阅读说明：本技术 桃果实绿原酸提取和/或检测过程中防降解条件确立的方法 (Method for determining degradation-preventing conditions in extraction and/or detection process of chlorogenic acid in peach fruits ) 是由 严娟 宿子文 徐子媛 蔡志翔 沈志军 张斌斌 马瑞娟 俞明亮 于 2021-01-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种桃果实绿原酸提取和/或检测过程中防降解条件确立的方法,将不同品种的桃果肉样品通过现有技术方法检测,确定该桃品种是绿原酸易降解品种还是不易降解品种；对于绿原酸易降解品种,检测绿原酸易降解品种的桃果肉自然状态下的pH值,以及桃果肉中有机酸的组成和浓度；用测得的桃果肉中有机酸的组成及浓度溶入甲醇中配置提取液,使提取液的pH值接近步骤(2)测得的桃果肉自然状态下的pH值；用步骤(3)的提取液进行提取和/或检测。本发明通过按照比例添加一定浓度范围和比例的苹果酸和柠檬酸这两种桃果实中主要的有机酸,最大限度地模拟了桃果实自然状态下的供酸环境,有效防止绿原酸降解。(The invention discloses a method for determining degradation-resistant conditions in the extraction and/or detection process of chlorogenic acid in peach fruits, which is characterized in that peach pulp samples of different varieties are detected by a method in the prior art to determine whether the peach varieties are easy-degradation varieties or difficult-degradation varieties of chlorogenic acid; for the variety of easily degradable chlorogenic acid, detecting the pH value of the variety of easily degradable chlorogenic acid in the peach pulp in a natural state, and the composition and concentration of organic acid in the peach pulp; dissolving the measured composition and concentration of the organic acid in the peach pulp into methanol to prepare an extracting solution, so that the pH value of the extracting solution is close to the pH value of the peach pulp in the natural state measured in the step (2); and (4) extracting and/or detecting by using the extracting solution in the step (3). According to the invention, two main organic acids, i.e. malic acid and citric acid, are added into the peach fruits according to a certain concentration range and proportion, so that the acid supply environment of the peach fruits in the natural state is simulated to the maximum extent, and the degradation of chlorogenic acid is effectively prevented.)

桃果实绿原酸提取和/或检测过程中防降解条件确立的方法

技术领域

本发明涉及到一种桃果实绿原酸提取和/或检测过程中防降解条件确立的方法。

背景技术

绿原酸，是由咖啡酸与奎尼酸生成的缩酚酸,广泛存在于高等双子叶植物和蕨类植物中。绿原酸类物质具有清除自由基、抗菌消炎、抑制肿瘤、保肝利胆、活血降压等生物活性，已成为天然产物研究领域的热点之一。到目前为止，从植物中发现的绿原酸异构体有如下：绿原酸(3-咖啡酰奎尼酸)、隐绿原酸(4-咖啡酰奎尼酸)、新绿原酸(5-咖啡酰奎尼酸)、异绿原酸A(3，5-二咖啡酰奎尼酸)、异绿原酸B(3，4-二咖啡酰奎尼酸)、异绿原酸C(4，5-二咖啡酰奎尼酸)、莱蓟素(1，3-二咖啡酰奎尼酸)。

在桃果实中，绿原酸是含量最高的酚酸，主要以3-O-咖啡酰奎尼酸(俗称绿原酸)及其异构体5-O咖啡酰奎尼酸(俗称新绿原酸)两种形式存在，还含有微量的4-O咖啡酰奎尼酸(俗称隐绿原酸)。绿原酸是赋予桃果‘医食抗’优良品质的重要功能物质之一。但是由于绿原酸所含的酚羟基易氧化产生降解，烯酸酯键水解和相继分子内脂基迁移而发生异构等问题，从而导致对植物体中绿原酸不能精准定量。基于以上问题，由于研究方法差异，特别是提取时所用调pH的物质以及浓度不同，导致在目前已有的进行桃果实绿原酸的评价研究的结果出入很大，无法对研究结果进行横向和纵向比较。

利用现有检测方法，对150份代表性桃品种资源绿原酸提取检测，发现风味甜浓的，果肉pH值偏高的品种，其绿原酸性质不稳定；而风味酸甜或酸的，果肉pH偏低的品种，其绿原酸性质相较稳定。考虑到不同桃品种果肉中的主要有机酸，即苹果酸与柠檬酸的含量和比例的不同，应该是造成即使提取剂中加入同样浓度的酸度调节物质，依然会导致绿原酸提取和检测环境pH的不同，随之绿原酸稳定性亦不同的重要因素。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种桃果实绿原酸提取和/或检测过程中防降解条件确立的方法，可以有效地防止在桃果实绿原酸提取和检测过程中的降解。

本发明采用的技术方案为：

一种桃果实绿原酸提取和/或检测过程中防降解条件确立的方法，其步骤包括:

(1)将不同品种的桃果肉样品通过现有技术方法检测，确定该桃品种是绿原酸易降解品种还是不易降解品种；

(2)对于绿原酸易降解品种，检测绿原酸易降解品种的桃果肉自然状态下的pH值，以及桃果肉中有机酸的组成和浓度；

(3)用步骤(2)中测得的桃果肉中有机酸的组成及浓度溶入甲醇中配置提取液，使提取液的pH值接近步骤(2)测得的桃果肉自然状态下的pH值；

(4)用步骤(3)的提取液对绿原酸易降解品种进行提取和/或检测，采用步骤(3)的提取液或现有技术均可。

优选的，步骤(2)中桃果肉中有机酸的组成为苹果酸和柠檬酸，苹果酸和柠檬酸的质量比为1-4：1，苹果酸和柠檬酸的总含量为2-8g/L，步骤(3)中提取液的pH值调整在3.9-4.4之间。

优选的，步骤(4)具体为：取桃果肉，匀浆，加入步骤(3)中的提取液；避光超声波提取，离心，取上清；上清液经过滤后进色谱柱，回收和/或绿原酸。

优选的，步骤(4)中桃果肉与提取液的料液比为每g果肉加入2-9ml提取液。

优选的，步骤(4)中超声提取10-30min；离心条件为4℃下10 000r·min-1离心5-10min。

优选的，步骤(4)中过滤采用0.22μm或0.45μm有机滤头。

优选的，步骤(4)桃果肉与提取液的料液比为每g果肉加入6ml提取液。

优选的，步骤(3)色谱条件为：色谱柱：C18反相柱；流动相A：甲醇:磷酸＝1000:1(V/V)；流动相B：水:磷酸＝1000:1(V/V)；流速：1.0ml/min；波长：310-370nm；柱温：25℃；梯度冲洗：0～12min，流动相B从95-61％；12～15min，流动相B从61-95％。

本发明通过按照比例添加一定浓度范围和比例的苹果酸和柠檬酸这两种桃果实中主要的有机酸，最大限度地模拟了桃果实自然状态下的供酸环境，不仅可将不同pH的品种果肉提取和检测的pH保持在桃果肉绿原酸能稳定的3.9～4.4之间，而且还可以最大限度节约药品用量，有效防止绿原酸降解，操作简单，测定结果重复性好，精密度高，可对桃果实绿原酸进行精确评价。本发明不但可以用于绿原酸易降解品种的桃果实绿原酸提取和/或检测，在用于绿原酸不易降解品种的桃果实绿原酸提取和/或检测时，相对现有技术的提取液同样能提高绿原酸收率，防止绿原酸降解。

附图说明

图1现有检测技术方法下，0.1％磷酸-甲醇溶液作提取剂时，‘扬州早甜桃’品种中绿原酸连续2次的HPLC图。

图2现有检测技术方法下，0.1％磷酸-甲醇溶液作提取剂时，‘紫油桃7号’品种中绿原酸连续2次的HPLC图。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

具体实施方式

实施例1

(1)将桃果肉样品通过现有技术方法(发明专利申请号：ZL201310231926.7)进行检测(提取液为0.1％的磷酸-甲醇溶液)1次，24小时后再检测1次，查看含量降解程度，发现存在不易降解和易降解的两大类桃品种，比如‘紫金红1号’，‘金陵黄露’，‘霞晖6号’，‘扬州早甜桃’等为绿原酸易降解的品种；‘紫油桃7号’，‘丽江桃’，‘金旭’，‘野鸡红’等绿原酸不易降解的品种。如图1和图2所示，图1为现有检测技术方法下，0.1％磷酸-甲醇溶液作提取剂时，‘扬州早甜桃’品种中绿原酸连续2次的HPLC图，以峰面积大小变化显示，降解速度快，降解率为25％；图2为现有检测技术方法下，0.1％磷酸-甲醇溶液作提取剂时，‘紫油桃7号’品种中绿原酸连续2次的HPLC图，以峰面积大小变化显示，降解率相对小，为11％。

(2)测定现有技术方法检测中，该不易降解和易降解两类品种的提取环境pH，发现不易降解的品种提取环境pH均在3.9-4.4之间；而易降解的品种提取环境pH均在4.8以上，如表1所示。

表1易降解异构的和不易降解异构的两类品种中的代表性品种在现有技术提取剂环境下的pH示例表

(3)以20份在现有技术下绿原酸易降解的代表性桃品种资源有机酸的测定结果，确定桃果肉中有机酸的浓度范围。结果发现绝大部分品种资源的果实pH范围为3.9-4.4，主要有机酸(包括苹果酸与柠檬酸)含量总量范围为2-8g/L，二者的质量比范围为1-4：1。代表性品种资源的果肉pH、苹果酸与柠檬酸含量总量和二者的质量比如表2所示。

表2代表性桃品种资源果肉pH、苹果酸与柠檬酸含量总量和二者的质量比示例表

序号	品种资源名	<sub>p</sub>H	苹果酸与柠檬酸含量总量g/L	二者的质量比
					1	安龙水蜜	4.12	2.36	1.84
2	雨花露	4.31	2.93	3.70
					3	宣城甜桃	3.95	2.70	3.42
4	紫金红1号	3.98	6.42	3.96
					5	日本86	4.13	5.59	2.57
6	早黄蟠桃	4.07	2.88	2.92
					7	锦春	3.96	4.06	1.65
8	银花露	4.08	2.25	3.54
					9	雨花3号	4.13	2.57	1.08
10	锦香	3.91	4.33	3.99
					11	金霞早油蟠	3.97	4.27	1.88
12	紫金红3号	3.94	7.29	3.72
					13	早魁蜜	4.11	2.23	1.71
14	陈圃蟠桃	4.03	1.94	3.70
					15	金霞油蟠	3.87	3.02	1.74
16	晚湖景	4.22	3.24	2.62
					17	金陵黄露	4.03	3.24	6.72
18	霞晖6号	4.18	4.11	3.65
					19	扬州早甜桃	4.06	3.58	3.88
20	霞晖5号	4.42	2.06	2.94

实施例2

提取液的配比：以甲醇为溶液，加入苹果酸和柠檬酸，设置苹果酸与柠檬酸质量比为1、2、3、4的比例，苹果酸和柠檬酸的总浓度为2，3，4，5，6，7，8g/L的浓度，共28个处理，以体积比0.1％的磷酸-甲醇溶液为对照。以‘扬州早甜桃’以及‘紫油桃7号’为试验材料，将提取剂分别加入各品种果肉中，测定pH。提取方法为：称取桃果肉匀浆0.5g，加入提取剂3mL，避光超声波提取10min，4℃下10 000r·min^-1离心5min。结果如表3所示。

表3易降解的和不易降解的两类品种中的代表性品种在不同苹果酸和柠檬酸浓度及配比的提取液提取果肉环境pH值(料液比为1g：6ml)

实施例3

以‘扬州早甜桃’以及‘紫油桃7号’为试验材料，将提取剂分别加入各品种果肉中，测定pH。提取剂的配比：以甲醇为溶液，加入苹果酸和柠檬酸，设置苹果酸与柠檬酸质量比为1：1的比例，苹果酸和柠檬酸的总浓度为5g/L的浓度，以体积比0.3％或0.4％的磷酸-甲醇溶液为对照，将品种提取环境pH均调整在3.9-4.4之间。提取方法为：称取桃果肉匀浆0.5g，加入提取剂3mL，避光超声波提取10min，4℃下10 000r·min^-1离心5min。结果如表4所示。

表4品种“扬州早甜桃”和‘紫油桃7号’不同提取剂降解对比

取上清液经0.22μm有机滤头过滤后进色谱柱，记录峰面积，24小时后再检测1次，记录峰面积，验证和筛选绿原酸可稳定的苹果酸和柠檬酸配比及浓度。

色谱条件：

色谱柱：C₁₈反相柱；

流动相A：甲醇:磷酸＝1000:1(V/V)；

流动相B：水:磷酸＝1000:1(V/V)；

流速：1.0ml/min；

波长：320nm；

柱温：25℃。