蒸发仪减压抽掉低沸点的未反应的原料甲酸甲酯以及溶剂THF，剩余的水溶液即为产物2-氯-3-氧丙酸甲酯(化合物1)的水溶液，该化合物可不分离直接进行下一步转化。具体步骤是将该水溶液加热90℃然后加入2,4-二氨基-6-羟基嘧啶3.6g(30mmol)加热维持90℃搅拌30分钟，然后将溶液中生成的固体进行过滤干燥，得到5.55g 7-甲酸甲酯-7-脱氮鸟嘌呤(化合物2)白色固体(总收率89％)。

实施例2：7-甲酸-7-脱氮鸟嘌呤(CDG)的化学制备

路线图如图3所示。

将10g 7-甲酸-7-脱氮鸟嘌呤(48mmol)混合到由H₂O(500ml)和DMSO(100ml)组成的混合溶液中，然后加入6ml(5N)的氢氧化钠水溶液，并将该混合液100℃流2小时。最后将溶液冷却至25℃在此过程中有白色固体析出，过滤抽干该固体(8.5g，91％收率)，此即为目标化合物7-甲酸-7-脱氮鸟嘌呤(CDG)。

实施例3：从CDG酶制备7-氰基-7-脱氮鸟嘌(PreQ₀)

路线图如图4所示。

在500ml含有100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中先后加入9.7g 7-甲酸-7-脱氮鸟嘌呤(CDG，100mM)、3.2g氯化胺(120mM)、1.4g三磷酸腺苷二钠盐ATP(5mM)、8.4g偏六磷酸钠(27.5mM)、0.48g氯化镁(10mM)、0.75g氯化钾(20mM)；待pH值调节到8.0后，1000U 7-氰基-7-脱氮鸟嘌呤合成酶QueC(8.3～13.3mg)以及1500U多聚磷酸激酶PPK(5.0～7.5mg)加入溶液启动反应，在反应过程中通过添加0.1N的HCl或NaOH水溶液维持反应体系pH值在6.5～9.0,室温搅拌5小时后反应完全，随后加HCl酸化沉淀反应酶(调节溶液pH值到1.5并快速搅拌)，离心除去蛋白杂质，调节溶液pH值到7.0后利用反渗透除盐，最后利用D201阴离子交换树酯除含磷酸杂质(用去离子水做洗脱液，7-氰基-7-脱氮鸟嘌与树脂结合弱直接流出),冻干后粗品通过纯水:乙醇1:3v/v结晶，最后得到7.4g白色固体(最终收率84％)。

实施例4：从PreQ0酶(QueF1)制备7-氨甲基-7-脱氮鸟嘌(PreQ1)

路线图如图5所示。

同样在1000ml含有50mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中先后加入17.5g 7-氰基-7-脱氮鸟嘌(100mM),1.5gβ-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)单钠盐(0.2mM),52g五水亚磷酸钠(240mM)以及200ml异丙醇。调节反应液pH值到8.0后，加入2000U QueF1以及4000U PTDH(27～67mg)启动反应，该反应液在室温下缓慢搅拌4小时，在反应过程中通过添加HCl或NaOH水溶液维持体系pH值在7.0-8.5之间。反应结束后加HCl溶液沉淀蛋白并高速离心除去，最后利用反渗透膜除盐浓缩后利用乙醇/水结晶得到15.6g白色固体(收率89％)。

实施例5：从PreQ0酶(QueF2)制备7-氨甲基-7-脱氮鸟嘌(PreQ1)

路线图如图6所示。

与上述实施例4类似，这次用的是QueF2酶而非QueF1酶。同样在500ml含有50mM pH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中先后加入4.37g7-氰基-7-脱氮鸟嘌(50mM),0.75gβ-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)单钠盐(0.2mM),13g五水亚磷酸钠(120mM)以及100ml异丙醇。调节反应液pH值到8.0后，加入3000U QueF2(10～20mg)以及4000U PTDH启动(PTDH 27-67mg)反应，该反应液在室温下缓慢搅拌8小时，在反应过程中通过添加HCl或NaOH水溶液维持体系pH值在7.0-8.5之间。反应结束后加HCl溶液沉淀蛋白并高速离心除去，最后利用反渗透膜除盐浓缩后利用乙醇/水结晶得到2.7g白色固体(收率61％)。

实施例6：从CDG直接酶制备7-氨甲基-7-脱氮鸟嘌(PreQ1)(QueC+QueF 1)

路线图如图7所示。

在500ml含有100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中先后加入4.9g 7-甲酸-7-脱氮鸟嘌呤(CDG，50mM)、1.6g氯化胺(60mM)、0.7g三磷酸腺苷二钠盐ATP(2.5mM)、4.2g偏六磷酸钠(13.8mM)、0.48g氯化镁(10mM)、0.75g氯化钾(20mM)、0.75gβ-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)单钠盐(0.2mM),13g五水亚磷酸钠(60mM)以及100ml异丙醇；待溶液pH值调节到8.0后，1000U 7-氰基-7-脱氮鸟嘌呤合成酶QueC(8.3～13.3mg)、1000U QueF1(3.3～6.7mg)、2000U多聚磷酸激酶PPK(6.7～10mg)以及3000U PTDH(20～50mg)加入溶液启动反应，该反应液在室温下缓慢搅拌6小时，同时在反应过程中间隔性的添加HCl或NaOH稀水溶液维持体系pH值在7.0-8.5之间。如上述酶反应后处理相同，反应结束后通过加入稀盐酸水溶液沉淀蛋白并高速离心除去，待溶液pH调回中性后利用反渗透膜除盐，D201阴离子交换树酯除含磷酸杂质，最后得到的7-氨甲基-7-脱氮鸟嘌粗水溶液浓缩后利用乙醇/水结晶得到4.1g白色固体(两步收率91％)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 深圳市瑞德林生物技术有限公司

<120> 7-氨甲基-7-脱氮鸟嘌呤(PreQ1)的制备方法

<130> S21P002357

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 231

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Arg Ala Val Val Val Phe Ser Gly Gly Gln Asp Ser Thr Thr

1 5 10 15

Cys Leu Val Gln Ala Leu Gln Gln Tyr Asp Glu Val His Cys Val Thr

20 25 30

Phe Asp Tyr Gly Gln Arg His Arg Ala Glu Ile Asp Val Ala Arg Glu

35 40 45

Leu Ala Leu Lys Leu Gly Ala Arg Ala His Lys Val Leu Asp Val Thr

50 55 60

Leu Leu Asn Glu Leu Ala Val Ser Ser Leu Thr Arg Asp Ser Ile Pro

65 70 75 80

Val Pro Asp Tyr Glu Pro Glu Ala Asp Gly Ile Pro Asn Thr Phe Val

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Pro Gly Arg Asn Ile Leu Phe Leu Thr Leu Ala Ala Ile Tyr Ala Tyr

100 105 110

Gln Val Lys Ala Glu Ala Val Ile Thr Gly Val Cys Glu Thr Asp Phe

115 120 125

Ser Gly Tyr Pro Asp Cys Arg Asp Glu Phe Val Lys Ala Leu Asn His

130 135 140

Ala Val Ser Leu Gly Met Ala Lys Asp Ile Arg Phe Glu Thr Pro Leu

145 150 155 160

Met Trp Ile Asp Lys Ala Glu Thr Trp Ala Leu Ala Asp Tyr Tyr Gly

165 170 175

Lys Leu Asp Leu Val Arg Asn Glu Thr Leu Thr Cys Tyr Asn Gly Phe

180 185 190

Lys Gly Asp Gly Cys Gly His Cys Ala Ala Cys Asn Leu Arg Ala Asn

195 200 205

Gly Leu Asn His Tyr Leu Ala Asp Lys Pro Thr Val Met Ala Ala Met

210 215 220

Lys Gln Lys Thr Gly Leu Arg

225 230

<210> 2

<211> 282

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Val Tyr Asp Lys His Gln Ala Leu Ser Gly Leu Thr Leu Gly

1 5 10 15

Lys Pro Thr Pro Tyr His Asp Arg Tyr Asp Ala Ala Leu Leu Gln Pro

20 25 30

Val Pro Arg Ser Leu Asn Arg Asp Pro Leu Gly Ile His Pro Asp Ser

35 40 45

Leu Pro Phe His Gly Ala Asp Ile Trp Thr Leu Tyr Glu Leu Ser Trp

50 55 60

Leu Asn Asn Arg Gly Val Pro Gln Val Ala Val Gly Glu Met His Leu

65 70 75 80

Asn Ala Glu Ser Leu Asn Leu Ile Glu Ser Lys Ser Phe Lys Leu Tyr

85 90 95

Leu Asn Ser Phe Asn Gln Thr Thr Phe Asp Ser Trp Glu Ser Val Arg

100 105 110

Ala Thr Leu Ala Asn Asp Leu Ala His Cys Ala Gln Gly Asp Val Ser

115 120 125

Ile Thr Leu Phe Lys Leu Ser Glu Leu Glu Gly Gln Pro Leu Ala Gly

130 135 140

Phe Thr Gly Glu Cys Ile Asp Asp Gln Asp Ile Gln Ile Asp Ser Tyr

145 150 155 160

Asp Phe Asn Ala Asp Tyr Leu Ala Thr Asn Glu Gln Asp Ala Pro Val

165 170 175

Val Glu Glu Thr Leu Val Ser His Leu Leu Lys Ser Asn Cys Leu Ile

180 185 190

Thr His Gln Pro Asp Trp Gly Ser Val Gln Ile His Tyr Arg Gly Lys

195 200 205

Arg Ile Asn Arg Glu Ala Leu Leu Arg Tyr Ile Ile Ser Phe Arg His

210 215 220

His Asn Glu Phe His Glu Gln Cys Val Glu Arg Ile Phe Asn Asp Ile

225 230 235 240

Met Arg Tyr Tyr Gln Pro Glu Lys Leu Ser Val Tyr Ala Arg Tyr Thr

245 250 255

Arg Arg Gly Gly Leu Asp Ile Asn Pro Trp Arg Ser Asn Thr Ala Phe

260 265 270

Asn Ala Pro Asn Gly Arg Leu Pro Arg Gln

275 280

<210> 3

<211> 165

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Thr Thr Arg Lys Glu Ser Glu Leu Glu Gly Val Thr Leu Leu Gly

1 5 10 15

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20 25 30

Ser Phe Pro Asn Lys His Val Asn Arg Asp Tyr Phe Val Lys Phe Asn

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Cys Pro Glu Phe Thr Ser Leu Cys Pro Lys Thr Gly Gln Pro Asp Phe

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Asp Pro Arg Tyr Ile Glu Val Trp Gly Lys Phe Thr Pro Arg Gly Gly

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Glu Lys Met Ala Glu Tyr Arg Met Met Asn His Asp Leu Tyr Pro Glu

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<210> 4

<211> 300

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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1 5 10 15

Val Glu Leu Glu Ile Asp Gly Arg Ser Arg Ile Phe Asp Ile Asp Asp

20 25 30

Pro Asp Leu Pro Lys Trp Ile Asp Glu Glu Ala Phe Arg Ser Asp Asp

35 40 45

Tyr Pro Tyr Lys Lys Lys Leu Asp Arg Glu Glu Tyr Glu Glu Thr Leu

50 55 60

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65 70 75 80

Thr Gly Lys Arg Val Met Ala Val Phe Glu Gly Arg Asp Ala Ala Gly

85 90 95

Lys Gly Gly Ala Ile His Ala Thr Thr Ala Asn Met Asn Pro Arg Ser

100 105 110

Ala Arg Val Val Ala Leu Thr Lys Pro Thr Glu Thr Glu Arg Gly Gln

115 120 125

Trp Tyr Phe Gln Arg Tyr Val Ala Thr Phe Pro Thr Ala Gly Glu Phe

130 135 140

Val Leu Phe Asp Arg Ser Trp Tyr Asn Arg Ala Gly Val Glu Pro Val

145 150 155 160

Met Gly Phe Cys Thr Pro Asp Gln Tyr Glu Gln Phe Leu Lys Glu Ala

165 170 175

Pro Arg Phe Glu Glu Met Ile Ala Asn Glu Gly Ile His Leu Phe Lys

180 185 190

Phe Trp Ile Asn Ile Gly Arg Glu Met Gln Leu Lys Arg Phe His Asp

195 200 205

Arg Arg His Asp Pro Leu Lys Ile Trp Lys Leu Ser Pro Met Asp Ile

210 215 220

Ala Ala Leu Ser Lys Trp Asp Asp Tyr Thr Gly Lys Arg Asp Arg Met

225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

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Glu Lys Ile Leu Gly Ser Gly Pro Gly Phe Leu Arg

290 295 300

<210> 5

<211> 336

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Leu Pro Lys Leu Val Ile Thr His Arg Val His Asp Glu Ile Leu

1 5 10 15

Gln Leu Leu Ala Pro His Cys Glu Leu Met Thr Asn Gln Thr Asp Ser

20 25 30

Thr Leu Thr Arg Glu Glu Ile Leu Arg Arg Cys Arg Asp Ala Gln Ala

35 40 45

Met Met Ala Phe Met Pro Asp Arg Val Asp Ala Asp Phe Leu Gln Ala

50 55 60

Cys Pro Glu Leu Arg Val Ile Gly Cys Ala Leu Lys Gly Phe Asp Asn

65 70 75 80

Phe Asp Val Asp Ala Cys Thr Ala Arg Gly Val Trp Leu Thr Phe Val

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Pro Asp Leu Leu Thr Val Pro Thr Ala Glu Leu Ala Ile Gly Leu Ala

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Val Gly Leu Gly Arg His Leu Arg Ala Ala Asp Ala Phe Val Arg Ser

115 120 125

Gly Lys Phe Arg Gly Trp Gln Pro Arg Phe Tyr Gly Thr Gly Leu Asp

130 135 140

Asn Ala Thr Val Gly Phe Leu Gly Met Gly Ala Ile Gly Leu Ala Met

145 150 155 160

Ala Asp Arg Leu Gln Gly Trp Gly Ala Thr Leu Gln Tyr His Glu Arg

165 170 175

Lys Ala Leu Asp Thr Gln Thr Glu Gln Arg Leu Gly Leu Arg Gln Val

180 185 190

Ala Cys Ser Glu Leu Phe Ala Ser Ser Asp Phe Ile Leu Leu Ala Leu

195 200 205

Pro Leu Asn Ala Asp Thr Leu His Leu Val Asn Ala Glu Leu Leu Ala

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Leu Val Arg Pro Gly Ala Leu Leu Val Asn Pro Cys Arg Gly Ser Val

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Val Asp Glu Ala Ala Val Leu Ala Ala Leu Glu Arg Gly Gln Leu Gly

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<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ccactcggca ttcatcctga tagcctacct tttcatggcg cagatatctg gacgctctac 180

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aatgcggaaa gcctgaatct gattgaatca aaaagtttta agctgtacct gaacagcttt 300

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gccggcgagt tcgtcctttt cgaccgctcc tggtacaacc gcgccggtgt cgaaccggtc 480

atgggctttt gcacccccga ccagtacgag caattcctta aagaggcgcc ccgcttcgag 540

gagatgatcg cgaacgaggg catccatctc ttcaagtttt ggatcaatat cggccgggaa 600

atgcaactga agcgcttcca tgaccggcgc cacgatccgt tgaagatctg gaagctttcg 660

ccgatggaca tcgcggcgct gagcaagtgg gacgactaca ccggaaaacg cgaccgtatg 720

ctgaaggaaa cgcacacgga gcacgggcca tgggcggtca tccgcggcaa cgacaagcgc 780

cgctcgcgga tcaacgtgat ccgccacatg ctgacgaagc tcgactatga cggcaaggac 840

gaggcggcga tcggagaggt cgacgaaaag atcctcggct ccggccccgg ttttctcagg 900

tga 903

<210> 10

<211> 1011

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgttaccga aattagttat cacgcacaga gtgcacgacg aaatccttca attgctggcc 60

cctcattgtg agttgatgac caaccaaacc gattctaccc tgacgagaga agagatactg 120

cgccgttgca gagacgcaca agccatgatg gcgtttatgc cggaccgtgt agatgcagac 180

tttcttcaag cttgcccgga acttcgggtc attggttgtg ctttgaaagg gttcgacaac 240

tttgacgtgg atgcgtgtac tgcacgcggg gtatggctta cttttgtacc tgacttattg 300

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