化合物或其可药用盐、二聚体或三聚体在制备治疗癌症的药物中的应用
阅读说明：本技术 化合物或其可药用盐、二聚体或三聚体在制备治疗癌症的药物中的应用 (Application of compound or pharmaceutically acceptable salt, dimer or trimer thereof in preparation of medicine for treating cancer ) 是由 王晓芳 齐海龙 于 2020-07-06 设计创作，主要内容包括：本发明涉及医药技术领域,尤其涉及式I化合物或其可药用盐、二聚体或三聚体在制备治疗癌症的药物中的应用。通过对多种肿瘤细胞进行抑制效果的验症,结果表明,式I化合物对于肿瘤细胞存在一定的抑制效果,IC50值可达40.77μM～182.5μM。动物实验中式I化合物表现出了良好的抑制肿瘤体积的作用,与溶剂对照组存在极显著的差异,p＜0.05。(The invention relates to the technical field of medicines, in particular to application of a compound shown in a formula I or a pharmaceutically acceptable salt, dimer or trimer thereof in preparing a medicine for treating cancer. The results of tests on the inhibition effect of various tumor cells show that the compound of the formula I has certain inhibition effect on the tumor cells, and the IC50 value can reach 40.77 mu M-182.5 mu M. The compound of formula I shows good effect of inhibiting tumor volume in animal experiments, and has very obvious difference with a solvent control group, wherein p is less than 0.05.)
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及化合物或其可药用盐、二聚体或三聚体在制备治疗癌症的药物中的应用。
背景技术
1.癌症流行病学
非传染性疾病是全球死亡的主要诱因，而癌症则是非传染性疾病中致死率最高的疾病，给社会健康医疗体系带来沉重负担。传统的癌症治疗以手术以及放化疗为主，对于进展期癌症则以化疗为主。经典的化疗因靶向性差而副作用大。以格列卫为代表的靶向化疗药物的出现极大的降低了化疗给患者带来的痛苦。靶向药针对癌症细胞不同于正常细胞生长特点和表达的分子而设计，如格列卫特异性针对慢性髓性白血病中组成型激活的酪氨酸激酶从而起到很好的治疗效果(Flynn and Gerriets，2020)。癌症细胞不同于正常细胞的另一显著特点为代谢方式的改变。为了平衡快速增殖对细胞组分的需求以及维持生存所需的能量供应，癌症细胞偏好于采用有氧糖酵解的方式利用葡萄糖，这叫做Warburg效应(Warburg，1956)。有氧糖酵解并不能充分的氧化葡萄糖产生ATP，但却可以产生大量的中间代谢产物用于DNA和蛋白质的合成从而促进癌症细胞增殖。因而靶向肿瘤细胞的糖代谢，从而达到抑制癌症细胞增殖的目的是可行的(Kroemer and Pouyssegur，2008)。
2.索格列净与癌症治疗
癌症细胞从外界环境吸收葡萄糖主要通过葡萄糖转运蛋白完成，葡萄糖转运蛋白分为两大家族，一类是通过协助扩散的方式顺葡萄糖浓度梯度进行转运的GLUT家族，另一类则是通过协同转运钠离子而进行葡萄糖吸收的钠离子葡萄糖转运蛋白SGLT家族，该家族蛋白以消耗ATP的方式主动转运外界的葡萄糖供给细胞使用(Navale and Paranjape，2016)。SGLT家族最主要的两个成员是SGLT1和SGLT2，SGLT2主要分布在肾脏近曲小管的前端，通过主动运输将原尿中97％以上的葡萄糖重吸收入血，而SGLT1则主要分布在小肠绒膜的上皮细胞以及肾脏近曲小管的远端，通过主动运输吸收肠道内食物中的葡萄糖以及原尿中经SGLT2吸收后剩余的3％左右的葡萄糖(Dominguez Rieg and Rieg，2019)。由于SGLT1以及SGLT2在糖吸收以及重吸收中的重要作用因而成为糖尿病治疗的理想靶点。目前靶向SGLT2的恩格列净，卡格列净，达格列净在临床上用于治疗二型糖尿病显示出了很好的治疗效果，同时还具有降低心血管病的疗效。单独靶向SGLT1的米格列净已经进入临床研究阶段。同时靶向SGLT1和SGLT2的索格列净则在欧盟获批上市。
目前尚未见有关于索格列净在治疗癌症方面的用途的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供索格列净在制备治疗癌症的药物中的应用。
本发明提供了式I化合物或其可药用盐、二聚体或三聚体在制备治疗癌症的药物中的应用。
其中：R1是氢或任选取代的C1-10-烷基、C1-5-环烷基或5元杂环，所述任选的取代是用一个或多个R1A取代；
每个R1A独立地是氨基、酯、酰胺、硫醇、羧酸、氰基、卤素、羟基或任选取代的C1-4-烷氧基、C1-5-环烷基或5元杂环，所述任选的取代是用一个或多个R1B取代；每个R1B独立地是C1-4-烷基、卤素或羟基；n是0、1或2；
每个R2独立地是F或OR2A，其中每个R2A独立地是氢、C1-4-烷基或酰基；
每个R3独立地是卤素、羟基或任选取代的C1-10-烷基或C1-10-烷氧基，所述任选的取代是用一个或多个R3A取代；
每个R3A独立地是氨基、酯、酰胺、硫醇、羧酸、氰基、卤素、羟基或任选取代的C1-4-烷氧基、C1-5-环烷基或5元杂环，所述任选的取代是用一个或多个R3B取代；每个R3B独立地是C1-4-烷基、氨基、氰基、卤素或羟基；p是 0、1或2；
每个R4独立地是R4A、-N(R4A)(R4B)、-OR4A、-SR4A、-S(O)R4A或- S(O)2R4A；
R4A是任选取代的C4-20-烷基或4-20元杂烷基，所述任选的取代是用一个或多个R4C取代，并且被任选地附连到另一个R4A组成部分，以提供二聚体或三聚体；R4B是氢或R4A；每个R4C独立地是氨基、氨酰基、偶氮、羰基、羧基、氰基、甲酰基、胍基、卤素、羟基、亚氨酰基、亚氨基、异硫氰酸酯、腈、硝基、亚硝基、硝酰基、氧基、硫烷基、亚磺酰基、磺酰基、硫醛、硫氰酸酯、硫酮、硫脲、脲或X1、X1-L1-X2或X1-L1-X2-L2-X3，其中每个X1、 X2和X3独立地是任选取代的C1-4-烷基、C1-6-环烷基、5-或6元杂环或芳基，所述任选的取代是用一个或多个R4D取代，并且每个L1和L2独立地是任选取代的C1-6-烷基或1-10元杂烷基，所述任选的取代是用一个或多个R4E取代；每个R4D独立地是R4E或任选用一个或多个R4E取代的C1-6-烷基；每个R4E独立地是氨基、氨酰基、偶氮、羰基、羧基、氰基、甲酰基、胍基、卤素、羟基、亚氨酰基、亚氨基、异硫氰酸酯、腈、硝基、亚硝基、硝酰基、氧代、硫烷基、亚磺酰基、磺酰基、硫醛、硫氰酸酯、硫酮或脲；并且m是1、2或 3。
本发明中，所述式I化合物或其可药用盐、二聚体或三聚体治疗的癌症包括：膀胱癌、血癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、中枢神经系统癌症、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胆囊癌、胃肠道癌、外生殖器癌、泌尿生殖道癌、头癌、肾癌、喉癌、肝癌、肌肉组织癌症、颈癌、口腔或鼻黏膜癌、卵巢癌、前列腺癌、皮肤癌、脾癌、小肠癌、大肠癌、胃癌、睾丸癌和/或甲状腺癌。
本发明中，R1是甲基，n＝0；R2皆为-OH；p＝1，R3为Cl；m＝1，R4为乙氧基。
一些实施例中，所述式I化合物为索格列净，其结构如式II。
本发明中，所述治疗包括抑制肿瘤细胞增殖和/或抑制肿瘤体积。一些实施例中，采用肺癌细胞A549、肝癌细胞HepG2、前列腺癌DU145细胞、乳腺癌MCF-7细胞、食管癌KYSE30细胞、胃癌HGC-27细胞、胆管癌RBE 细胞、卵巢癌SKOV3细胞、宫颈癌HeLa细胞对索格列净的肿瘤细胞抑制效果进行验证，细胞实验表明，索格列净对于肿瘤细胞存在一定的抑制效果，IC50值依次为71.57μM、115.7μM、、40.77μM、64.84μM、82.27μM、48.54μM、 182.5μM、84.49μM、82.11μM。在动物体实验中，索格列净表现出了良好的抑制肿瘤体积的作用，与溶剂对照组存在极显著的差异，p＜0.05。
本发明还提供了式I化合物或其可药用盐、二聚体或三聚体在制备逆转抗肿瘤药物的耐药性的制剂中的应用。一些具体实施例中，本发明提供了索格列净在制备逆转抗肿瘤药物的耐药性的制剂中的应用。
本发明还提供了逆转抗肿瘤药物耐药性的方法，其为给予式I化合物或其可药用盐、二聚体或三聚体。一些具体实施例中，本发明还提供了逆转抗肿瘤药物耐药性的方法，其为给予索格列净。
本发明中，式I化合物或其可药用盐、二聚体或三聚体能够用于逆转抗肿瘤药物的耐药性，所述抗肿瘤药物为酪氨酸激酶活性抑制剂。
本发明中，所述酪氨酸激酶活性抑制剂包括：EGFR抑制剂、c-Kit、c-Met、 c-Ret、RafPDGFR、BTK、PKA/C、FGFR抑制剂、VEGFR抑制剂。
一些实施例中，所述EGFR抑制剂包括：吉非替尼，厄洛替尼、阿法替尼、二甲苯磺酸拉帕替尼、染料木素、拉帕替尼、沙普替尼、瑞香素、达克替尼、瓦利替尼、埃克替尼、盐酸利多卡因、奥斯替尼甲磺酸盐、奥斯替尼、波齐替尼、那扎替尼、AZD3759、奥莫替尼、艾维替尼、来那替尼、拉泽替尼；
所述c-Met抑制剂包括：卡博替尼；
所述PKA/C抑制剂包括：瑞香素；
所述BTK抑制剂包括：奥莫替尼；
所述c-Ret抑制剂包括：瑞戈非尼水合物、瑞戈非尼；
所述Raf抑制剂包括：瑞戈非尼水合物；
所述FGFR抑制剂包括：4-[(1E)-2-[5-[(1R)-1-(3，5-二氯-4-吡啶基)乙氧基]-1H-吲唑-3-基]乙烯基]-1H-吡唑-1-乙醇；尼达尼布、尼达尼布乙磺酸盐、帕纳替尼、布立尼布、丙氨酸布立尼布；
所述c-Kit抑制剂包括：阿昔替尼、帕唑帕尼、盐酸帕唑帕尼、瑞戈非尼水合物、苹果酸舒尼替尼、舒尼替尼、西特拉瓦替尼、替拉替尼；
所述PDGFR抑制剂包括：阿昔替尼、替沃扎尼、替拉替尼、尼达尼布、尼达尼布乙磺酸盐、帕唑帕尼、盐酸帕唑帕尼、帕纳替尼；
所述VEGFR抑制剂包括：阿帕替尼、阿昔替尼、尼达尼布、西地尼布、盐酸帕唑帕尼、苹果酸舒尼替尼、布立尼布、卡博替尼、丙氨酸布立尼布、乐伐替尼、瑞戈非尼、ENMD-2076、ENMD-2076酒石酸盐、替沃扎尼、帕纳替尼、呋喹替尼、替拉替尼、花旗松素、帕唑帕尼、苹果酸卡博替尼、维生素E、瑞戈非尼水合物、尼达尼布乙磺酸盐、乐伐替尼甲磺酸盐、西地尼布马来酸盐、4-[(1E)-2-[5-[(1R)-1-(3，5-二氯-4-吡啶基)乙氧基]-1H-吲唑-3-基]乙烯基]-1H-吡唑-1-乙醇、舒尼替尼、西特拉瓦替尼、安罗替尼、索拉非尼、凡德他尼以及贝伐单抗等靶向VEGFR的单抗类药物。
本发明中，用于验证索格列净逆转抗肿瘤药物的耐药性的的抗肿瘤药物包括：多靶点激酶抑制剂、替沃扎尼、染料木素、帕纳替尼、瑞香素、达克替尼、瓦利替尼、埃克替尼、奥斯替尼甲磺酸盐、奥斯替尼、那扎替尼、 AZD3759、安罗替尼、艾维替尼或拉泽替尼、盐酸利多卡因、 4-[(1E)-2-[5-[(1R)-1-(3，5-二氯-4-吡啶基)乙氧基]-1H-吲唑-3-基]乙烯基]-1H-吡唑-1-乙醇、阿西替尼、尼达尼布、西地尼布、盐酸帕唑帕尼、苹果酸舒尼替尼、布立尼布、卡博替尼、丙氨酸布立尼布、乐伐替尼、瑞戈非尼、ENMD-2076 酒石酸盐、替拉替尼、帕唑帕尼、苹果酸卡博替尼、瑞格非尼水合物、尼达尼布乙磺酸盐、乐伐替尼甲磺酸盐、西地尼布马来酸盐、呋喹替尼、舒你替尼、奥莫替尼、西特拉瓦替尼、凡德他尼、吉非替尼、阿法替尼、阿帕替尼、厄洛替尼或索拉非尼、花旗松素或维生素E中至少一种。
本发明实施例中，首先构建吉非替尼60μM耐药细胞株，然后用本发明获得的吉非替尼耐药细胞株加入30μM吉非替尼以及索格列净组合物仍然可以有效杀伤该细胞株。说明索格列净与吉非替尼联用逆转肿瘤细胞对吉非替尼的耐药性。
本发明还提供了一种治疗癌症的药物，包括式I化合物或其可药用盐、二聚体或三聚体和药学上可接受的辅料。
本发明所述的药物中，还包括其他具有抗肿瘤作用的药物，例如，酪氨酸激酶活性抑制剂。
所述药物的给药方式为口服给药，其剂型包括颗粒剂、丸剂、散剂、片剂、胶囊剂、口服液或糖浆剂。
在本发明提供的一些实施例中，胶囊剂为硬胶囊剂或软胶囊剂。
在本发明提供的一些实施例中，片剂为口服片剂或口腔片剂。
片剂指供口服的片剂，多数此类片剂中的药物是经胃肠道吸收而发挥作用，也有的片剂中的药物是在胃肠道局部发挥作用。在本发明提供的一些实施例中，片剂为普通压制片、分散片、泡腾片、咀嚼片、包衣片或缓控释片。
在所述的药物中还包括药学上可接受的辅料，包括水果粉、食用香精、甜味剂、酸味剂、填充剂、润滑剂、防腐剂、助悬剂、食用色素、稀释剂、乳化剂、崩解剂或增塑剂中的一种或两者以上的混合物。
本发明还提供了一种治疗癌症的方法，其为给予本发明所述的药物。
本发明提供了式I化合物或其可药用盐、二聚体或三聚体在制备治疗癌症的药物中的应用，通过对多种肿瘤细胞进行抑制效果的炎症，结果表明，式I 化合物对于肿瘤细胞存在一定的抑制效果，IC50值可达40.77μM～182.5μM。采用肝癌细胞和肺癌细胞制备荷瘤小鼠模型，动物实验中式I化合物表现出了良好的抑制肿瘤体积的作用，与溶剂对照组存在极显著的差异，p＜0.05。
附图说明
：图1-a示索格列净对前列腺癌DU145细胞的杀伤效果；图1-b示索格列净对乳腺癌MCF-7细胞的杀伤效果；图1-c示索格列净对食管癌KYSE30细胞的杀伤效果；图1-d示索格列净对胃癌HGC-27细胞的杀伤效果；图1-e示索格列净对胆管癌RBE细胞的杀伤效果；图1-f示索格列净对卵巢癌SKOV3 细胞的杀伤效果；图1-g示索格列净对宫颈癌HeLa细胞的杀伤效果；
图2-a-1示不同浓度吉非替尼对肺癌细胞系A549的抑制效果；图2-a-2 示不同浓度索格列净对肺癌细胞系A549的抑制效果；图2-a-3示不同浓度吉非替尼+10uM索格列净联合用药受试组1对肺癌细胞系A549的抑制效果；图2-a-4示不同浓度吉非替尼+20uM索格列净联合用药受试组2对肺癌细胞系A549的抑制效果；图2-a-5示不同浓度吉非替尼+30uM索格列净联合用药受试组3对肺癌细胞系A549的抑制效果；
图2-b示吉非替尼单药以及索格列净联合吉非替尼组合物对结直肠癌细胞系LoVo的生长抑制率；
图2-c示吉非替尼单药以及索格列净联合吉非替尼组合物对结直肠癌细胞系HT29的生长抑制率；
图2-d示吉非替尼单药以及索格列净联合吉非替尼组合物对结直肠癌细胞系SW620的生长抑制率；
图2-e示吉非替尼单药以及索格列净联合吉非替尼组合物对结直肠癌细胞系HCT116的生长抑制率；
图2-f-1示不同浓度吉非替尼单药对卵巢癌细胞系SKOV3的生长抑制率；图2-f-2示不同浓度索格列净对卵巢癌细胞系SKOV3的抑制效果；图2-f-3示 10μmol/L索格列净与不同浓度吉非替尼对卵巢癌细胞系SKOV3的生长抑制率；图2-f-4示20μmol/L索格列净与不同浓度吉非替尼对卵巢癌细胞系SKOV3 的生长抑制率；图2-f-5示30μmol/L索格列净与不同浓度吉非替尼对卵巢癌细胞系SKOV3的生长抑制率；图2-f-6示40μmol/L索格列净与不同浓度吉非替尼对卵巢癌细胞系SKOV3的生长抑制率；
图2-g-1示不同浓度吉非替尼单药对食管癌细胞系KYSE30的生长抑制率；图2-g-2示不同浓度索格列净对食管癌细胞系KYSE30的抑制效果图；图 2-g-3示10μmol/L索格列净与不同浓度吉非替尼对食管癌细胞系KYSE30的生长抑制率；图2-g-4示20μmol/L索格列净与不同浓度吉非替尼对食管癌细胞系KYSE30的生长抑制率；图2-g-5示30μmol/L索格列净与不同浓度吉非替尼对食管癌细胞系KYSE30的生长抑制率；图2-g-6示40μmol/L索格列净与不同浓度吉非替尼对食管癌细胞系KYSE30的生长抑制率；
图2-h-1示不同浓度吉非替尼单药对胃癌细胞系HGC-27的生长抑制率；图2-h-2示不同浓度索格列净对胃癌细胞系HGC-27的抑制效果；图2-h-3示 10μmol/L索格列净与不同浓度吉非替尼对胃癌细胞系HGC-27的生长抑制率；图2-h-4示20μmol/L索格列净与不同浓度吉非替尼对胃癌细胞系HGC-27的生长抑制率；图2-h-5示30μmol/L索格列净与不同浓度吉非替尼对胃癌细胞系HGC-27的生长抑制率；图2-h-6示40μmol/L索格列净与不同浓度吉非替尼对胃癌细胞系HGC-27的生长抑制率；
图2-i-1示不同浓度吉非替尼单药对宫颈癌细胞系HeLa的生长抑制率；图2-i-2示不同浓度索格列净对宫颈癌细胞系HeLa的抑制效果图；图2-i-3示 10μmol/L索格列净与不同浓度吉非替尼对宫颈癌细胞系HeLa的生长抑制率；图2-i-4示20μmol/L索格列净与不同浓度吉非替尼对宫颈癌细胞系HeLa的生长抑制率；图2-i-5示30μmol/L索格列净与不同浓度吉非替尼对宫颈癌细胞系HeLa的生长抑制率；图2-i-6示40μmol/L索格列净与不同浓度吉非替尼对宫颈癌细胞系HeLa的生长抑制率；
图2-j-1示不同浓度吉非替尼单药对胆管癌细胞系RBE的生长抑制率；图 2-j-2示不同浓度索格列净对胆管癌细胞系RBE的抑制效果图图2-j-3示 10μmol/L索格列净与不同浓度吉非替尼对胆管癌细胞系RBE的生长抑制率；图2-j-4示20μmol/L索格列净与不同浓度吉非替尼对胆管癌细胞系RBE的生长抑制率；图2-j-5示30μmol/L索格列净与不同浓度吉非替尼对胆管癌细胞系RBE的生长抑制率；图2-j-6示40μmol/L索格列净与不同浓度吉非替尼对胆管癌细胞系RBE的生长抑制率；
图2-k-1示不同浓度阿法替尼对肺癌细胞系A549的抑制效果；图2-k-2 示不同浓度索格列净对肺癌细胞系A549的抑制效果；图2-k-3示不同浓度阿法替尼+10μM索格列净联合用药受试组1对肺癌细胞系A549的抑制效果；图2-k-4示不同浓度阿法替尼+20μM索格列净联合用药受试组2对肺癌细胞系 A549的抑制效果；图2-k-5示不同浓度阿法替尼+30μM索格列净联合用药受试组3对肺癌细胞系A549的抑制效果；图2-k-6示不同浓度阿法替尼+40μM 索格列净联合用药受试组4对肺癌细胞系A549的抑制效果；
图2-1-1示不同浓度厄洛替尼对肺癌细胞系A549的抑制效果；图2-1-2示不同浓度索格列净对肺癌细胞系A549的抑制效果；图2-1-3示不同浓度厄洛替尼+10μM索格列净联合用药受试组1对肺癌细胞系A549的抑制效果；图 2-1-4示不同浓度厄洛替尼+20μM索格列净联合用药受试组2对肺癌细胞系 A549的抑制效果；图2-1-5示不同浓度厄洛替尼+30μM索格列净联合用药受试组3对肺癌细胞系A549的抑制效果；图2-1-6示不同浓度厄洛替尼+40μM索格列净联合用药受试组4对肺癌细胞系A549的抑制效果；
图3示吉非替尼，索格列净以及二者组合物对经筛选获得的吉非替尼耐药细胞株A549的杀伤效果；
图4-a-1示阿帕替尼单药以及索格列净联合阿帕替尼组合物对肝癌细胞系HepG2的生长抑制率；
图4-a-2示阿帕替尼单药以及索格列净联合阿帕替尼组合物对结直肠癌细胞系LoVo的生长抑制率；
图4-a-3示阿帕替尼单药以及索格列净联合阿帕替尼组合物对结直肠癌细胞系HT29的生长抑制率；
图4-a-4示阿帕替尼单药以及索格列净联合阿帕替尼组合物对结直肠癌细胞系SW620的生长抑制率；
图4-a-5示阿帕替尼单药以及索格列净联合阿帕替尼组合物对结直肠癌细胞系SW480的生长抑制率；
图4-b-1示不同浓度阿帕替尼对细胞系HepG2的抑制效果；
图4-b-2示不同浓度索格列净对细胞系HepG2的抑制效果；
图4-b-3示不同浓度阿帕替尼+索格列净联合用药受试组1对细胞系 HepG2的抑制效果；
图4-b-4示不同浓度阿帕替尼+索格列净联合用药受试组2对细胞系 HepG2的抑制效果；
图4-b-5示不同浓度阿帕替尼+索格列净联合用药受试组3对细胞系 HepG2的抑制效果；
图4-b-6示不同浓度阿帕替尼+索格列净联合用药受试组4对细胞系 HepG2的抑制效果；
图4-c-1示不同浓度阿帕替尼单药对胆管癌细胞系RBE的生长抑制率；图4-c-2示不同浓度索格列净单药对胆管癌细胞系RBE的生长抑制率；图4-c-3 示10μmol/L索格列净与不同浓度阿帕替尼对细胞系胆管癌RBE的生长抑制率；图4-c-4示20μmol/L索格列净与不同浓度阿帕替尼对细胞系RBE的生长抑制率；图4-c-5示30μmol/L索格列净与不同浓度阿帕替尼对细胞系胆管癌 RBE的生长抑制率；图4-c-6示40μmol/L索格列净与不同浓度阿帕替尼对细胞系胆管癌RBE的生长抑制率；
图4-d-1示不同浓度阿帕替尼单药对食管癌细胞系KYSE30的生长抑制率；图4-d-2示不同浓度索格列净单药对食管癌细胞系KYSE30的生长抑制率；图4-d-3示10μmol/L索格列净与不同浓度阿帕替尼对食管癌细胞系KYSE30 的生长抑制率；图4-d-4示20μmol/L索格列净与不同浓度阿帕替尼对食管癌细胞系KYSE30的生长抑制率；图4-d-5示30μmol/L索格列净与不同浓度阿帕替尼对食管癌细胞系KYSE30的生长抑制率；图4-d-6示40μmol/L索格列净与不同浓度阿帕替尼对食管癌细胞系KYSE30的生长抑制率；
图4-e-1示不同浓度阿帕替尼单药对卵巢癌细胞系SKOV3的生长抑制率；图4-e-2示不同浓度索格列净单药对卵巢癌细胞系SKOV3的生长抑制率；图 4-e-3示10μmol/L索格列净与不同浓度阿帕替尼对卵巢癌细胞系SKOV3的生长抑制率；图4-e-4示20μmol/L索格列净与不同浓度阿帕替尼对卵巢癌细胞系SKOV3的生长抑制率；图4-e-5示30μmol/L索格列净与不同浓度阿帕替尼对卵巢癌细胞系SKOV3的生长抑制率；图4-e-6示40μmol/L索格列净与不同浓度阿帕替尼对卵巢癌细胞系SKOV3的生长抑制率；
图4-f-1示不同浓度阿帕替尼单药对胃癌细胞系HGC-27；图4-f-2示不同浓度索格列净单药对胃癌细胞系HGC-27的生长抑制率；图4-f-3示10μmol/L 索格列净与不同浓度阿帕替尼对胃癌细胞系HGC-27的生长抑制率；图4-f-4 示20μmol/L索格列净与不同浓度阿帕替尼对胃癌细胞系HGC-27的生长抑制率；图4-f-5示30μmol/L索格列净与不同浓度阿帕替尼对胃癌细胞系HGC-27 的生长抑制率；图4-f-6示40μmol/L索格列净与不同浓度阿帕替尼对胃癌细胞系HGC-27的生长抑制率；
图4-g-1示不同浓度阿帕替尼单药对宫颈癌细胞系HeLa；图4-g-2示不同浓度索格列净单药对宫颈癌细胞系HeLa的生长抑制率；图4-g-3示10μmol/L 索格列净与不同浓度阿帕替尼对宫颈癌细胞系HeLa的生长抑制率；图4-g-4 示20μmol/L索格列净与不同浓度阿帕替尼对宫颈癌细胞系HeLa的生长抑制率；图4-g-5示30μmol/L索格列净与不同浓度阿帕替尼对宫颈癌细胞系HeLa 的生长抑制率；图4-g-6示40μmol/L索格列净与不同浓度阿帕替尼对宫颈癌细胞系HeLa的生长抑制率；
图5示乐伐替尼单药以及索格列净联合乐伐替尼组合物对肝癌HepG2细胞，结直肠癌LoVo，HT29，DLD1，SW480，HCT116细胞生长的抑制作用；
图6-1～图6-43依次示索格列净与阿昔替尼(图6-1)、尼达尼布(图6-2)、西地尼布(图6-3)、盐酸帕唑帕尼(图6-4)、苹果酸舒尼替尼(图6-5)、布立尼布(图6-6)、卡博替尼(图6-7)、丙氨酸布立尼布(图6-8)、乐伐替尼 (图6-9)、瑞戈非尼(图6-10)、ENMD-2076(图6-11)、替沃扎尼(图6-12)、帕纳替尼(图6-13)、ENMD-2076酒石酸盐(图6-14)、替拉替尼(图6-15)、花旗松素(图6-16)、帕唑帕尼(图6-17)、苹果酸卡博替尼(图6-18)、维生素E(图6-19)、瑞格非尼水合物(图6-20)、尼达尼布乙磺酸盐(图6-21)、乐伐替尼甲磺酸盐(图6-22)、西地尼布马来酸盐(图6-23)、 4-[(1E)-2-[5-[(1R)-1-(3，5-二氯-4-吡啶基)乙氧基]-1H-吲唑-3-基]乙烯基]-1H-吡唑-1-乙醇(图6-24)、舒尼替尼(图6-25)、西特拉瓦替尼(图6-26)、安罗替尼(图6-27)、索拉非尼(图6-28)、凡德他尼(图6-29)、呋喹替尼(图 6-30)、奥莫替尼(图6-31)、奥斯替尼(图6-32)、染料木素(图6-33)、艾维替尼(图6-34)、达克替尼(图6-35)、奥斯替尼甲磺酸盐(图6-36)、瑞香素 (图6-37)、瓦利替尼(图6-38)、AZD3759(图6-39)、拉泽替尼(图6-40)、那扎替尼(图6-41)、盐酸利多卡因(图6-42)、埃克替尼(图6-43)联用的效果；
图7-a示索格列净单药，阿帕替尼单药以及索格列净联合阿帕替尼组合物给药过程中肺癌A549细胞造模的荷瘤小鼠肿瘤体积生长曲线图；
图7-b示索格列净单药，吉非替尼单药以及索格列净联合吉非替尼组合物给药结束后解剖各组肺癌A549细胞造模的荷瘤小鼠肿瘤大观图；
图7-c示索格列净单药，吉非替尼单药以及索格列净联合吉非替尼组合物给药结束后小鼠肿瘤重量图。
具体实施方式
本发明提供了索格列净在制备治疗癌症的药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
除非在本发明中另有特别说明，本发明中所涉及的所有技术用语和科学用语的含义意图与本领域人员所通常理解的一致。本发明中所提及使用的技术意图指在本领域中通常所理解的技术，包括那些对本领域技术人员显而易见的技术的变化或等效技术的替换。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更便好地解释本发明。
如本文中所使用的术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”及其在本文中的其它变体形式为包含性的或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤
因此，本发明涉及SGLT家族两个最主要的且在癌症细胞中高表达的成员SGLT1和SGLT2的双重抑制剂索格列净及其含有TKI组合物在制备治疗癌症药物中的用途。
如本文中所使用的术语“治疗”是指施用本发明的药物后患有疾病或疾病状况的实验动物表现出所述症状部分或全部缓解，或者在治疗后不再持续加重。因此，治疗包括治愈。
如本文所用，“疗效”表示由治疗所导致的效果，在细胞水平表现为细胞生长的抑制率或者细胞死亡率，在动物水平表现为其改变、通常减轻或改善疾病或疾病状况的症状，或者治愈疾病或疾病状况，本发明根据药物有效规定一律采取肿瘤生长抑制率大于60％同时治疗组与对照组的肿瘤体积或者重量的统计差异p值小于0.05。
如本文所用，“细胞生长抑制率”指经药物治疗后，治疗组细胞经MTT染色吸光率平均值值与对照组吸光率的平均值的比值，“肿瘤生长抑制率”则代表经药物治疗后治疗组肿瘤体积或者重量的平均值与对照组的体积或者重量的平均值的比值。
在一个实施方式中，所述索格列净用于治疗对象的癌症。
如本文中所使用的术语“癌症”是指由于遗传物质的改变而引起的上皮细胞的恶性增殖。所述癌症包括：膀胱癌、血癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、中枢神经系统癌症、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胆囊癌、胃肠道癌、外生殖器癌、泌尿生殖道癌、头癌、肾癌、喉癌、肝癌、肌肉组织癌症、颈癌、口腔或鼻黏膜癌、卵巢癌、前列腺癌、皮肤癌、脾癌、小肠癌、大肠癌、胃癌、睾丸癌和/或甲状腺癌。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
本申请实施例中，涉及的药物及其英文名称如表1：
表1药物及其英文名称
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1索格列净对肿瘤细胞的抑制作用
前列腺癌DU145细胞、乳腺癌MCF-7细胞、食管癌KYSE30细胞、胃癌HGC-27细胞、胆管癌RBE细胞、卵巢癌SKOV3细胞、宫颈癌Hela细胞对索格列净的肿瘤细胞抑制效果进行验证。方法为，待细胞生长到80％密度，胰蛋白酶消化细胞，传代并铺于96孔板中，每孔5000个细胞，24小时后更换为含有相应浓度的药物的培养基，48小时候利用MTT法检测各浓度下的吸光值。
实验分为：
对照组：不添加药物，仅适用正常培养基培养细胞；
索格列净受试组：在各细胞的培养基中添加索格列净对细胞进行处理，设置多个不同的浓度。
培养结束，利用各浓度的吸光值除以对照组吸光值算出细胞生长抑制率，并计算索格列净对各种肿瘤细胞的IC50值结果见图1-a～图1-g。图中以索格列净的浓度为横坐标，以细胞生长抑制率为纵坐标，结果显示，索格列净对各种肿瘤细胞皆存在一定的抑制作用。
实施例2索格列净与吉非替尼联用
1、索格列净安全浓度确定
从Selleck抑制剂公司购置索格列净进行体外癌症细胞生长抑制试验，首先利用正常人脐带上皮细胞测试索格列净在浓度高于80μM会产生很大的细胞毒性，低于80μM则主要体现为细胞生长抑制，故本实验后续组合物中使用的索格列净浓度均低于80μM，以防对正常细胞造成影响。
2、联合用药对肿瘤细胞的抑制作用
根据吉非替尼和索格列净药物靶点EGFR和SGLT1/2的组织分布特点，选择肺癌细胞系A549；结直肠癌细胞系LoVo，HT29，SW620，HCT116；宫颈癌HeLa；卵巢癌SKOV3；胃癌HGC27；胆管癌RBE；食管癌KYSE30等进行实验验证。方法为，待细胞生长到80％密度，胰蛋白酶消化细胞，传代并铺于96孔板中，每孔5000个细胞，24小时后更换为含有相应浓度的药物的培养基，48小时候利用MTT法检测各浓度下的吸光值。
实验分为：
对照组：不添加药物，仅使用正常培养基培养细胞；
吉非替尼受试组：仅在培养基中添加吉非替尼对细胞进行处理，设置4 个不同的浓度处理，分别为5μM、10μM、20μM、30μM。
吉非替尼+索格列净联合用药受试组：在培养基中添加索格列净(20μM) 和吉非替尼对细胞进行处理，设置4个不同的浓度处理，其中吉非替尼的分别为5μM、10μM、20μM、30μM。
培养结束，利用各浓度的吸光值除以对照组吸光值算出细胞生长抑制率，结果见图2-a～图2-e。图中以吉非替尼的浓度为横坐标，以细胞生长抑制率为纵坐标，结果显示，单独使用吉非替尼对肿瘤细胞的抑制效果有限，而两药联用有利于提高对肿瘤的抑制效果。
3、联合用药IC50值测定
以肺癌细胞系A549为例，验证吉非替尼+索格列净联合用药的IC50值，实验分为：
吉非替尼受试组(图2-a-1)：仅在培养基中添加吉非替尼对细胞进行处理，孵育1h后检测细胞存活率。设置6个浓度梯度，分别为0μM、10μM、20μM、 30μM、40μM、50μM。结果显示，吉非替尼对A549细胞的IC50值为24.42μM。
索格列净受试组(图2-a-2)：仅在培养基中添加索格列净对细胞进行处理，孵育1h后检测细胞存活率。设置6个浓度梯度，分别为0μM、10μM、30μM、 40μM、50μM、60μM。结果显示，索格列净对A549细胞的IC50值为73.04μM。
吉非替尼+索格列净联合用药受试组1(图2-a-3)：在培养基中添加索格列净(10μM)和吉非替尼对细胞进行处理，孵育1h后检测细胞存活率。吉非替尼设置6个不同的浓度处理，其中吉非替尼的分别为0μM、10μM、20μM、 30μM、50μM、60μM。结果显示，该受试组对A549细胞的IC50值为17.03μM。
吉非替尼+索格列净联合用药受试组2(图2-a-4)：在培养基中添加索格列净(20μM)和吉非替尼对细胞进行处理，孵育2h后检测细胞存活率。吉非替尼设置5个不同的浓度处理，其中吉非替尼的分别为0μM、10μM、20μM、 30μM、40μM。结果显示，该受试组对A549细胞的IC50值为12.71μM。
吉非替尼+索格列净联合用药受试组3(图2-a-5)：在培养基中添加索格列净(30μM)和吉非替尼对细胞进行处理，孵育1h后检测细胞存活率。吉非替尼设置6个不同的浓度处理，其中吉非替尼的分别为0μM、10μM、20μM、 30μM、40μM、50μM。结果显示，该受试组对A549细胞的IC50值为9.318μM。
该结果显示随着索格列净与吉非替尼组合物的使用，吉非替尼对A549细胞的抑制率显著增强，IC50降低为单药的一半以下，故索格列净安全浓度范围内的联用效果优于各自单药效果。其他细胞系的验证结果参见附图(2f-2j)，值得提出的是索格列净这种联合用药增强靶向EGFR类TKI药效的能力并不限于吉非替尼单一一种药，在图2k，图21中本发明以A549细胞为例进一步验证了EGFR的另外两种抑制剂阿法替尼和厄洛替尼，结果显示安全剂量的索格列净的加入均可有效降低阿法替尼和厄洛替尼的IC50值。
实施例3索格列净与吉非替尼联用逆转肿瘤细胞对吉非替尼的耐药性
1.吉非替尼耐药细胞株的筛选。
在获得实施例1中吉非替尼与索格列净联用显著增强了吉非替尼的有效性后，本发明继续探索二者联用是否可以逆转肿瘤细胞对吉非替尼的耐药性。利用含有浓度逐渐增加的吉非替尼的培养基长期培养A549细胞，可使细胞获得对吉非替尼的耐药性，本发明经过5个月的筛选获得了可在60uM吉非替尼中长期存活的A549吉非替尼耐药细胞株。
2.索格列净与吉非替尼联用逆转肿瘤细胞对吉非替尼的耐药性。
用本发明获得的吉非替尼耐药细胞株加入30uM吉非替尼以及索格列净组合物仍然可以有效杀伤该细胞株。说明索格列净与吉非替尼联用逆转肿瘤细胞对吉非替尼的耐药性，结果如图3所示。
实施例4索格列净与阿帕替尼联用
1、联合用药对肿瘤细胞的抑制作用
在获得实施例1中吉非替尼的有效性后，本发明进而对另一类靶向 VEGFR的TKI类药物阿帕替尼进行验证，根据阿帕替尼和索格列净药物靶点VEGFR和SGLT1/2的组织分布特点，本发明优先选择肝癌细胞系HepG2；结直肠癌细胞系LoVo，HT29，SW620，SW480；宫颈癌HeLa；卵巢癌SKOV3；胃癌HGC27；胆管癌RBE；食管癌KYSE30等进行实验验证。方法为，带细胞生长到80％密度，胰蛋白酶消化细胞，传代并铺于96孔板中，每孔5000个细胞，24小时后更换为含有相应浓度阿帕替尼，索格列净以及阿帕替尼和索格列净组合药物的培养基，48小时候利用MTT法检测各浓度下的吸光值。
实验分为：
对照组：不添加药物，仅适用正常培养基培养细胞；
阿帕替尼受试组：仅在培养基中添加阿帕替尼对细胞进行处理，设置4 个不同的浓度处理，分别为5μM、10μM、20μM、30μM。
阿帕替尼+索格列净联合用药受试组：在培养基中添加索格列净(20μM) 和阿帕替尼对细胞进行处理，设置4个不同的浓度处理，其中阿帕替尼的分别为5μM、10μM、20μM、30μM。
利用各浓度的吸光值除以对照组吸光值算出细胞生长抑制率，结果见图 4-a-1～图4-a-5。图中以阿帕替尼的浓度为横坐标，以细胞生长抑制率为纵坐标，结果显示，单独使用阿帕替尼对肿瘤细胞的抑制效果有限，而两药联用有利于提高对肿瘤的抑制效果。
2、联合用药IC50值测定
2.1、以肝癌细胞系HepG2为例，验证阿帕替尼+索格列净联合用药的IC50 值，实验分为：
阿帕替尼受试组(图4-b-1)：仅在培养基中添加阿帕替尼对细胞进行处理，孵育2h后检测细胞存活率。设置6个浓度梯度，分别为0μM、5μM、10μM、 20μM、30μM、40μM。结果显示，阿帕替尼对HepG2细胞的IC50值为46.02μM。
索格列净受试组(图4-b-2)：仅在培养基中添加索格列净对细胞进行处理，孵育2h后检测细胞存活率。设置7个浓度梯度，分别为0μM、20μM、 30μM、40μM、60μM、80μM、100μM。结果显示，索格列净对HepG2细胞的IC50值为115.7μM。
阿帕替尼+索格列净联合用药受试组1(图4-b-3)：在培养基中添加索格列净(10μM)和阿帕替尼对细胞进行处理，孵育2h后检测细胞存活率。阿帕替尼设置6个不同的浓度处理，其中阿帕替尼的分别为0μM、5μM、10μM、 20μM、30μM、40μM。结果显示，该受试组对HepG2细胞的IC50值为33.3μM。
阿帕替尼+索格列净联合用药受试组2(图4-b-4)：在培养基中添加索格列净(20μM)和阿帕替尼对细胞进行处理，孵育2h后检测细胞存活率。阿帕替尼设置6个不同的浓度处理，其中阿帕替尼的分别为0μM、5μM、10μM、 20μM、30μM、40μM。结果显示，该受试组对HepG2细胞的IC50值为29.69μM。
阿帕替尼+索格列净联合用药受试组3(图4-b-5)：在培养基中添加索格列净(30μM)和阿帕替尼对细胞进行处理，孵育2h后检测细胞存活率。阿帕替尼设置6个不同的浓度处理，其中阿帕替尼的分别为0μM、5μM、10μM、 20μM、30μM、40μM。结果显示，该受试组对HepG2细胞的IC50值为13.13 μM。
阿帕替尼+索格列净联合用药受试组4(图4-b-6)：在培养基中添加索格列净(40μM)和阿帕替尼对细胞进行处理，孵育2h后检测细胞存活率。阿帕替尼设置6个不同的浓度处理，其中阿帕替尼的分别为0μM、5μM、10μM、 20μM、30μM、40μM。结果显示，该受试组对HepG2细胞的IC50值为10.89 μM。
该结果显示随着索格列净与阿帕替尼组合物的使用，阿帕替尼对HepG2 细胞的抑制率显著增强，IC50降低为单药的四分之一以下，故索格列净安全浓度范围内的联用效果优于各自单药效果其他细胞系的验证结果参见附图 (4c-4g)值得提出的是索格列净这种联合用药增强靶向VEGFR类TKI药效的能力并不限于阿帕替尼单一一种药，在图5中本发明以在多种细胞系中进一步验证了VEGFR的另外一种抑制乐伐替尼，结果显示安全剂量的索格列净的加入均可有效增强乐伐替尼对这些细胞系的抑制效果。
实施例5
进一步对TKI类的其他药物进行验证，以证明索格列净联合TKI类药物并非特定的某个或某几个药物。
选用的药物包括：阿昔替尼(图6-1)、尼达尼布(图6-2)、西地尼布(图 6-3)、盐酸帕唑帕尼(图6-4)、苹果酸舒尼替尼(图6-5)、布立尼布(图6-6)、卡博替尼(图6-7)、丙氨酸布立尼布(图6-8)、乐伐替尼(图6-9)、瑞戈非尼(图6-10)、ENMD-2076(图6-11)、替沃扎尼(图6-12)、帕纳替尼(图 6-13)、ENMD-2076酒石酸盐(图6-14)、替拉替尼(图6-15)、花旗松素(图 6-16)、帕唑帕尼(图6-17)、苹果酸卡博替尼(图6-18)、维生素E(图6-19)、瑞格非尼水合物(图6-20)、尼达尼布乙磺酸盐(图6-21)、乐伐替尼甲磺酸盐(图6-22)、西地尼布马来酸盐(图6-23)、4-[(1E)-2-[5-[(1R)-1-(3，5-二氯-4- 吡啶基)乙氧基]-1H-吲唑-3-基]乙烯基]-1H-吡唑-1-乙醇(图6-24)、舒尼替尼 (图6-25)、西特拉瓦替尼(图6-26)、安罗替尼(图6-27)、索拉非尼(图 6-28)、凡德他尼(图6-29)、呋喹替尼(图6-30)、奥莫替尼(图6-31)、奥斯替尼(图6-32)、染料木素(图6-33)、艾维替尼(图6-34)、达克替尼(图 6-35)、奥斯替尼甲磺酸盐(图6-36)、瑞香素(图6-37)、瓦利替尼(图6-38)、 AZD3759(图6-39)、拉泽替尼(图6-40)、那扎替尼(图6-41)、盐酸利多卡因(图6-42)、埃克替尼(图6-43)。
本发明优先选择肝癌细胞系HepG2进行实验验证。方法为，带细胞生长到80％密度，胰蛋白酶消化细胞，传代并铺于96孔板中，每孔5000个细胞， 24小时后更换为含有相应浓度阿帕替尼，索格列净以及阿帕替尼和索格列净组合药物的培养基，48小时候利用MTT法检测各浓度下的吸光值。
实验方法与前相同，孵育时间1h。实验设空白对照组，即正常培养的 HepG2细胞，其中索格列净或TKI药物的浓度皆为0，以空白对照组细胞的存活率为100％，其他给药组中，所采用索格列净浓度皆为30μmol/L，TKI 药物浓度如表2实验分组，结果如附图：
表2给药组实验设计
结果显示，在各药物联用组中，皆表现出对肿瘤细胞良好的抑制作用，其效果显著优于单独给药的对照组。
实施例6
实施例1～4皆为细胞水平的试验，为了进一步验证本发明发现的糖尿病治疗药物索格列净以及其与TKI类抑制剂药物在体内抗肿瘤中具有作用，本发明选择肺癌A549细胞，将细胞利用维通利华公司所生产的Balbc裸鼠进行荷瘤治疗试验。带细胞生长至对数期，收取A549细胞用无血清DMEM培养基重悬为5×107个每毫升，每只小鼠接种100微升共5×106个细胞，19天后测量肿瘤大小并根据大小进行分组，每组肿瘤平均值大小一致。分组后开始给药，索格列净给药剂量根据目前索格列净推荐糖尿病患者每日服用的剂量为200～400毫克，换算为小鼠的剂量为22毫克～44毫克每千克体重的剂量进行给药剂量选择，最终我们选择30毫克每千克的剂量以口服给药的方式进行索格列净的给药。吉非替尼根据既往研究报道的治疗A549移植瘤的给药剂量确定为100毫克每千克的剂量给药。两种药物的给药方式均与目前临床中的口服方式一致采用小鼠灌胃给药。给药周期为每两天一次。每隔两天测量一次肿瘤大小。经过40天给药后，结束试验，剖肿瘤进行称重。
表3索格列净联合吉非替尼对A549细胞荷瘤小鼠疗效总结表
瘤体积平均值
各组与对照组比值
肿瘤生长抑制率
p值
溶剂对照组
1034.278808
索格列净
430.2976498
0.416036417
58.39635826
0.002
吉非替尼
504.8082165
0.488077502
51.19224984
0.0012
索格列净联合吉非替尼
211.0447064
0.204050112
79.59498882
0.0001
如图7-a～图7-b～图7-c所示，单药索格列净和吉非替尼均能抑制肿瘤生长(图7-a～图7-b～图7-c)，索格列净与吉非替尼组合物对肿瘤的抑制作用则比两药单独使用效果更好。根据药物有效性评价，需满足肿瘤生长抑制率大于60％，且p值小于0.05。经计算各组肿瘤生长抑制率以及p值见上表，最终判定索格列净和吉非替尼单药给药均为无效，索格列净与吉非替尼组合物的治疗效果为有效。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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