一种治疗急性肺损伤的苯乙醇苷类化合物及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种治疗急性肺损伤的苯乙醇苷类化合物及其制备方法与应用 (Phenylethanoid glycoside compound for treating acute lung injury and preparation method and application thereof ) 是由 舒尊鹏 陈莹 夏天乙 王毅 丁子禾 刘享峰 张涵 商立峰 于 2021-01-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种治疗急性肺损伤的苯乙醇苷类化合物,所述化合物包括：异麦角甾苷和桃叶珊瑚苷,本发明提供了一种治疗急性肺损伤的苯乙醇苷类化合物及其制备方法与应用,本发明从鹿茸草中提取得到苯乙醇苷类化合物,具有确切的抗急性肺损伤作用,无毒副作用,可以制成各种剂型的抗急性肺损伤药物或作为制备其他抗肺损伤药物的原料药。(The invention discloses a phenylethanoid glycosides compound for treating acute lung injury, which comprises the following components: the invention provides phenylethanoid glycosides for treating acute lung injury, and a preparation method and application thereof, and the phenylethanoid glycosides extracted from antlerpilose grass have definite action of resisting acute lung injury and no toxic or side effect, and can be prepared into various dosage forms of anti-acute lung injury medicaments or used as raw material medicaments for preparing other anti-acute lung injury medicaments.)
技术领域
本发明属于中药技术领域，尤其涉及一种治疗急性肺损伤的苯乙醇苷类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
中医药治疗急性肺损伤有悠久的历史和肯定的临床疗效，研究证实，中医药治疗急性肺损伤具有多靶点、多环节、多途径复合作用的特点。中药鹿茸草Monochasmasheareri Maxim.ex Franch.具有清热凉血、止咳消炎、止血、祛风止痛等功效，为玄参科(Scrophulariaceae)鹿茸草属(Monochasma Maxim.ex Franch.et Sav)多年生的草本植物，又名千叶艾、龙须草、绵毛鹿茸草、白头翁、六月霜等，主要分布与我国江苏、湖北、安徽、江西、浙江宁波、山东烟台、重庆等地，中医临床常用于感冒烦咳、发热、吐血等疾病的治疗。近年来鹿茸草以其显著的生物活性倍受人们的关注，其化学成分及药理作用研究显示，苯乙醇苷类化合物是鹿茸草发挥药效的主要物质基础之一，该类化合物具有抗氧化、抗抑郁、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗菌和免疫调节等多种生物活性。
急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是指由心源性以外的各种肺内外致病因素所导致的急性、进行性呼吸窘迫和顽固性低氧血症为主要表现的临床综合征，急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是其严重阶段，为临床常见的急危重症，病死率高达40％。尽管过去20年的研究表明，一些抗炎物质(糖皮质激素、吸入型一氧化氮或酮康唑)在ALI发病期间会产生抗炎反应，但这些药物均未转化为治疗，且仅限于辅助疾病管理，仍不能明显改善患者生活质量及降低病死率。因此，仍然迫切需要药物选择。
为此，如何提供一种有效、安全的治疗急性肺损伤的苯乙醇苷类化合物是本领域相关人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种治疗急性肺损伤的苯乙醇苷类化合物及其制备方法与应用，本发明从鹿茸草中提取得到苯乙醇苷类化合物(异麦角甾苷、桃叶珊瑚苷)，具有确切的抗急性肺损伤作用，无毒副作用，可以制成各种剂型的抗急性肺损伤药物或作为制备其他抗肺损伤药物的原料药。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种治疗急性肺损伤的苯乙醇苷类化合物，所述化合物含有：异麦角甾苷和桃叶珊瑚苷。
优选地，所述异麦角甾苷和所述桃叶珊瑚苷的质量比为5-1:1。
目前有研究发现，急性肺损伤ALI病人，以急性肺部炎症暴发、顽固性低氧血症等为其主要症状，中性粒细胞、巨噬细胞以及淋巴细胞等分泌的类炎症介质、细胞因子参与了ALI发病过程。在参与ALI炎症的诸多细胞因子中，促炎性因子TNF-α，IL-6和IL-1β是起主要作用的炎症因子，促炎性因子TNF-α，IL-6和IL-1β的表达水平能够代表该病的严重程度。IL-6在ALI急性肺部炎症爆发病人的诱导痰与血清中均被检测到升高，且IL-6水平随着ALI级数的增大而逐渐上升，反映了ALI的炎症严重程度；TNF-α主要分布在气道上皮细胞和巨噬样细胞，机体发生感染时，诱导TNF-α大量释放，导致中性粒细胞和单核巨噬细胞等炎性细胞聚集，血管通透性增加，引起急性肺损伤；细胞凋亡是ALI患者的重要病理机制之一，细胞凋亡过程依赖于Caspase-1的活化，活化的caspase-1是接到IL-1β活化合成的重要信号。IL-1β在炎症瀑布效应与级联效应中起到重要作用，能够放大炎症反应从而导致机体启动“病理性自杀”过程。
本发明从鹿茸草中提取得到苯乙醇苷类化合物，其中代表性成分为异麦角甾苷和桃叶珊瑚苷，同时对其抗急性肺损伤的药效作用及作用机制进行了研究，研究表明鹿茸草苯乙醇苷类提取物有降低肺指数，缓解肺水肿的作用，能有效能降低肺组织中炎症因子TNF-α，IL-1β以及IL-6的含量，减少iNOS及COX-2的表达，降低炎症反应，具有良好的抗急性肺损伤作用，并对肺组织无损伤，具有突出的实质性特点和显著的进步。
本发明提取的异麦角甾苷(Isoacteoside)通过降低磷酸化IκB-α、IKK和NF-κB/p65核转位的水平，降低LPS诱导的NF-κB转录活性，抑制COX-2、iNOS、TNF-α、IL-6和IL-1β的表达；此外，异麦角甾苷还能通过降低磷酸化JNK1/2和p38mapk的水平抑制LPS诱导的AP-1的转录活性，并阻断了LPS诱导的TLR4二聚化，导致MyD88和含tir域的受体诱导干扰素-β(TRIF)招募减少，TGF-β激活的激酶-1(TAK1)磷酸化减少，用异麦角甾苷预处理小鼠能有效地抑制二甲苯所致的耳水肿和LPS诱导的内毒素死亡。本发明提取的桃叶珊瑚苷(aucubin，AU)，具有多种生物活性，如抗纤维化、抗炎、抗氧化和肝保护作用等，桃叶珊瑚苷可减轻LPS诱导的ALI小鼠肺组织病理损伤、肺水肿、炎症细胞浸润，并且显著抑制促炎因子TNF-α和增加抑炎因子IL-10的表达，减轻LPS诱导的小鼠ALI。
优选地，所述化合物的提取原材料为鹿茸草。
鹿茸草为我国传统药方“炎宁颗粒”的主要药材之一，具有清热凉血，止血，抗炎止咳，解毒，杀菌等功效，其有效成分主要为鹿茸草苯乙醇苷类，酚酸类及黄酮类。本发明的鹿茸草提取物对LPS刺激的免疫活化细胞具有抗炎保护作用，对炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6以及COX-2(环氧合酶)、iNOS(诱导型一氧化氮合酶)的表达有明显的抑制作用。
一种上述所述治疗急性肺损伤的苯乙醇苷类化合物的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)称取原材料鹿茸草加水煮沸回流提取1-2h，过滤得滤液，浓缩，得浸膏；
(2)在所述浸膏里加入乙醇，搅拌均匀，静置10-14h，过滤得滤液，浓缩，得煎膏，冷藏备用；
(3)在所述煎膏中加入蒸馏水，搅拌煎膏至完全溶解后洗脱，即得苯乙醇苷类化合物。
优选地，步骤(1)所述回流提取的次数为2次，其中水的加入量均是所述原材料质量的10倍。
优选地，步骤(1)和步骤(2)中所述浸膏和所述煎膏的相对密度均为1.00-1.20。
优选地，步骤(2)所述加入乙醇至含醇量为55-65％。
优选地，步骤(3)中所述溶解后的洗脱液浓度为1.8g/ml。
本发明结合以往相关研究，发现LX-17对苯乙醇苷类的吸附量随着样品质量浓度的增加而增加，并且在原药材质量浓度为1.8g/mL时达到饱和，故最佳上样质量浓度是以原药材质量浓度为1.8g/mL的鹿茸草上样原液上样。
优选地，所述洗脱采用LX-17型大孔树脂，所述洗脱的程序为：去离子水洗脱4-5倍柱体积，再用15％乙醇洗脱4倍柱体积，最后用60％乙醇洗脱5倍柱体积。
本发明结合已有研究，发现用不同体积分数乙醇洗脱，提取目标物集中在15％-70％，考虑到精制目标物质，故采用去离子水洗脱4-5倍柱体积，再用15％乙醇洗脱4倍柱体积，最后用60％乙醇洗脱5倍柱体积。
如上述所述的苯乙醇苷类化合物或者如上述所述制备方法制备出的苯乙醇苷类化合物在抗急性肺损伤药物中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明提供了一种治疗急性肺损伤的苯乙醇苷类化合物及其制备方法与应用，本发明从鹿茸草中提取得到苯乙醇苷类化合物(异麦角甾苷、桃叶珊瑚苷)，具有确切的抗急性肺损伤作用，无毒副作用，可以制成各种剂型的抗急性肺损伤药物或作为制备其他抗肺损伤药物的原料药。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明实验例1肺组织H&E染色结果图；
图2为本发明实验例1肺组织采用酶联免疫反应吸附测定法(ELISA)测定小鼠肺组织中炎症因子TNF-α含量变化柱状图；
图3为本发明实验例1肺组织采用酶联免疫反应吸附测定法(ELISA)测定小鼠肺组织中炎症因子IL-1β含量变化柱状图；
图4为本发明实验例1肺组织采用酶联免疫反应吸附测定法(ELISA)测定小鼠肺组织中炎症因子IL-6含量变化柱状图；
图5为本发明实验例1肺组织采用免疫印迹(Western blot)法对iNOS及COX-2蛋白水平检测结果图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种治疗急性肺损伤的苯乙醇苷类化合物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)电子天平称取原材料鹿茸草500g，注10倍量水用圆底烧瓶回流煎煮，第1次加热至沸腾后继续煎煮1h，将煎液倒入大烧杯内，注10倍量水进行第2次提取，加热沸腾1h后，合并两次煎液，过滤，放置水浴锅上浓缩至相对密度为1.00，得浸膏；
(2)在浸膏里加入乙醇至含醇量为55％，搅拌，静置10h，过滤，旋转蒸发仪回收乙醇，再次浓缩到相对密度为1.00左右，得到煎膏，冷藏备用；
(3)使用时取煎膏用蒸馏水配制成浓度为1.8g/ml的鹿茸草提取物，根据大孔树脂使用说明书对LX-17型树脂进行预处理，称取预处理过LX-17型大孔树脂干质量为1.0g，置于具塞锥形瓶中，加入鹿茸草提取物，吸附150min；洗脱程序为：去离子水洗脱4～5柱体积，再用15％乙醇洗脱4柱体积，最后用60％乙醇洗脱5柱体积，即得苯乙醇苷类化合物。
实施例2
一种治疗急性肺损伤的苯乙醇苷类化合物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)电子天平称取原材料鹿茸草500g，注10倍量水用圆底烧瓶回流煎煮，第1次加热至沸腾后继续煎煮2h，将煎液倒入大烧杯内，注10倍量水进行第2次提取，加热沸腾2h后，合并两次煎液，过滤，放置水浴锅上浓缩至相对密度为1.20，得浸膏；
(2)在浸膏里加入乙醇至含醇量为65％，搅拌，静置14h，过滤，旋转蒸发仪回收乙醇，再次浓缩到相对密度为1.20左右，得到煎膏，冷藏备用；
(3)使用时取煎膏用蒸馏水配制成浓度为1.8g/ml的鹿茸草提取物，根据大孔树脂使用说明书对LX-17型树脂进行预处理，称取预处理过LX-17型大孔树脂干质量为1.0g，置于具塞锥形瓶中，加入鹿茸草提取物，吸附150min；洗脱程序为：去离子水洗脱4～5柱体积，再用15％乙醇洗脱4柱体积，最后用60％乙醇洗脱5柱体积，即得苯乙醇苷类化合物。
实施例3
一种治疗急性肺损伤的苯乙醇苷类化合物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)电子天平称取原材料鹿茸草500g，注10倍量水用圆底烧瓶回流煎煮，第1次加热至沸腾后继续煎煮1.5h，将煎液倒入大烧杯内，注10倍量水进行第2次提取，加热沸腾1h后，合并两次煎液，过滤，放置水浴锅上浓缩至相对密度为1.10，得浸膏；
(2)在浸膏里加入乙醇至含醇量为60％，搅拌，静置12h，过滤，旋转蒸发仪回收乙醇，再次浓缩到相对密度为1.10左右，得到煎膏，冷藏备用；
(3)使用时取煎膏用蒸馏水配制成浓度为1.8g/ml的鹿茸草提取物，根据大孔树脂使用说明书对LX-17型树脂进行预处理，称取预处理过LX-17型大孔树脂干质量为1.0g，置于具塞锥形瓶中，加入鹿茸草提取物，吸附150min；洗脱程序为：去离子水洗脱4～5柱体积，再用15％乙醇洗脱4柱体积，最后用60％乙醇洗脱5柱体积，即得苯乙醇苷类化合物。
实验例1
急性肺损伤模型的建立及分组：
48只BALB/c小鼠随机分为空白组(Control)，模型组(Model)，鹿茸草苯乙醇苷类提取物单给药组(LRC)，LPS+鹿茸草苯乙醇苷类提取物组(LPS+LRC)，共4组，每组12只；自由饮食喂养3d后，空白组及模型组灌胃给予生理盐水0.2mL/20g，鹿茸草苯乙醇苷类提取物组和LPS+鹿茸草苯乙醇苷类提取物组灌胃给予0.2mL/20g(浓度800mg/kg)的苯乙醇苷类提取物(实施例1产品)，连续给药7d，每天1次。最后一次给药6h后，除空白组小鼠和鹿茸草苯乙醇苷类提取物单给药组腹腔注射同体积生理盐水外，其他组小鼠均分别腹腔注射LPS(5mg/kg)(用0.9％氯化钠注射液配制)，6h后称重，麻醉小鼠进行取血随后处死取小鼠完整肺部进行各生化指标测定和组织病理学分析结果见表1和图1-4。
(1)取小鼠完整肺部进行称重并记录，肺部质量除以小鼠体重即得小鼠肺指数，观察并统计各组小鼠肺指数，结果见表1。
表1 LPS对ALI小鼠肺指数的影响(n＝12)
组别
n
肺指数
Control
12
0.0058±0.0005
Model
12
0.0078±0.0005<sup>**</sup>
LRC
12
0.0064±0.0004
LPS+LRC
12
0.0063±0.0006<sup>##</sup>
注：**P<0.01vs Control组；##P<0.01vsModel组；在LPS的刺激下，如表1所示，对照于空白组，模型组中肺指数明显增加(P<0.01)；给药后，与模型组相比，LPS+鹿茸草苯乙醇苷提取物组的肺指数则明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，治疗效果明显，上述结果说明，鹿茸草苯乙醇苷类提取物有降低肺指数，缓解肺水肿的作用。
(2)各组选取3只小鼠的左肺上叶组织，用10％多聚甲醛进行固定，常规切片，HE染色，封固，于光学显微镜观察其组织学形态并拍照存留。
H&E染色结果如图1所示，空白组、鹿茸草苯乙醇苷提取物单给药组小鼠肺泡结构清晰完整，肺泡壁薄，无明显的病变(见图1-Control，LRC)；模型组小鼠肺部肺泡腔缩小，肺泡壁增厚，有大量的渗出及出血，有炎性浸润(见图1-LPS)；LPS+鹿茸草苯乙醇苷提取物组与模型组对比，则表现了显著的的保护作用以及抗炎作用，肺泡腔增大，肺泡壁缩小，无出血或炎性浸润(见图1-LPS+LRC)；上述结果说明鹿茸草苯乙醇苷类提取物具有良好的抗急性肺损伤作用，且鹿茸草苯乙醇苷类提取物单给药对肺组织无损伤。
(3)采集小鼠右肺上叶部分，放于低温冷冻过的生理盐水内，漂去肺组织表面的血液，滤纸轻轻吸干表面水分后进行称重，去除结缔组织，称重50mg组织块放入EP管，加入9倍体积的PBS磷酸缓冲液和小钢珠，10000r/min，研磨研磨成组织匀浆。再3000r/min，4℃离心15min，吸取上清液并保存于﹣80℃冰箱备用。采用酶联免疫反应吸附测定法(ELISA)测定小鼠肺组织中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量(TNF-α、IL-1β及IL-6是几种常见的炎症因子，机体发生炎症反应时，几个因子的含量会随炎症升高，通过检测几种因子的变化，从而确定炎症反应情况)，结果见图2-4：
相较于空白组，模型组的TNF-α、IL-1β及IL-6均显著性升高(P<0.01)，含量几乎均为空白组的两倍，而鹿茸草苯乙醇苷提取物单给药组与空白组比较，TNF-α、IL-6和IL-1β含量均有所减少，但差距不大(TNF-α和IL-1β的P<0.05，IL-6无显著性差异)；相较于模型组，LPS+鹿茸草苯乙醇苷提取物组的TNF-α、IL-6和IL-1β三组因子的含量都呈现了降低的现象，幅度在100-400pg/mL(P<0.01)；上述结果说明鹿茸草苯乙醇苷类能降低肺组织中炎症因子的含量，降低炎症反应。
(4)环氧合酶-2(COX-2)是体内前列腺素(PG)合成过程中的主要限速酶，在正常生理状态下并不表达，但在炎症因子的诱导下，可使花生四烯酸大量转变为PGE2等前列腺素，加剧炎症反应；iNOS由细胞因子刺激炎症反应产生过量的NO而激活，激活后参与各种病理生理现象，在炎症发生中发挥作用；采用免疫印迹(Westernblot)法对iNOS及COX-2蛋白水平进行检测，结果如图5所示。
图5结果显示，在LPS的刺激下，急性肺损伤模型组小鼠肺组织iNOS蛋白含量明显增加(P<0.01)；与急性肺损伤模型组相比较，LPS+鹿茸草苯乙醇苷提取物组小鼠肺组织中iNOS蛋白表达明显降低(P<0.05)；与空白组相比，模型组大鼠肺组织中COX-2蛋白水平显著升高(P<0.01)；与模型组相比，给予鹿茸草苯乙醇苷类提取物治疗，COX-2在小鼠肺组织中表达明显降低，上述结果说明鹿茸草苯乙醇苷类可降低LPS诱导的iNOS蛋白表达，从而减低机体炎症反应的发生。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。