穗花杉双黄酮在制备促进伤口愈合药物中的应用
阅读说明：本技术 穗花杉双黄酮在制备促进伤口愈合药物中的应用 (Application of amentoflavone in preparation of medicine for promoting wound healing ) 是由 曹征宇 张凡 张壮 陈颐宸 张嫔慧 于 2021-11-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了穗花杉双黄酮在制备促进伤口愈合药物中的应用,穗花杉双黄酮是黄酮类小分子化合物,本发明是基于新型促进伤口愈合靶点GPR39开发一个全新激动剂。实验证明,通过激动GPR39靶点,穗花杉双黄酮具有显著的促进伤口愈合活性,可用于促进伤口愈合药物的研发。(The invention discloses application of amentoflavone in preparation of a medicine for promoting wound healing, wherein the amentoflavone is a flavonoid micromolecule compound, and a brand-new agonist is developed on the basis of a novel target spot for promoting wound healing GPR 39. Experiments prove that by exciting GPR39 target, amentoflavone has remarkable activity of promoting wound healing and can be used for research and development of medicaments for promoting wound healing.)
技术领域
本发明涉及中药天然化合物的新用途，特别涉及穗花杉双黄酮在促进伤口愈合药物中的作用。
背景技术
皮肤伤口是一种常见的临床症状，常规的皮肤创伤治疗包括植皮和人工替代物覆盖，然而，由于供体皮肤来源有限、存在免疫排斥或感染性疾病的危险以及人工皮肤的高成本，传统方法难以满足临床伤口治疗的需要。尽管一些生长因子在促进伤口愈合方面表现出较强的效果，但由于多种生长因子参与伤口愈合的复杂相容性和致癌的可能性，其安全性问题一直是人们关注的焦点。
G蛋白偶联受体GPR39在皮肤系统中主要表达于皮肤角质形成细胞，可被细胞间的锌离子激活，是皮肤中锌离子相关生理功能的主要调节受体，参与调控角质形成细胞的增殖。近期研究发现，GPR39基因敲除导致了小鼠伤口难以愈合，激动GRR39受体则可以促进伤口愈合，GPR39已被证明是一个新型且具有重要价值的调控伤口愈合的药物作用靶点。
然而，具有显著促进伤口愈合活性的GPR39激动剂的发现，到目前仍然缺乏。
发明内容
发明目的：本发明公开了穗花杉双黄酮作为GPR39激动剂在制备促进伤口愈合药物中的应用。
技术方案：如通式(I)所示的穗花杉双黄酮及其药学上可接受的盐、同位素标记物在制备促进伤口愈合药物中的应用，
进一步地，所述促进伤口愈合药物为GPR39激动剂。
进一步地，所述促进伤口愈合药物剂型包括内用和外用的剂型。
含有穗花杉双黄酮的药物组合物在制备促进伤口愈合药物中的应用。
本发明采用高通量实时荧光检测系统在中药天然产物化合物库中发现了GPR39激动剂穗花杉双黄酮。GPR39在皮肤系统中主要表达于角质形成细胞，调控角质形成细胞的增殖与迁移。采用人永生化角质形成细胞系(Human ImmortalizedKeratinocytes，HaCaT)作为体外模型，利用MTT实验和BrdU掺入实验验证穗花杉双黄酮对细胞增殖的作用，并通过转染小干扰RNA(siRNA)敲减GPR39的表达，考察这些作用是否依赖GPR39，表明穗花杉双黄酮能剂量依赖性地增加HaCaT细胞活力，促进角质形成细胞增殖，且该作用依赖于GPR39。采用5mm-直径活检打孔器(Kai Industries，Tokyo，Iapan)建立全层皮肤切除伤口小鼠动物模型，使用游标卡尺(Mitir)测量伤口X，Y，Z轴的直径后，并在各个时间点评估伤口面积，计算小鼠伤口愈合率，评价穗花杉双黄酮促进伤口愈合的活性，表明该化合物在3μM的剂量下具有强于重组人表皮生长因子(Recombinant Human EpidermalGrowth Factor，rhEGF，2000IU/mL)促进伤口愈合的活性。
有益效果：本发明是基于新型促进伤口愈合靶点GPR39开发的一个全新激动剂，该激动剂具有显著的促进伤口愈合活性，可作为先导化合物，用于促进伤口愈合药物的研发。
附图说明
图1为穗花杉双黄酮(Amentoflavone，AF)的化学结构式；
图2为穗花杉双黄酮浓度依赖性激动hGPR39，其中A图为不同浓度Amentofiavone引起GPR39介导的细胞[Ca2+]i增加，B图为Amentoflavone引起GPR39介导的细胞[Ca2+]i增加的EC50测定；
图3为穗花杉双黄酮通过GPR39促进HaCaT细胞增殖；
图4为小鼠皮肤伤口组织HE染色图。
具体实施方式
实施例1
穗花杉双黄酮的结构式如图1，分子式为C30H18O10，是一个来源于卷柏科植物卷柏Selaginella tamariscina(Beauv.)Spring的黄酮类小分子天然产物化合物。采用高通量实时荧光检测系统评价穗花杉双黄酮对异源表达的hGPR39受体的活性，结果显示，穗花杉双黄酮对GPR39具有较强激动活性，ECs0为154nM，如图2。
采用MTT实验和BrdU掺入实验验证穗花杉双黄酮对角质形成细胞增殖的作用，并通过转染SiRNA敲减GPR39的表达，考察这些作用是否依赖GPR39，结果如图3，穗花杉双黄酮通过GPR39促进HaCaT细胞增殖(A：以溶剂对照组为1，各组数值为溶剂对照组的倍数)，**，P＜0.01，相对于溶剂对照组或溶剂对照+扰乱小干扰RNA组；##，P＜0.01，相对于穗花杉双黄酮+扰乱小干扰RNA组
采用MTT实验，考察不同浓度AF刺激HaCaT细胞36小时对细胞活力的影响，结果表明AF能够剂量依赖性地增加HaCaT细胞活力(图3A)；采用BrdU掺入实验，经过AF(3μM)处理后，BrdU阳性细胞比例显著上升，与溶剂对照组相比，差异显著(图3B和C)，表明AF能够显著促进角质形成细胞增殖。采用特异性SiRNA干扰GPR39的表达后AF对角质形成细胞增殖的促进作用减弱，与Scramble-SiRNA相比差异极显著(图3D和E)，表明AF对HaCaT细胞增殖的促进作用依赖于GPR39。
采用5mm-直径活检打孔器建立全层皮肤切除伤口小鼠动物模型。在小鼠背部制造5mm直径的圆形全层皮肤切除伤口，运用游标卡尺测量伤口X，Y，Z轴直径，随后在在小鼠伤口处涂抹给药，模型组小鼠给予50μL无菌生理盐水，穗花杉双黄酮组：AF(3μM)和AF(10μM)组给予由无菌生理盐水配置的穗花杉黄酮50μL；阳性药组给予重组人表皮生长因子(2000IU/mL)50μL；每天给药，实验结果如表1。
表1.穗花杉双黄酮对小鼠伤口愈合率的影响(％)
*，P＜0.05；**，P＜0.01，相对于模型组
采用5mm-直径活检打孔器建立全层皮肤切除伤口小鼠动物模型，并在各个时间点评估伤口面积，计算小鼠伤口愈合率，评价穗花杉双黄酮促进伤口愈合的活性，与模型组相比，穗花杉双黄酮具有显著促进伤口愈合的作用，其活性强于重组人表皮生长因子(2000IU/mL)。
于造模后第8天处死小鼠，取伤口及边缘组织，用4％中性多聚甲醛固定48h，石蜡包埋，制成5μm的石蜡切片后进行HE染色，在显微镜下观察组织病理变化，实验结果如图4(S：Scab-痂；KC：Keratinocytes-角质形成细胞；Cf：Collagen fibers-胶原纤维；FB：Fibroblasts-成纤维细胞)和表2。
表2.穗花杉双黄酮对小鼠创面表皮厚度的影响(μm)
*，P＜0.05；**，P＜0.01，相对于模型组，##，P＜0.01，相对于正常组
对造模后第8天的小鼠皮肤伤口进行组织病理学观察，可见模型组小鼠皮肤组织排列松散，未见新生的角质形成细胞层，整体皮肤结构紊乱，有炎性细胞以及成纤维细胞向伤口处迁移，其中炎性细胞的数目相对较多。相比之下两组穗花杉双黄酮组和rhEGF组伤口处的角质形成细胞层已经生成，胶原纤维排列紧密且有序，伤口可见大量的成纤维细胞，相对较少的炎性细胞，其中穗花杉双黄酮组的成纤维细胞数目增多效果更为明显。与此同时，对小鼠皮肤的表皮厚度进行测量，各组小鼠皮肤在受到创伤后，表皮厚度相对于正常组小鼠均有显著增厚，而穗花杉双黄酮组与rhEGF组表皮厚度显著高于模型组，表明穗花杉双黄酮与rhEGF均能促进表皮新生，而穗花杉双黄酮组表现出更为突出的促进伤口愈合活性。
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