具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

作为本发明的第一个方面，提供了一种应用于双相油佐剂的口蹄疫疫苗的稳定剂，所述的稳定剂包括(或由以下组成)：酸、醇、胺、聚合物、糖、电荷调节剂和余量的水。

其中，酸、醇、胺等用以增强油水(或水油)界面膜的物质组成，用以改善油水分相，同时防止形成颗粒簇。所述酸包括但不局限于酒石酸、枸橼酸、乳酸、软脂酸、肉豆蔻酸、苹果酸、山梨酸、马来酸、琥珀酸、月桂酸、亚油酸、油酸、油酸、蓖麻醇酸、柠檬酸和硬脂酸中的一种或两种以上任意组合。。所述醇包括但不限于辛醇、壬醇、癸醇、十一醇、十二烷醇(月桂醇)、十四烷醇(肉豆蔻醇)、十六烷醇(棕榈醇)、十八烷醇(硬脂醇)、二十醇(花生醇)、二十二醇(山嵛醇)中的一种或两种以上任意组合。所述胺包括但不局限于谷氨酰胺、天冬酰胺、烟酰胺。所述糖包括但不局限于蔗糖、海藻糖、肝素、阿拉伯糖、水苏糖、毛蕊糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖类、纤维二糖、肌糖、棉子糖、菊糖、山梨糖醇、木糖醇、果糖、糊精、环糊精及其衍生物中的一种或两种以上任意组合；其中，环糊精衍生物优选为磺丁基醚-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、葡萄糖基-β-环糊精、或二甲基-β-环糊精。所述电荷调节剂包括但不局限于氯化钠、氯化钾、氯化铵、单乙醇胺氯化物、二乙醇胺氯化物、三乙醇胺、硫酸钠、磷酸钠、磷酸二钠、三磷酸五钠、辛酸钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、柠檬酸钠、醋酸钠、硬脂酸钠、葡萄糖酸锌、硬脂酸镁。所述聚合物包括但不局限于羟乙基纤维素、聚乙二醇、聚乙二醇(40)氢化蓖麻油、葡聚糖、丙烯酸酯及其共聚物、聚维酮、聚乙烯醇；聚丙烯酸钠盐、天然胶及其改性物如海藻酸及其(铵、钙、钾)盐、透明质酸及其钠盐、瓜尔胶、阿拉伯胶、果胶、卡波姆中的一种或两种以上任意组合；优选的，纤维素选自乙基纤维素、羟乙基纤维素，羟甲基纤维素和羧甲基纤维素钠中的一种或两种以上任意组合；天然胶及其改性物优选为海藻酸或其盐。所述聚合物用于调节乳液粘度和增强乳液油水(或水油)界面膜弹性的高分子物质。稳定剂中的糖类物质与上述聚合物及胺、醇、酸类等物质相互协同作用可提高口蹄疫疫苗中有效抗原的稳定性，可使疫苗中有效抗原保存时间延长，生产和使用。

双相油佐剂疫苗所形成的油水乳液是一种热力学不稳定体系，液珠聚结、油水分层是一个自发的过程，为了减少这种不稳定性，稳定剂中的酸、醇、胺等极性物质的存在大大增强油水界面膜强度，增强乳液的稳定性。通常情况下，大部分稳定的乳状液滴都带有电荷，在一个体系中乳液液滴若都带有相同符号的电荷，当液滴相互接近时就相互排斥，从而防止聚结，也能提高了乳液的稳定性，因此以控制界面电荷为手段，可以加入电荷调节剂。在乳液系统中，分散介质粘度越大，则分散相液珠运动的速度越慢，越有利于乳状液的稳定，为调节乳液粘度，可以加入高分子聚合物。稳定剂中的糖类物质与聚合物及胺、醇、酸类等物质的存在可提高口蹄疫疫苗中有效抗原的稳定性。上述因素的协同作用，可使疫苗保存时间延长，生产和使用过程中保持产品质量和免疫效果的稳定。

作为本发明稳定剂的一种优选实施方式，所述酸包括酒石酸、枸橼酸、乳酸、苹果酸、马来酸、山梨酸、琥珀酸、蓖麻醇酸、柠檬酸；所述醇包括癸醇、十一醇、十二烷醇(月桂醇)、十四烷醇(肉豆蔻醇)、十六烷醇(棕榈醇)、十八烷醇(硬脂醇)、二十醇(花生醇)、二十二醇(山嵛醇)；所述胺如谷氨酰胺、天冬酰胺、烟酰胺；所述电荷调节剂包括氯化钠、氯化钾、氯化铵、单乙醇胺氯化物、二乙醇胺氯化物、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三磷酸五钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、葡萄糖酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐；所述聚合物包括羟乙基纤维素、聚乙二醇(PEG)、葡聚糖、丙烯酸酯及其共聚物、聚维酮类、聚乙烯醇、聚丙烯酸及其钠盐、壳聚糖、天然胶及其改性物如海藻酸及其(铵、钙、钾)盐、透明质酸钠；所述糖包括蔗糖、海藻糖、甘露糖类、乳糖、葡萄糖、山梨糖醇、麦芽糖、纤维二糖、棉子糖、糊精、环糊精及其衍生物。

作为本发明稳定剂的一种更优选实施方式，所述酸包括但不局限于酒石酸、乳酸、山梨酸、琥珀酸、亚油酸、硬脂酸、马来酸；所述醇包括癸醇、十一醇、十二醇(月桂醇)、十四醇(肉豆蔻醇)、十六醇(棕榈醇)、二十二醇(山嵛醇)。所述胺包括谷氨酰胺、天冬酰胺、烟酰胺；所述电荷调节剂包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钾、辛酸钠、硬脂酸钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、葡萄糖酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐；所述聚合物包括羟乙基纤维素、聚乙二醇(PEG)、葡聚糖、丙烯酸酯及其共聚物、聚维酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠盐、天然胶及其改性物如海藻酸及其(铵、钙、钾)盐、透明质酸钠；所述糖包括蔗糖、海藻糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖类、山梨糖醇、糊精、环糊精及其衍生物等。

作为本发明稳定剂的一种实施方式，所述稳定剂由以下质量百分比的组分组成：0.1～1％的所述酸、0.1～2％的所述的醇、0.1～2％的所述的胺、0.1～10％的所述电荷调节剂、0.1～15％的所述聚合物、0.1～20％的所述糖、余量的水。

所述稳定剂优选由以下质量百分比的组分组成：0.2～0.6％的所述酸、0.2～0.5％的所述的醇、0.2～1.2％的所述的胺、0.3～1.95％的所述电荷调节剂、0.2～3.2％的所述聚合物、2～12％的所述糖以及余量的水。

本发明的第二方面是提供一种含有稳定剂的双相油佐剂口蹄疫疫苗，其中所述的口蹄疫疫苗包括口蹄疫抗原、双相油佐剂和本发明所提供的稳定剂。本发明所述的口蹄疫抗原可以是口蹄疫A型、O型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型、Asia1型口蹄疫灭活病毒抗原或者是多型的组合抗原。所述的双相油佐剂是市售可以形成水包油包水剂型的油佐剂，可以是矿物油组分佐剂、植物油组分佐剂、动物油组分佐剂或者以上组分的混合组成。

在以往的发明中往往单纯的提供对口蹄疫灭活抗原的保护性，没有从乳液形态和抗原稳定性两者系统考虑。在本发明所采用的技术中，在维持双相乳液稳定条件下，也可对口蹄疫抗原进行保护，可保护口蹄疫有效抗原的完整性、抑制其有效成分146S降解、保证其免疫原性，适合口蹄疫疫苗的长期保存及复杂的田间状况使用，更为重要的是，采用本发明的稳定剂，提高了疫苗中的水相比例，降低疫苗生产中油佐剂的用量，降低了动物应激程度，同时使疫苗注射更为容易。

本发明的稳定剂改进了现用双相油佐剂口蹄疫疫苗安全性，所述稳定剂成分的生物相容性好，更重要的是由于稳定剂的使用可在一定程度上取代一部分双相油佐剂，在提高疫苗乳液稳定性的同时，减少了油佐剂的用量，可有效减少动物的应激反应，降低副反应的发生，更安全。

以下实施例和实验例中所用的实验试剂及耗材，如无特殊说明，均为常规试剂耗材，均可从市场中购得，所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、应用于双相油佐剂的口蹄疫疫苗的稳定剂

本实施例的应用于双相油佐剂的口蹄疫疫苗的稳定剂由下述质量百分比的物质组成：

酸：酒石酸0.2％，山梨酸0.1％，

醇：癸醇0.3％，十二烷醇(月桂醇)0.2％，

胺：谷氨酰胺0.3％，

聚合物：羧甲基纤维素钠1％，海藻酸钾0.5％，

电荷调节剂：氯化钾0.75％，辛酸钠0.5％，

糖：乳糖2％，甘露糖2％，二甲基-β-环糊精5％，

注射用水：87.15％。

实施例2、应用于双相油佐剂的口蹄疫疫苗的稳定剂

本实施例的应用于双相油佐剂的口蹄疫疫苗的稳定剂由下述质量百分比的物质组成：

酸：亚油酸0.2％、琥珀酸0.1％，

醇：十八烷醇(硬脂醇)0.2％，

胺：烟酰胺0.3％、谷氨酰胺0.1％，

聚合物：聚维酮(K30)1％、聚乙二醇(40)氢化蓖麻油1.5％，

电荷调节剂：磷酸氢二钾0.5％、磷酸二氢钾0.04％、氯化钾0.1％、葡萄糖酸锌0.5％，

糖：麦芽糖2％、纤维二糖2％、羟丙基-β-环糊精3％，

注射用水：88.46％，

实施例3、应用于双相油佐剂的口蹄疫疫苗的稳定剂

本实施例的应用于双相油佐剂的口蹄疫疫苗的稳定剂由下述质量百分比的物质组成：

酸：月桂酸0.2％、硬脂酸0.1％、酒石酸0.1％，

醇：二十二醇(山嵛醇)0.2％、十六烷醇(棕榈醇)0.1％，

胺：烟酰胺0.3％、天冬酰胺0.1％，

聚合物：羟甲基淀粉钠0.2％、聚乙二醇(8000)3％，

电荷调节剂：氯化钾0.75％、酒石酸钠1％、辛酸钠0.2％，

糖：麦芽糖5％、磺丁基醚-β-环糊精5％、蔗糖2％，

注射用水：81.75％。

实施例4、应用于双相油佐剂的口蹄疫疫苗的稳定剂

本实施例的应用于双相油佐剂的口蹄疫疫苗的稳定剂由下述质量百分比的物质组成：

酸：油酸0.1％、蓖麻醇酸0.1％，

醇：十二烷醇(月桂醇)0.2％、二十烷醇(花生醇)0.1％，

胺：烟酰胺0.3％，

聚合物：聚乙二醇(6000)1％、透明质酸钠1％，

电荷调节剂：磷酸氢二钠0.5％、磷酸二氢钾0.05％、辛酸钠0.1％，

糖：山梨糖醇1％、麦芽糖基-β-环糊精3％，

注射用水：92.55％。

实施例5、应用于双相油佐剂的口蹄疫疫苗的稳定剂

本实施例的应用于双相油佐剂的口蹄疫疫苗的稳定剂由下述质量百分比的物质组成：

酸：软脂酸0.2％、肉豆蔻酸0.4％，

醇：十八烷醇(硬脂醇)0.1％、二十二烷醇(山嵛醇)0.4％，

胺：烟酰胺0.3％，

聚合物：卡波姆0.1％、聚丙烯酸钠0.2％，

电荷调节剂：三乙醇胺0.1％、醋酸钠0.2％，

糖：甘露糖％、葡萄糖基-β-环糊精3％，

注射用水：94％。

实施例6、应用于双相油佐剂的口蹄疫疫苗的稳定剂

本实施例的应用于双相油佐剂的口蹄疫疫苗的稳定剂由下述质量百分比的物质组成：

酸：月桂酸0.2％、亚油酸0.1％，

醇：十六烷醇(棕榈醇)0.1％、二十烷醇(花生醇)0.4％，

胺：谷氨酰胺0.2％，

聚合物：羟乙基纤维素0.1％、透明质酸钠0.1％，

电荷调节剂：磷酸氢二钾0.4％、磷酸二氢钠0.04％、辛酸钠0.1％，

糖：蔗糖1％、二甲基-β-环糊精1％,

注射用水：96.26％。

实施例7、应用于双相油佐剂的口蹄疫疫苗的稳定剂

本实施例的应用于双相油佐剂的口蹄疫疫苗的稳定剂由下述质量百分比的物质组成：

酸：蓖麻醇酸0.1％，柠檬酸0.2％，

醇：二十二烷醇(山嵛醇)0.4％，

胺：天冬酰胺0.3％，

聚合物：聚乙二醇PEG(8000)0.2％、海藻酸钠0.1％，

电荷调节剂：氯化钠0.1％、柠檬酸钠0.2％，

糖：乳糖1％、海藻糖2％，

注射用水：95.4％。

实施例8、应用于双相油佐剂的口蹄疫疫苗的稳定剂

本实施例的应用于双相油佐剂的口蹄疫疫苗的稳定剂由下述质量百分比的物质组成：

酸：马来酸0.1％、琥珀酸0.2％，

醇：癸醇0.1％、二十二烷醇(山嵛醇)0.3％，

胺：天冬酰胺1％、烟酰胺0.1％、谷氨酰胺0.1％，

聚合物：聚维酮(k90)0.2％、透明质酸0.2％、瓜尔胶0.2％、乙基纤维素2％，

电荷调节剂：氯化铵0.1％、醋酸钠0.1％、硬脂酸镁0.2％，

糖：纤维二糖1％、肌糖0.2％、磺丁基醚-β-环糊精2％,

注射用水：91.9％。

下述以实施例1-8的稳定剂作为发明例，以未添加稳定剂的口蹄疫疫苗为对照例，实验例和对照例中所采用的佐剂和抗原均为相同。

稳定剂的制备

本发明提供了所述的口蹄疫疫苗稳定剂的制备方法，即先将上述实施例1-8中电荷调节剂加入到注射用水中，混合均匀后再在均匀搅拌条件下依次加入酸、醇、胺、多糖、聚合物组分，搅拌分散均匀，采用0.22微米的微孔过滤膜除菌后即得稳定剂。其中，电解质调节剂、盐类、多糖和聚合物各组分加入到注射用水的过程中，边添加边搅拌，搅拌速度控制在为2000转/分以内。混合过程中进行加热，温度控制在40～60℃。

上述制备方法简单可控，有利于大规模工业化生产和产品工艺质量控制。

稳定剂的物理检验指标

依据检验标准对稳定剂进行检验，获得物理指标如表1所示：

表1稳定剂物理检验指标

双相油佐剂口蹄疫疫苗的制备

应用上述稳定剂动物疫苗的制备方法包括如下步骤：

(1)将市售Seppic公司206VG双相油佐剂(批号190424010722)灭菌后加入到疫苗制备罐中，搅拌混合均匀，控制搅拌速度至2000转/分，

(2)保持搅拌条件下，加入一定量的实施例1、2、3、4、5、6、7、8制备的稳定剂。

(3)将符合生产规程要求的灭活口蹄疫O型MYA98/BY/2010株病毒抗原缓慢加入的步骤(2)制备的含有稳定剂的双相油佐剂中，所述口蹄疫抗原量为双相油佐剂及稳定剂的重量之和，控制剪切搅拌均匀完成后，进行标记分装，即得分别含有实施例1-实施例8的稳定剂的口蹄疫疫苗，作为发明例1-发明例8。

同时，按照上述口蹄疫疫苗生产规程，不添加稳定剂，制备常规不含稳定剂的口蹄疫疫苗作为对照例。

口蹄疫疫苗质控检验

1.剂型检测

将上述添加本发明的稳定剂制备的口蹄疫疫苗滴入冷水后呈现云雾状扩散，为水包油包水剂型。

2.离心检测

采用台式离心机，疫苗样品经3500转/分钟离心15分钟，不出油出水、分层、破乳等现象。

3.粒度测定

疫苗经纳米粒度仪测定，乳液粒子大小分布均匀，粒度特征参数D60为500纳米以下。

4.粘度检测

粘度测定采用1毫升吸管(吸管出口内径1.2mm)，吸取25℃疫苗样品1毫升，吸管垂直，经自然流出，流出0.4毫升时用秒表记录时间，连续测试三次，取平均值。数值符合兽药典规程要求。

5.无菌检测

酪蛋白胨10g、肉浸液肉汤培养基1000ml、氯化钠5g、15～20g琼脂，取酪蛋白胨和氯化钠，琼脂加入肉浸液肉汤培养基内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后的pH为7.2±0.2，分装，灭菌。接种疫苗与培养基后经30～35℃培养48小时，观察结果无菌。

口蹄疫疫苗稳定性检验

1.4℃稳定性测试

制备的疫苗在4℃条件下放置12个月稳定有效；疫苗形态稳定，未出现破乳出水现象。含有实施例1-8的稳定剂的口蹄疫疫苗的有效抗原保存率在94.6％和92.6％之间，远高于对照例的73.3％，如下表2所示：

表2.在4℃放置12个月后有效抗原(146S)保存率

2.37℃疫苗加速老化实验

表3.在37℃条件下放置后疫苗的形态

表3为发明例和对照例在37℃加速老化后的形态，从实验中可以观察到，对照例的口蹄疫疫苗2日内破乳出水，而发明例在21日仍保持乳液的稳定。

表4是口蹄疫疫苗在37℃条件加速老化9日、12日、14日、18日、21日采用高压液相色谱仪测定的有效抗原的剩余量，含有实施例1-8稳定剂的口蹄疫疫苗的有效抗原剩余量在9日、12日、15日、18日和21日的各个时间段均显著高于对照例。

表4.在37℃条件下放置后测定疫苗的有效抗原的含量

口蹄疫疫苗的安全检验

用体重350～450g的豚鼠2只，每只腹腔注射发明例组和对照例组疫苗各2ml：用体重18～22g的小白鼠5只，每只皮下注射发明例各组和对照例组疫苗各0.5ml。连续观察7日，观察均无异常临床反应。

用30～40日龄的健康易感仔猪(经乳鼠中和试验测定无口蹄疫中和抗体)2头，各在两侧耳根后分点肌肉注射发明例各组和对照例组疫苗各2头份，逐日连续观察14日。均未出现口蹄疫症状或明显的因疫苗注射引起的异常毒性反应。

1.细胞安全性检测

采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒进行细胞安全性评价测定。采用PK15贴壁细胞，细胞数为100000个/毫升，接种到96孔板中，孔板最外圈只加入DMEM培养基作为空白孔，实验孔和空白对照孔每孔加入100μL细胞液，实验孔每孔分别加入10μL发明例疫苗和对比例疫苗，空白对照孔加入10μL培养基，每组采用5个重复，在二氧化碳培养箱中37度孵育48小时后，吸取出96孔板中的细胞溶液，用PBS每孔加300μL洗涤三次，轻拍干后每孔加入100μL培养基和10μL CCK-8，继续在二氧化碳培养箱中37℃孵育4小时后用酶标仪读取各孔450nm波长的吸光值，依据细胞活力计算公式(细胞活力*(％)＝【A(加样)-A(空白)】/【A(0加样)-A(空白)计算各组数据如下表5所示：

表5.不同疫苗的细胞活力

实验结果表明，发明例各组的细胞活力明显高于对比例，表明本发明提供的稳定剂疫苗具有良好的细胞安全性。

口蹄疫疫苗的效力检验

优选本发明实施例1的配方，以上述制备方法制备的发明例组疫苗，对照例组疫苗和空白组，选用体重40kg左右架子猪，经乳鼠中和试验测定无口蹄疫中和抗体，共三组13头，分别注射发明例组和对照例组各2ml/头，各5头，共10头，设空白组3头。接种后每七日采血分离血清采用口蹄疫抗体液相阻断ELISA检测试剂盒测定抗体水平。免疫的架子猪进行抗体测试，数据如下表6所示。

表6口蹄疫抗体水平测试

通过口蹄疫抗体水平测试表6可以看出，发明例组抗体水平较高且高抗体维持时间较长，能获得长久的保护；对照例组抗体水平较低且高抗体维持时间较短，不能获得长久的保护。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。